Diskussion
Die beobachtete Produktion einer hohen Proteaseaktivität während der kontinuierlichen Kultur von K. sedentarius erleichterte die Reinigung von zwei Proteasen, P1 und P2, die gegen Azocasein, die β‐Kette von Insulin, Keratin, das aus menschlichem Kallus extrahiert wurde, und unverarbeiteten Kallus aktiv waren. Die allgemeinen Eigenschaften dieser Enzyme, einschließlich Substratbereich, optimaler Temperatur und pH-Wert sowie Empfindlichkeit gegenüber Proteaseinhibitoren, legen nahe, dass sie biochemisch ähnlich sind und wahrscheinlich zur Familie der alkalischen Serinproteasen gehören. Diese Proteasen werden von einer Vielzahl von Mikroorganismen produziert und wirken als Endopeptidasen (Rao et al. 1998).
Ob die Enzyme auch als Keratinasen klassifiziert werden können, bleibt jedoch umstritten. Keratinasen sollten per Definition in der Lage sein, reines natives Keratin zu hydrolysieren. Die Extraktion von Keratin kann jedoch nur durch vorherige Behandlung mit Denaturierungsmitteln erreicht werden, um es von Nicht‐Keratin-Proteinen zu trennen. Mechanische Behandlungen wie Kugelmahlen führen zur Spaltung von Disulfidbindungen, die das Protein anfälliger für proteolytische Verdauung durch Proteasen wie Trypsin und Proteinase K machen, die nicht als Keratinasen klassifiziert werden (Noval und Nickerson 1959). In ähnlicher Weise wurde auch die Verwendung von hitzesterilisierten Substraten in Keratinase‐Assays kritisiert, da Erhitzen Keratindenaturierung verursachen kann.
Obwohl in der vorliegenden Studie fein gemahlener Kallus als Enzymsubstrat verwendet wurde, war Kulturüberstandsflüssigkeit gegen intakte Kallusstücke aktiv. Daher, auch wenn die beiden Proteasen nicht streng Keratinasen sind, bauen sie menschlichen Kallus in vitro ab und es gibt einige Hinweise darauf, dass dies auch in vivo vorkommt (Nordstrom et al. 1987).
Proteasen wurden aufgrund ihrer Aktivität auf reduziertes Keratin auch als Keratinasen klassifiziert, wobei Reduktionsmittel entweder dem Enzym-Assay-Gemisch zugesetzt oder während der Keratinextraktion verwendet wurden. Obwohl die keratinolytische Aktivität einer Reihe von kutanen Bakterien unter Verwendung von ’nativem‘ Keratin als Substrat untersucht wurde, wurde das Reduktionsmittel Dithiothreitol (DTT) in die Testmischung aufgenommen. Wenn beispielsweise die offensichtliche Keratinaseaktivität von Staphylococcus epidermidis in Abwesenheit von DTT untersucht wurde, wurde keine Aktivität nachgewiesen (Mikx und de Jong 1987). In ähnlicher Weise wurde eine Serinprotease aus Candida albicans‐abgebauten Keratinen, die aus dem Stratum corneum menschlicher Sohlen mit 8 mol l−1‐Harnstoff in Tris‐HCl und β-Mercaptoethanol extrahiert worden waren (Hattori et al. 1984). In der vorliegenden Studie hydrolysierten P1 und P2 Keratin, das aus menschlichem Fußkallus mit Harnstoff und β‐Mercaptoethanol extrahiert worden war, aber vor allem auch unbehandelten Kallus abbauen konnte.
Das Stratum corneum und der menschliche Kallus sind eine komplexe und stabile Struktur, deren Hauptbestandteil Keratin ist. Es gibt 30 menschliche Gene für Keratin, von denen 18 auf der Haut exprimiert werden (Fuchs 1995). Eine Zusammenfassung der Keratin-Datenbank hat gezeigt, dass jedes Keratin potenzielle Spaltstellen für die Proteasen aufweist und Asp‐Arg und Gly‐Arg die häufigsten sind. Werden die Keratinfilamente zunächst an diesen Stellen gebrochen, so kann es zu einem allmählichen Abbau dieser kleineren Einheiten an sekundären Spaltstellen kommen, wodurch ein Größenbereich von Peptidfragmenten entsteht, wie die Analyse des Proteasebefalls auf aus menschlichem Kallus extrahierte Keratine zeigt. Die in Fig. 3b zeigen zwei pH‐Optima für die kallusabbauende Aktivität von P2. Eine mögliche Erklärung ist, dass sich in der Probe zwei Enzyme befinden. Dies erscheint unwahrscheinlich, da die verwendete Enzymprobe hochgereinigt war, wie PAGE mit Silberfärbung zeigt (siehe Abb. 1, Spur 6). Die Möglichkeit von zwei kallusabbauenden Enzymen in der gereinigten P2‐Probe mit sehr ähnlichen Mobilitäten auf PAGE kann nicht ausgeschlossen werden. Die gleiche Probe wurde jedoch unter Verwendung der gleichen Puffer mit dem Azocasein-Assay getestet und nur ein pH-Optimum wurde bei pH 10 · 2 nachgewiesen. Eine alternative Erklärung ist, dass die komplexe Kallussubstrat / Enzym-Interaktion bei verschiedenen pH-Werten ein Gleichgewicht zwischen Enzymaktivität und subtilen Konformationsänderungen des Substrats ist, was zu dualen pH-Optima führt.
