Zebrafischhaltung und -bestände: Zebrafische (Danio rerio) wurden nach etablierten Protokollen aufgezogen und inszeniert30.Verwendete transgene Linien waren Tg(kdr-l:ras-mCherry)s91631, Tg(fli1ep: Lifeact-EGFP)zf49532, Tg(fli1:myr-EGFP)ncv233, Tg(fli1:myr-mCherry)ncv134, Tg(fli1:Lifeact-mCherry)ncv733, Tg(fli1:GAL4FF)ubs37, Tg(FH:EGFP-UCHD)ubs1835, TgBAC(pdgfrb:GFP)ncv2236 und Tg(kdrl:EGFP)s84337. Alle Tierversuche wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der RIKEN Kobe Branch (IACUC) genehmigt.
Plasmide und Oligonukleotide: Zebrafisch marcksl1a, marcksl1b und fscn1a wurden mittels PCR aus cDNA von 1 dpf Embryonen mit NEB® PCR Cloning Kit kloniert. Alle in dieser Studie verwendeten Expressionskonstrukte wurden über das Gateway® Cloning und/oder In-Fusion® Cloning unter Verwendung von Plasmiden aus Tol2Kit38 generiert. Plasmide mit mutiertem Marcksl1a und Marcksl1b wurden mit dem Q5® Site-Directed mutagenesis Kit (NEB) erzeugt. shRNA-haltige Vektoren wurden durch Ligation der shRNA-Sequenz zwischen den EcoRI- und PmeI-Stellen stromabwärts des U6-Promotors des modifizierten pEGFP-U6-Vektors39 (ein Geschenk von Zuoshang Xu, Addgene plasmid # 19799) konstruiert. Die Zielsequenz für humanes MARCKSL1 ist 5′-GTGTGAACGGAACAGATGATG-3′. Die verschlüsselte shRNA-Sequenz 5′-GAGTCATGGGTCAGTTATATG-3′ wurde als nicht übereinstimmende Sequenz (unterstrichen) von MARCKSL1 shRNA entworfen. Vektoren, die Maus Marcksl1, Marcksl1-S120A / T148A / T183A (Marcksl1-AAA) und Marcksl1-S120D / T148D / T183D (Marcksl1-DDD) enthalten, die in pEGFP-N1 (Clontech) 10 subkloniert sind, wurden von Eleanor T. Coffey (Universität Turku) hergestellt. Detaillierte Informationen zu Plasmiden und Primern, die in dieser Studie verwendet wurden, finden Sie in den ergänzenden Tabellen 1 bzw. 2.
RNA-Isolierung und cDNA-Synthese: Die Gesamt-RNA wurde unter Verwendung von TRI-Reagenz (Epigenetik) und dem Direct-zolTM RNA MicroPrep Kit (Zymo Research) isoliert und die cDNA wurde unter Verwendung des SuperScript III® First-Strang Synthesesystems (Invitrogen) gemäß den Protokollen des Herstellers synthetisiert.
Mosaikexpression von Konstrukten und transgenen Zebrafischlinien: Tol2-basierte Expressionskonstrukte (5-10 pg) wurden mit 50 pg Tol2-Transposase-mRNA, die aus einem NotI-linearisierten pCS-TP-Vektor (ein Geschenk von Koichi Kawakami, National Institute of Genetics, Japan) transkribiert wurde, unter Verwendung des mMESSAGE mMACHINE SP6-Kits (Invitrogen) in Zebrafischembryonen im Einzellstadium injiziert. Für die Mosaikexpression von Transgenen wurden Embryonen nach Injektionen bei 1 oder 2 dpf analysiert. Um Tg (fli1ep: myl9b-EGFP) rk25- und Tg (fli1ep: EGFP-PLC1δPH) rk26-Linien zu erzeugen, wurden injizierte Embryonen zu Erwachsenen aufgezogen und auf Antikörper untersucht.
