Die Deletion von KDM6A, einer Histondemethylase, die mit MLL2 interagiert, bei drei Patienten mit Kabuki-Syndrom | Jumbuck

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Das Kabuki-Syndrom (KS; MIM 147920) wurde erstmals 1981 von Niikawa und Kuroki beschrieben,1,2 und mehr als 400 Fälle wurden in der Literatur berichtet. Die wichtigsten klinischen Merkmale sind ausgeprägte Gesichtsmerkmale, Entwicklungsverzögerung, leichte bis mittelschwere geistige Behinderung, postnatale Wachstumsverzögerung und zusätzliche Merkmale wie Skelettanomalien, Hypodontie und anhaltende fetale Fingerspitzenpolster. Eine vergleichende genomische Hybridisierungsmikroarray-Analyse (CGH) konnte bei 72 KS-Individuen keine wiederkehrende Anomalie nachweisen.3-8 Die Anwendung der Exomsequenzierungsstrategie führte kürzlich zur Identifizierung von MLL2-Mutationen (MIM 602113) als Hauptursache für KS.9 In fünf kürzlich veröffentlichten Serien wurden Mutationen in MLL2 bei 56% -76% der KS-Patienten gefunden.9-13

Da ein signifikanter Anteil der Patienten keine nachweisbare MLL2-Mutation aufweist, postulierten wir die Existenz zusätzlicher Gene, die mit KS assoziiert sind. Auf der Suche nach einer weiteren KS-verursachenden genetischen Mutation wurden zehn Gene, die mit MLL2 interagieren, in 15 MLL2-mutationsnegativen KS-Individuen untersucht, und es wurden keine pathogenen Mutationen identifiziert.11 Ein weiteres Gen, das für ein MLL2-interagierendes Protein kodiert, KDM6A (früher bekannt als UTX; MIM 300128), wurde in 22 MLL2-mutationsnegativen KS-Individuen gescreent, und wiederum wurden keine ursächlichen Mutationen nachgewiesen.13

Mithilfe der Array-CGH-Analyse (Agilent platform 244K) identifizierten wir de novo Xp11.3-Mikrodeletionen bei zwei belgischen MLL2-mutationsnegativen KS-Mädchen (Patienten 1 und 2). Da beide Deletionen de novo waren, sind sie wahrscheinlich pathogen. Beide Deletionen umfassten entweder einen Teil oder alle KDM6A. Darüber hinaus gab es keine KDM6A-Deletionen in einer Kohorte von 411 normalen Kontrollen in einer früheren Studie.14 Die Deletion bei Patient 1 umfasste die KDM6A-Exons 21-29, die für den terminalen Teil der katalytischen Domäne von KDM6A kodieren, und CXorf36, ein Gen, das kürzlich an X-chromosomalem Autismus beteiligt war.15 Bei Patient 2 wurden KDM6A, CXorf36, DUSP21 (MIM 300678) und FUNDC1 (Abbildung 1) vollständig entfernt. Die Funktionen von DUSP21 und FUNDC1 bleiben unbekannt.

Region Xp11.3 Zeigt die Deletionen der Patienten

Region Xp11.3 zeigt die Deletionen aus dem UCSC Genome Browser (GRCh37 / hg19) für Patienten 1, 2 und 3. Die schwarzen vollständigen Spuren stellen die Nummer jedes Patienten dar, und die Nummer jedes Patienten befindet sich über seiner jeweiligen Spur. Die Deletion bei Patient 1 erstreckt sich über 283,5 kb von Basis 44.941.324 bis Basis 45.224.829, die Deletion bei Patient 2 erstreckt sich über 815 kb.7 kb von Basis 44.377.858 bis Basis 45.193.629, und die Deletion von Patient 3 erstreckt sich über 45,4 kb von Basis 44.866.302 bis Basis 44.912.718. Die Gene in dem Bereich sind unterhalb der Deletionsspuren notiert. CNVs in der Datenbank der genomischen Varianten werden in den unteren Zeilen angezeigt. Es gibt keine früheren Berichte über Änderungen der KDM6A-Kopiennummer.

Wir sequenzierten dann KDM6A durch Sanger-Sequenzierung und suchten nach intragenen Deletionen oder Duplikationen mit einem gezielten benutzerdefinierten Agilent Array CGH in einer Kohorte von 22 MLL2-Mutation-negativen KS-Individuen (8 Frauen, 14 Männer). In Übereinstimmung mit den ethischen Standards der Ethikkommission des Institut de Pathologie et de Génétique wurde die Zustimmung der Eltern zur DNA-Analyse aller Teilnehmer dieser Studie und zur Veröffentlichung von Fotos eingeholt. Die in dieser Veröffentlichung diskutierten CGH-Microarray-Daten (ergänzende Daten, online verfügbar) wurden im National Center for Biotechnology Information (NCBI) Gene Expression Omnibus (GEO) 16 hinterlegt und sind unter Accession GSE32567 zugänglich (siehe Abschnitt Accession Numbers).