Diese Untersuchung hat gezeigt, dass K. sedentarius zwei extrazelluläre Proteasen produziert, die eine kallusabbauende Aktivität aufweisen. Grundlegende Informationen über ihre relativen Molekülgrößen, ihre pIs, wurden bestimmt. Herkömmliche enzymkinetische Studien konnten jedoch nicht angesprochen werden, da das natürliche Substrat, das in diesen In-vitro-Experimenten verwendet wurde, eine komplexe Mischung von Polymeren war, die in Wasser unlöslich sind. Die erhöhte Enzymaktivität von P2 in Gegenwart von 800 mmol 1-1-Salz kann für das Überleben des Mikroorganismus auf der menschlichen Haut relevant sein, die eine sich ändernde Salzkonzentration in Abhängigkeit von der ekkrinen Drüsenaktivität aufweist, die durch die Trainingsrate und die Umgebungstemperaturen der Person bestimmt wird. Der/die am Natriumchlorid-Effekt beteiligten Mechanismen wurden nicht untersucht. Es wird vorläufig vorgeschlagen, dass Natriumchlorid entweder die Tertiärstruktur des Enzyms und des Substrats oder beides beeinflussen kann, um den Zugang des enzymaktiven Zentrums zu den spezifischen Spaltstellen des Substrats zu verbessern.
Die einfachste Erklärung der beobachteten Ergebnisse ist, dass es in einem Kulturüberstand von K. sedentarius zwei kallusabbauende Enzyme, Serinproteasen, gibt, die auch menschliches Keratin in Kallus solubilisieren. Es ist möglich, dass K. sedentarius produziert eine Protease, die von einem Gen kodiert wird, und diese autokatalytische oder andere Proteaseaktivität erzeugt zwei Enzyme mit unterschiedlichen Molekulargewichten. Alternativ gibt es zwei Gene, die für zwei unabhängige und eng verwandte Enzyme kodieren. Die letztere Hypothese wird durch eine frühere Studie (Holland et al. 1992). Proben aus kontinuierlicher Kultur von K. sedentarius im Steady State bei unterschiedlichen Verdünnungsraten, die auf PAGE getestet und mit Casein überlagert wurden, zeigten zwei Enzyme, eines konstitutiv und das andere in hohen Konzentrationen bei niedrigen Verdünnungsraten nachgewiesen. Wichtig ist, dass es bei Verdünnungsraten nahe µmax nicht nachgewiesen wurde. Die Bestimmung der N-terminalen Aminosäuresequenz von P1 (21 Reste) und P2 (15 Reste) Polypeptiden zeigte, dass sie völlig unterschiedlich sind. Dieses Ergebnis, zusammen mit den Informationen aus dem kontinuierlichen Kulturexperiment, würde darauf hindeuten, dass die Enzyme unabhängig voneinander kodiert sind.
Die Ergebnisse dieser Untersuchung haben die Hypothese bestätigt, dass spezifische Proteasen von K. sedentarius für den Abbau von Kallus verantwortlich sein können, der für die entsteinte Keratolyse charakteristisch ist. Die bisherigen Erkenntnisse deuten auch darauf hin, dass zwei Proteasen beteiligt sind und dass sie am pH-Wert der Hautstelle aktiv sind, pH 6·3-6·9 (Marshall et al. 1988). Die Interpretation von Ergebnissen aus In-vitro-Experimenten in der In-vivo-Umgebung kann in Frage gestellt werden, obwohl menschlicher Kallus als Substrat verwendet wurde. Idealerweise sollten menschliche Hautbiopsien durchgeführt werden, einschließlich Bereiche normaler und entsteinter Haut. Die Anwesenheit und/oder Abwesenheit der Proteasen könnte dann durch histologische Techniken unter Verwendung monoklonaler Antikörper als Sonden für die Proteasen und K. sedentarius bestimmt werden. Eine ethische Genehmigung würde jedoch nicht für Biopsien von der erforderlichen Stelle, der tragenden Stelle des Fußes, von einer repräsentativen Anzahl von Personen erteilt. Die Beteiligung von K. sedentarius an der entsteinten Keratytose durch einen Mechanismus der Produktion von keratin abbauenden Proteasen ist formal nicht belegt. Es gibt jedoch keine Beweise, die die Hypothesen widerlegen, und ihre Glaubwürdigkeit wurde durch die hier vorgestellten Ergebnisse gestärkt. Es wurden starke In-vitro-Beweise vorgelegt, die K. sedentarius und seine extrazellulären kallus‐abbauenden Enzyme in den Zustand der Keratolyse einbeziehen. Bei normalem pH-Wert der Haut und Oberflächenfeuchtigkeit ist die Produktion und Aktivität dieser Enzyme gering, wobei P1 aktiver ist. Unter Umgebungsbedingungen der Okklusion und bei schlechter Hygiene bewegt sich der pH-Wert der Haut leicht über die Neutralität. Diese Bedingungen begünstigen P2. Beide Enzyme sind höchstwahrscheinlich Spülenzyme, die es K. sedentarius ermöglichen, Kohlenstoff- und Stickstoffquellen, kleine Peptide, die im residenten und unlöslichen komplexen Polymer Keratin eingeschlossen sind, zu erhalten. Gegenwärtig ist die Regulation der Produktion dieser Enzyme unbekannt, ebenso wie ihre relativen Beiträge zum Kallusabbau in vivo. Zusätzlich zu den klinischen Implikationen haben keratinolytische Proteasen einen beträchtlichen Wert für den kommerziellen Sektor, da sie in einer Reihe von industriellen Prozessen nützlich sind, einschließlich des Abbaus von Keratinabfällen aus der Geflügel- und Lederindustrie (Shih 1993; Onifade et al. 1998). Die hohe keratinolytische Aktivität des K. Sedentarius-Proteasen bei relativ niedrigen Temperaturen und pH-Werten im Vergleich zu vielen anderen Proteasen stellen eine potenzielle Anwendung dieser Enzyme in der biotechnologischen Industrie dar.