Erzeugung von Zebrafisch-marcksl1a- und marcksl1b-Mutanten: marcksl1a-Mutanten wurden durch CRISPR / Cas9-vermittelte Mutagenese erzeugt. Eine Single-Guide-RNA (sgRNA), die auf das zweite Exon abzielt (Ergänzende Fig. 4a) wurde unter Verwendung des klonierungsunabhängigen Protokolls40 erzeugt. Cas9 / sgRNA-RNP-Komplex wurde kurz vor der Injektion assembliert und nach 5 min Inkubation bei Raumtemperatur wurden 200 pg Cas9-Protein (Invitrogen) und 100 pg sgRNA in den Tg (fli1ep: Lifeact-EGFP) zf495; Tg (kdr-l: ras-mCherry) s916-Embryo im Zellstadium co-injiziert. marcksl1b-Mutanten wurden durch TALEN-vermittelte Mutagenese erzeugt. TALEN Targeting das erste Exon von marcksl1b (Ergänzende Abb. 4b) wurde mit dem TAL Effector Nucleotide Targeter 2.0 (https:// tale-nt.cac.cornell.edu/node/add/talen-old ) und wurden über die Golden Gate method41 zusammengestellt. TALEN Repeat variable di-Residues (RVDs) wurden in einen RCIscript-GoldyTALEN Vektor (Addgene) kloniert und capped mRNAs für jeden TALENs wurden in vitro aus SacI-linearisierten Expressionsplasmiden mittels mMESSAGE mMACHINE T3 Kit (Invitrogen) transkribiert. Einzelliges Stadium Tg (fli1ep: Lifeact-EGFP)zf495; Tg (kdr-l:ras-mCherry) s916-Embryonen wurden mit 200 pg RNA (je 100 pg linker und rechter TALEN-mRNAs) mikroinjiziert. F0-Gründer wurden identifiziert, indem TALEN- oder CRISPR / Cas9-injizierte Fische mit Wildtyp-Fischen gekreuzt und die Nachkommen auf Mutationen bei 2 dpf unter Verwendung von T7-Endonuklease I (NEB) -Assay (für TALEN-injizierte Fische) oder Sanger-Sequenzierung (für CRISPR / Cas9-injizierte Fische) untersucht wurden. Kurz gesagt, genomische DNA wurde unter Verwendung der HotSHOT-Methode42 aus Gruppen von fünf Embryonen isoliert und entsprechende genomische Regionen amplifiziert. Mutationen wurden durch direkte Sequenzierung von gereinigten PCR-Produkten bewertet. F1-Nachkommen von positivem F0 wurden bis zum Erwachsenenalter aufgezogen und heterozygote Mutationsträger wurden durch Fin-Clipping und routinemäßige Genotypisierungs-PCR-Analyse unter Verwendung derselben Primer identifiziert.
Während des Screenings wurden sechs mutierte Allele in marcksl1a und fünf mutierte Allele in marcksl1b identifiziert (Ergänzende Abb. 13). Das Allel rk23 besitzt eine 2-nt-Deletion, die zu einem Frameshift nach Aminosäure 51 und einem vorzeitigen Stopcodon an Aminosäure 56 nach 5 Missense-Aminosäuren führt (Ergänzende Abb. 4a, c). Das Allel rk24 besitzt eine 5-nt-Deletion, die zu einem Frameshift nach Aminosäure 13 und einem vorzeitigen Stopcodon an Aminosäure 17 nach 4 Missense-Aminosäuren führt (Ergänzende Abb. 4b, d). Aus diesen Gründen betrachten wir marcksl1ark23 und marcksl1brk24 als Nullallele und konzentrierten unsere Untersuchungen auf die Analysen dieser Mutanten.
Live-Bildgebung: Embryonen wurden in 0,8% Low-Melt-Agarose (Bio-Rad) in E3-Medium mit 0,16 mg / ml Tricain und 0,003% Phenylthioharnstoff montiert. Konfokale Z-Stacks wurden mit einem invertierten Konfokalmikroskop Olympus IX83 / Yokogawa CSU-W1 Spinning Disc aufgenommen, das mit einer Zyla 4.2 CMOS-Kamera (Andor) ausgestattet war. Hellfeldbilder wurden mit dem Mikroskop Leica M205FA aufgenommen. Die Bilder wurden mit Fiji (NIH) verarbeitet.
Laserablation: Laserablationen wurden unter Verwendung eines 405-nm-Lasers (Andor) und eines FRAPPA-Moduls (Andor) durchgeführt, das an einem invertierten Konfokalmikroskop Olympus IX83 / Yokogawa CSU-W1 mit einem Olympus UPLSAPO 60x / NA 1.2-Wassertauchobjektiv angebracht war. Drei aufeinanderfolgende Laserablationen mit einer Verweilzeit von jeweils 1000 µs wurden bei 51% Laserleistung appliziert.
Mikroangiographie: Die Mikroangiographie wurde an Wildtyp-Embryonen marcksl1ark23, marcksl1brk24 und marcksl1ark23;marcksl1brk24 durchgeführt. Insgesamt wurden 2 und 3 dpf-Embryonen 1-2 nL Dextrantetramethylrhodamin oder Dextran-Fluorescein (MW = 2000 kDa, Invitrogen) bei 10 mg/ml injiziert und sofort abgebildet. Konfokale Z-Stacks wurden mit einem Olympus UPLSAPO 10×/NA 0.4 Objektiv aufgenommen. Um den gesamten Embryo abzudecken, wurden mehrere Regionen abgebildet und mit dem Stitching-Plugin in Fiji43 genäht.
Zelltransplantation: Gruppen von 15-25 Spenderzellen aus marcksl1brk23; marcksl1brk24-mutierten Embryonen mit Tg (kdr-l: ras-mCherry) s916–Hintergrund wurden von einer zufälligen Position im Blastoderm gesammelt und in die laterale Randzone im Blastoderm transplantiert44 von Wildtyp-Empfängerembryonen bei 4,5-6 hpf. Extraktion und Transplantation wurden unter Verwendung eines CellTram® 4r-Ölmikroinjektors (Eppendorf) mit einer Borosilikatglaskapillare GC100-15 (Harvard Apparatus Ltd) und einem horizontalen Mikropipettenzieher P-87 (Sutter Instrument Co.) und eine MF-900 Microforge (Narishige), um eine glatte Spitze in Löffelform zu erhalten. Während der Transplantation wurden die Embryonen in Agarose-beschichteten Petrischalen mit 0,5x E2-Puffer aufbewahrt. Bei 2 dpf wurden Embryonen mit mCherry-positiven ISVs für die Mikroangiographie und Bildgebung ausgewählt. Insgesamt wurden acht unabhängige Transplantationen durchgeführt.
Chemische Behandlungen: Latrunculin B (Merck Millipore) wurde in DMSO auf 1 mg/ml gelöst und bei -20°C gelagert. CK666 (SIGMA) wurde in DMSO auf 50 mM gelöst und bei 4°C gelagert. Alle Verbindungen wurden in E3-Puffer auf die gewünschte Konzentration verdünnt.
Transfektion, siRNA-vermittelter Protein-Knockdown und Scherspannungsexperiment: HUVECs (Lonza, C-2519A) wurden in EGM-Medium (Lonza) kultiviert und bis Passage 4 verwendet. Für Plasmid-Transfektionen wurden Zellen in Opti-MEM-Medium (Gibco) bei 5,8 × 104 Zellen/cm2 auf Poly-l-Lysin und Gelatine-beschichteten Deckgläsern ausgesät und mit 2 µg Plasmid unter Verwendung von Lipofectamine 3000 (ThermoFisher Scientific) transfiziert. Zwei Stunden nach der Transfektion wurde das Opti-MEM-Medium auf EGM-Medium ohne Antibiotika umgestellt. Für die siRNA-Transfektion, HUVECs (7.9× 104 Zellen/cm2) wurden mit 20 nM siRNA unter Verwendung des DharmaFECT1-Reagenzes (Dharmacon) transfiziert. Die Transfektion wurde nach 24 h wiederholt. Die Zellen wurden für weitere 24 h vor der Gesamt-RNA-Extraktion oder -fixierung gezüchtet. ON-TARGETplus human MARCKSL1 siRNA-SmartPool (Dharmacon) wurde zum Knockdown von MARCKSL1 verwendet. ON-TARGETplus Non-Target Pool (Dharmacon) wurde als Kontroll-siRNA-Transfektion verwendet. Die Zellen wurden mit 4% PFA/PBS fixiert, mit 0,1% Triton X-100 permeabilisiert und mit 14 µM DAPI zur Kernmarkierung mit 568-Phalloidin (1) gefärbt:1000, ThermoFisher Scientific) zur Visualisierung von F-Aktin und Anti-VE-Cadherin-Antikörper (1:100, Zellsignalisierung), gefolgt von Anti-Kaninchen-Alexa 488-Sekundärantikörper (1:1000, ThermoFisher Scientific) zur Markierung von EC-Übergängen.
Für Scherspannungsexperimente wurden HPAEC (Lonza) bei 1000-1500 Zellen/mm2 auf 1% Gelatine-beschichteter Schale in EGM-2 Medium (Lonza) kultiviert und vor Passage 9 verwendet. Die Zellen wurden mit einer parallelen Plattenapparatur45,46 für 0,5, 1 oder 6 h statischer oder laminarer Scherbeanspruchung bei 15 dyn/cm 2 ausgesetzt. Eine Seite der Strömungskammer bestand aus einer 1%igen gelatinebeschichteten Glasplatte, auf der die kultivierten HPAECs ruhten, und die andere Seite bestand aus einer Polycarbonatplatte. Ihre ebenen Flächen wurden mit einer Teflondichtung 200 µm auseinandergehalten. Die Kammer war mit einem Eingang und einem Ausgang für die Flüssigkeit versehen, und der Eingang war mit einem Silikonschlauch mit einem oberen Reservoir verbunden. Der Ausgang war offen zu einem unteren Reservoir. Die Strömung wurde von einer Rollen-/Schlauchpumpe angetrieben. Das Fluid (EGM-2-Medium) gelangte vom oberen Reservoir durch die Strömungskammer in das untere Reservoir. Die Durchflussrate wurde mit einem am Eingang platzierten Ultraschall-Laufzeitdurchflussmesser (HT107, Transonic Systems) überwacht und durch Ändern des Höhenunterschieds zwischen dem oberen Reservoir und dem Ausgang der Durchflusskammer gesteuert. Die Intensität der auf die EC-Schicht wirkenden Scherspannung (τ, Dyn/cm2) wurde unter Verwendung der Formel τ = 6µQ/a2b berechnet, wobei μ die Viskosität des Perfusats (poise), Q das Durchflussvolumen (ml/s) und a und b die Querschnittsabmessungen des Durchflusswegs (cm) sind. Nach Scherbeanspruchung wurde Gesamt-RNA für qPCR isoliert.
Quantitative Real-time PCR: qPCR wurde durchgeführt unter Verwendung von 1 µL der cDNA, erzeugt aus 150 ng (HPAECs) oder 500 ng (HUVECs) Gesamt-RNA, in einem 10 µL Reaktionsmix enthaltend 1X Luna Universal qPCR Master Mix (NEB) und 400 nM Vorwärts- und Rückwärtsprimer. Die Reaktionen wurden auf dem ABI Prism 7900HT-Instrument in vierfacher Ausfertigung durchgeführt. Die Daten wurden unter Verwendung der RQ Manager−Software (Applied Biosystems) analysiert und die relative Expression der MARCKSL1-mRNA wurde mit der 2-ΔΔCt-Methode47 unter Verwendung von GAPDH als Referenzgen berechnet.
Ganze halterung in situ hybridisierung: Die Whole Mount in situ Hybridisierung wurde nach Standard protocol48 durchgeführt. Embryonen wurden in 4% PFA bei 24, 48 und 72 hpf fixiert und mit 10 µg/ml Proteinase K permeabilisiert. Die Hybridisierung erfolgte in Puffer enthaltend 5% Natriumdextran-sulfat (MW = 500 kDa) bei 70°C über Nacht. Nach Stringency Wash wurden die Proben mit 2% Blocking Reagenz (Roche) in Maleinsäurepuffer blockiert und über Nacht mit Anti-Digoxigenin (DIG) Antikörper, konjugiert mit alkalischer Phosphatase (Roche, 1:5000) bei 4°C inkubiert. Embryonen wurden in 70% Glycerin über Nacht geklärt und mit dem Mikroskop Leica M205FA abgebildet. Die marcksl1a- und marcksl1b-DIG-markierten 1,2 kb langen Ribosonden wurden aus Plasmiden, die die cDNAs voller Länge kodieren, unter Verwendung von MEGAscript SP6- oder T7-Kits (Invitrogen) erzeugt.
Einzelzell-RNA-Sequenzierung: ECs wurden aus transgenen Tg(kdrl:EGFP)s843-Embryonen isoliert. Die Zellsortierung erfolgte mit dem FACSAriaII Cell Sorter (BD Bioscience). Einzelzellsuspension wurde in das 10X Chromium-System geladen und cDNA-Bibliotheken wurden unter Verwendung von Chromium Next GEM Single Cell 3’GEM, Library und Gel Bead Kit v2 (10X Genomics) gemäß Herstellerprotokoll erstellt. Bibliothek wurde auf dem Sequenzer Illumina HiSeq 1500 (Illumina, USA) sequenziert. Cell Ranger v2.1 wurde verwendet, um BCL-Dateien (Raw Base Call), die von Illumina-Sequenzern generiert wurden, in FASTQ-Dateien zu de-multiplexen, die Ausrichtung, Barcode-Zählung und UMI-Zählung durchzuführen. Sequenzierungslesungen wurden auf die Zebrafisch-Genomassemblierung abgebildet (GRCz11, Ensembl Release 92). Weitere Analysen wurden mit Seurat package49 in R Software (https://www.r-project.org) durchgeführt. Die Expressionsmatrizen wurden zunächst gefiltert, indem Gene, die in mindestens 3 Zellen exprimiert wurden, und Zellen, die mindestens 200 Gene exprimierten, für die nachgeschaltete Analyse aufbewahrt wurden. Die Zellen wurden weiter gefiltert, indem Zellen ausgewählt wurden, die einen niedrigen Mitochondriengehalt exprimieren (< 7%). Die Daten wurden dann unter Verwendung der Funktion NormalizedData normalisiert, die die Genexpression für jede Zelle durch die Gesamtexpression normalisiert.
Quantifizierung des Blutgefäßdurchmessers: Live Tg(fli1ep:Lifeact-EGFP)zf495;Tg(kdr-l:ras-mCherry) s916 transgene Wildtyp- oder marcksl1-mutierte Embryonen wurden bei 50-52 hpf abgebildet. Konfokale Z-Stacks wurden mit einem Olympus UPLSAPO 40× /NA1.25 Silikonöl-Immersionsobjektiv aufgenommen. Für DA- und PCV-Durchmesserberechnungen wurden 4-5 Messungen zwischen ISVs entlang der Dotterverlängerung durchgeführt (ISVs Nr. 10-14). Für den ISV-Durchmesser wurden durchschnittlich 6 Messungen entlang jedes ISV (ISVs Nr. 10-14) zwischen dem DA und dem DLAV durchgeführt. Die Messungen wurden mit Fiji (NIH) durchgeführt.
Quantifizierung der EG-Nummer und Proliferation: Zur Zählung der EC-Nummer wurden 52 hpf Wildtyp, marcksl1ark23, marcksl1brk24 oder marcksl1ark23; marcksl1brk24 Embryonen in Tg(kdr-l:ras-mCherry)s916 Hintergrund in 4% PFA fixiert und mit 3 µM DAPI angefärbt. Konfokale Z-Stacks wurden mit einem Olympus UPLSAPO 40x/NA 1.25 Silikonöl Immersionsobjektiv aufgenommen. 9-22) zwischen dem DA und dem DLAV gezählt. Zur Quantifizierung von mitotischen ECs in ISVs, Wildtyp oder marcksl1ark23;marcksl1brk24 Embryonen in Tg (fli1ep:Lifeact-EGFP)zf495;Tg(kdr-l:ras-mCherry) s916 Hintergrund wurden in 4% PFA bei 30, 36 und 48 hpf fixiert, in 1% DMSO/1% Triton X-100 permeabilisiert und mit Anti-Phospho H3 Antikörper (1:250, Merck Millipore) gefolgt von Anti-Kaninchen Alexa 488 Sekundärantikörper (1:1000, ThermoFisher Scientific) und 3 µM DAPI gefärbt. Konfokale Z-Stacks wurden mit einem Olympus UPLSAPO 40x/NA 1.25 Silikonöl Immersionsobjektiv aufgenommen. Mitotische Zellen (pH3-positive Zellen) wurden in ISVs auf beiden Seiten des Embryos gezählt (ISVs Nr. 9-22). ISVs wurden mit mCherry fluorescence visualisiert. Unabhängig von der ISV-Position wurde nur eine pH3-positive Zelle pro ISV nachgewiesen. Während des Zählens betrachteten wir EC in der Telophase als eine einzelne Zelle. Um die Anzahl der EC-Divisionen zu zählen, wurden Wildtyp- oder marcksl1ark23; marcksl1brk24-Embryonen in Tg (fli1ep: Lifeact-EGFP) zf495;Tg (kdr-l: ras-mCherry) s916-Hintergrund mit einem Olympus UPLSAPO 30 × / NA 1.05-Silikonöl-Immersionsobjektiv in Intervallen von 6 Minuten von 24 auf 48 hpf abgebildet. Die Anzahl der Zellteilungen in jedem ISV (ISVs Nr. 11-15) wurde quantifiziert.
Quantifizierung der Actomyosin-Spiegel im apikalen Cortex: Live Tg(fli1:Lifeact-mCherry)ncv7; Tg (fli1ep: EGFP-PLCδ1PH)rk26 und Tg (fli1ep:myl9b-EGFP)rk25; Tg (kdr-l:ras-mCherry)s916 Zebrafischembryonen wurden bei 30-34 hpf mit einem Olympus UPLSAPO 60 × / NA 1.2 Wasser Immersionsobjektiv abgebildet. Die Intensität von Lifeact oder Myl9b entlang des apikalen Kortex und im Zytoplasma wurde mit Fiji gemessen. Das Verhältnis der durchschnittlichen kortikalen zur zytoplasmatischen Intensität wurde berechnet.
In vivo Zellformanalyse: Die Einzelzellmarkierung von ECs in ISVs wurde durch Mosaikexpression von fli1ep: lynEGFP-Plasmid im Wildtyp, marcksl1brk24 oder marcksl1ark23; marcksl1brk24-mutierten Embryonen oder fli1ep erreicht:marcksl1b-EGFP-Plasmid in Wildtyp-Embryonen. Bei 2 dpf wurde eine Mikroangiographie durchgeführt und die Gefäße mit einem Olympus UPLSAPO 60 × / NA 1,2-Wasser-Immersionsobjektiv mit einem optischen Z-Ebenen-Intervall von 0,25 µm abgebildet. Die Zellformanalyse von ECs von ISVs wurde halbautomatisch unter Verwendung eines in Python entwickelten benutzerdefinierten ImageJ-Skripts durchgeführt, Erweiterung der in ref. 50. Die Bilder wurden zunächst grob zugeschnitten, um den Speicherbedarf zu reduzieren, und zusätzliche Metadaten (Gefäßtyp und Embryokennung) wurden ausgefüllt. Ein separates Skript wurde dann ausgeführt, um Zellen um ein Gefäß herum auf eine 2D-Oberfläche zu projizieren und auszupacken. Kurz gesagt, die zugeschnittenen Bilder wurden zuerst basierend auf dem Gefäßtyp gedreht, um die Gefäßachse grob mit der Z-Richtung in einem Bildstapel auszurichten, und der Kanal des fluoreszierenden Mosaikzellenlabels wurde für die Projektion ausgewählt. Um Probleme mit der automatisierten Gefäßsegmentierung im Fluoreszenzkanal des Blutpools zu überwinden, die durch variable fluoreszierende Hintergrundstrukturen und die Perfusion von Dextran-Rhodamin außerhalb des Gefäßes verursacht werden, wurde die Gefäßachse identifiziert, indem die Gefäßposition etwa alle 10 µm manuell durch den Bildstapel definiert und dann eine Catmull-Rom-Spline-Anpassung und Interpolation durchgeführt wurde. Die Daten wurden dann transformiert, um die Schiffsachse in drei Dimensionen zu begradigen. Als nächstes wurde die Position der maximalen Intensität im Projektionskanal entlang von Strahlen in 1 ° -Intervallen um die Gefäßachse identifiziert. Diese Informationen wurden verwendet, um die Fluoreszenzintensität auf eine Ebene zu projizieren, in der Achsen entlang der Gefäßachse und der Winkelposition angeordnet sind, und um die Entfernung von der Gefäßachse an jeder Position auf der projizierten Ebene abzubilden. Die Zelle wurde anhand des projizierten Bildes mit der integrierten Intermodes-Methode von ImageJ identifiziert. Die Bogenlängen, die durch die Seiten jedes Pixels dargestellt werden, das der Zelle zugeordnet ist, wurden dann berechnet (\(l = \ frac {{2\pi}^2}}{{360}}\), wobei r der Abstand zwischen dem zellbezogenen Pixel und der Gefäßachse ist und d die Seite eines Pixels ist) und verwendet wird, um Messungen der Zelloberfläche und des Seitenverhältnisses zu erzeugen.
In vitro Zellformanalyse: Fixierte HUVECs wurden mit einem Olympus UPLSAPO 40×/NA 1.25 Silikonöl Immersionsobjektiv abgebildet. Insgesamt wurden 10-20 Bilder von jedem Deckblatt zur Quantifizierung aufgenommen und halbautomatisch mit einem speziell geschriebenen ImageJ-Skript analysiert. Mehrkanal-Z-Stacks wurden maximal projiziert und der Kanal mit einem GFP-Marker wurde aus Instrumentenmetadaten identifiziert. Imagejs eingebaute Otsu-Schwellwertmethode wurde verwendet, um Zellen von Interesse vom Hintergrund zu trennen; Resultierende binäre Bilder wurden durch Entfernen von Bereichen kleiner als 105 µm2 und Bereichen in Kontakt mit der Grenze des Sichtfeldes gereinigt. Ein anschließender manueller Eingriffsschritt ermöglichte es dem Benutzer, optional interessierende Zellbereiche basierend auf diesem Binärbild zu modifizieren, um fehlerhaft zusammengeführte Zellen zu trennen oder Zellen einzuschließen, die durch die Schwellwertoperation übersehen wurden. Das Skript berechnet dann Flächen und Umfänge für jede Zelle ROI. Zusätzlich wurde für jede Zelle ein ‚Spikiness-Index‘ berechnet, der auf dem Verhältnis des Zellenumfangs zum Umfang der entsprechenden konvexen Hülle basiert, und ein Wert für das Seitenverhältnis der Zelle wurde als das Verhältnis der Haupt- und Nebenachsen einer Ellipse berechnet, die an den Zellenumfang angepasst ist.
Analyse des Membran-Blebbings: Diagramme des Membran-Blebbings wurden halbautomatisch mit einem speziell geschriebenen ImageJ-Skript generiert. Für jede abgebildete Membran wurde zu jedem Zeitpunkt das Verhältnis zwischen der Konturlänge einer Membrankante und dem euklidischen Abstand zwischen den Kantenendpunkten berechnet. Aus den resultierenden Zeitreihen wurden die Leistungsspektraldichten nach Welchs Methode berechnet51. Die Leistungsspektraldichte wurde dann über ein interessierendes Fenster gemittelt, empirisch definiert als die charakteristische Zeit, über die sich Blebs bildeten (0,04–0,06 Hz); Diese gemittelten Werte wurden zwischen experimentellen (Marksl1b-Überexpression) und Kontrollbedingungen verglichen.
Analyse der Aktin- und Myosin-II-Dynamik in Blebs: Diagramme, die die Dynamik von Aktin oder Myosin in Blebbing-Zellen betreffen, wurden halbautomatisch unter Verwendung eines benutzerdefinierten ImageJ-Skripts generiert. Mehrkanal-Zeitraffer-Z-Stacks wurden zunächst maximal entlang der z-Dimension projiziert. Die Software identifizierte dann automatisch die Kante eines Bleb zwischen zwei benutzerdefinierten Ankerpunkten zu allen Zeitpunkten mithilfe der integrierten Otsu-Schwellwertmethode von ImageJ, die auf dem Marksl1b-EGFP-Kanal als Ersatz für die Membrankennzeichnung ausgeführt wird. Im Anschluss an einen Benutzerqualitätskontrollschritt, um eine genaue Identifizierung der Bleb-Kante sicherzustellen, wurde das Aktin / Myosin-Kanal-Intensitätsprofil entlang der Kante zu jedem Zeitpunkt extrahiert und in einem Kymographen gegen die Zeit aufgetragen. Zu jedem Zeitpunkt wurden Intensitätsstatistiken zusammen mit dem Bleb-Bereich extrahiert, der hier als der z-projizierte Bereich definiert ist, der von der Kante und der Linie eingeschlossen ist, die die Punkte auf beiden Seiten des Bleb verbindet, die am weitesten von der Bleb-Spitze entfernt sind, entlang einer Achse senkrecht zu der Linie, die die benutzerdefinierten Ankerpunkte verbindet, und die durchschnittliche Aktin / Myosin-Kanalintensität und der Bleb-Bereich wurden gegen die Zeit aufgetragen.
Quantifizierung der kortikalen Aktindichte und Bündelbreite: Hochauflösende Bilder von Aktin in HUVECs wurden mit einem Plan-APOCHROMAT 63x Ölobjektiv aufgenommen, das auf einem Konfokalmikroskop Zeiss LSM880 montiert war, das mit einem Airyscan- und GaAsP-Detektor ausgestattet war. Ungefähr 3 µm quadratische Regionen innerhalb jeder Beobachtung wurden zufällig ausgewählt und typischerweise 8 optische Abschnitte abgeschnitten, die das kortikale Netzwerk aus diesen Regionen bedeckten. Projizierte Bilder entlang der Z-Achse von zugeschnittenen Stapeln wurden durch maximale Intensitätsprojektion erzeugt und der folgenden Prozedur unterzogen. Da Aktinfilamente innerhalb des Bildes mehrdeutig waren und es unmöglich war, das gesamte Netzwerk zu bewerten, quantifizierten wir die Anzahl der Aktinfilamente innerhalb der begrenzten Regionen als Dichte des Aktinnetzwerks. Dies wurde durchgeführt, indem Scanlinien entlang der X- und Y-Achse alle 4 Pixel eingestellt wurden, und Pixelwerte entlang jeder der Scanlinien wurden dem Savitzky-Golay-filter52 unterzogen, um die Ableitungen erster Ordnung zu berechnen. Aktinfilamente wurden dann identifiziert, indem Nulldurchgangspunkte gefunden wurden, die die Intensitätsspitzen der Scanlinie sind. Die Zählungen für Peaks wurden durch die Pixelzählungen der Scanzeile (Breite oder Höhe des Bildes) geteilt, und die Dichte der Filamente über dem Bild wurde berechnet, indem der Durchschnitt dieser Werte genommen wurde.
Um die Breite des Aktinbündels zu quantifizieren, wurden die zentrischen Linien der Aktinbündel erzeugt, indem Nulldurchgangspunkte von Derivaten erster Ordnung gefunden wurden, die durch den Savitzky-Golay-Filter berechnet wurden, und anschließend der Hilditch-Verdünnungsalgorithmus angewendet wurde. Um eine Möglichkeit auszuschließen, dass Verzweigungs- oder Kreuzungspunkte der Aktinfilamente die Messungen beeinflussen, wurden Verzweigungspunkte innerhalb der skelettierten Linie eliminiert und segmentiert. Die orthogonale Achse zum Gesamtsegment wurde durch Erhalten des Eigenvektors bestimmt, und Fluoreszenzintensitäten wurden entlang der orthogonalen Achse, die den Schwerpunkt des Segments verläuft, mit der Lanczos-5-Interpolationsmethode abgetastet. Dann wurde der Durchmesser eines Filaments durch die Breite des Bereichs bestimmt, der größer oder gleich der Hälfte der Spitzenintensität innerhalb der Linie war, die entlang der orthogonalen Achse zum Gesamtsegment abgetastet wurde.
Statistik: Die statistische Analyse wurde mit Prism 8 (GraphPad Software, Inc.). Stichprobengrößen waren nicht vorgegeben, die Experimente wurden nicht randomisiert, und die Ermittler waren nicht blind für die Zuordnung während der Experimente und Ergebnisbewertung.
Berichtszusammenfassung
Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der Nature Research Reporting Summary, die mit diesem Artikel verknüpft ist.