Es wurden keine Punktmutationen nachgewiesen, aber wir identifizierten eine de novo intragene Deletion (Exons 5-9) in einem italienischen, männlichen KS-Individuum (Patient 3). Wir sequenzierten auch UTY (MIM 400009), das Y-Chromosom-Paralog von KDM6A (siehe unten), und suchten nach intragenen Deletionen oder Duplikationen, wie oben angegeben, aber wir konnten keine Mutationen nachweisen.

Patienten 1 und 3 hatten einen typischen KS-Phänotyp, einschließlich langer palpebraler Fissuren, lateraler Eversion des unteren Augenlids und mittelschwerer bis schwerer geistiger Behinderung (Tabelle 1 und Abbildung 2). Obwohl die Gesichtszüge von Patient 2 nicht so klassisch waren, zeigte sie viele Merkmale dieser Störung, einschließlich lateraler Spärlichkeit der Augenbrauen, langer Wimpern, Strabismus, langer Palpebralfissuren, großer und hervorstehender Ohren, anhaltender fetaler Fingerspitzenpolster, Aortenkoarktation, Areolarfülle im Säuglingsalter und Hirsutismus. Sie zeigte eine leichte Entwicklungsverzögerung und hatte einen normalen IQ-Wert (Verbal Intelligence Quotient), einen schlechten IQ-Wert und hyperaktives Verhalten (Tabelle 1 und Abbildung 2). Wir stellten fest, dass Patienten 1 und 2 lange Diagnosen hatten (Abbildung 3).

Gesichtsausdruck bei Betroffenen

(A) Patient 1.

(B) Patient 2.

(C) Patient 3.

Beachten Sie die langen palpebralen Fissuren bei Patienten 1 und 2 und die gewölbten Augenbrauen bei Patienten 1 (mild) und 3.

Auftreten von Füßen bei Betroffenen

(A) Patient 1.

(B) Patient 2.

Beachten Sie die langen Diagnosen bei beiden Patienten.

Somit sind die KDM6A-Deletionen bei diesen drei Patienten mit einem breiten phänotypischen Spektrum assoziiert, das von typischen KS-Individuen (Patienten 1 und 3) bis zu einem milderen klinischen Erscheinungsbild (Patient 2) reicht. Diese klinische Variabilität ist auch ein Merkmal von Patienten mit MLL2-Mutationen.13 Es sollten jedoch auch die möglichen Auswirkungen der CXorf36-Deletion bei Patient 1 und der CXorf36-, DUSP21- und FUNDC1-Deletion bei Patient 2 auf ihre jeweiligen Phänotypen berücksichtigt werden.

KDM6A (29 Exons) ist eines der X-chromosomalen Gene, das der X-Inaktivierung weitgehend entgeht.17 Es kodiert für ein 1,401-Restprotein, das zwei funktionelle Domänen enthält. Die katalytische Domäne ist eine Histondemethylase, die spezifisch die Demethylierung von mono-, di- und trimethyliertem Lysin katalysiert 27 auf Histon H3 (H3K27).18,19 Diese Demethylierung vermittelt die gewebespezifische Expression verschiedener Gene und ist meist an Entwicklungsprozessen und dem Zellzyklus beteiligt.19-22 Interessanterweise wirken KDM6A und MLL2 zusammen bei der epigenetischen Kontrolle von transkriptionell aktivem Chromatin, indem sie Polycomb-Group (PcG) -Proteinen entgegenwirken.22 Die andere funktionelle Domäne von KDM6A spielt eine Rolle beim Chromatin-Remodeling, indem sie mit dem Switch / Saccharose-nicht fermentierbaren (SWI / SNF) Remodeling-Komplex interagiert, der den Transkriptionsaktivator Brg1.23

Wie MLL2 spielt KDM6A eine Rolle bei der Embryogenese und Entwicklung. Homozygot dUTX (Drosophila KDM6A ortholog) Drosophila Mutanten manifestieren raue Augen, dysmorphe Flügel und Modifikation der Geschlechtskämme.21 Dieser Phänotyp ähnelt dem Trithorax-Phänotyp, was die Vorstellung unterstützt, dass KDM6A der PcG-Repression entgegenwirkt.21 Außerdem UTX-1 (C. elegans KDM6A ortholog) könnte das Entwicklungsschicksal von C. elegans vulva-Vorläuferzellen durch die Transkriptionsregulation von Genen beeinflussen, die für den Retinoblastom (RB) -Proteinkomplex kodieren, der von Würmern für den Menschen konserviert wurde.20 Kdm6a1 ist auch wichtig für die Expression von posterioren HOX-Genen in Zebrafischen.19 Darüber hinaus spielt KDM6A zusammen mit MLL2 eine wichtige Rolle bei der Regulation muskelspezifischer Gene während der Embryogenese.22,24 Schließlich rekrutieren Mitglieder einer anderen wichtigen Entwicklungsgenfamilie (T-Box-Gene, die im Mesoderm bei der Bildung von Herz und Wirbeln wirken) KDM6A, um ihre Zielgene zu aktivieren, was wiederum die Rolle von KDM6A in Entwicklungsprozessen unterstreicht.23 Interessanterweise befinden sich die meisten pathogenen Mutationen für gemeldete T-Box-Gene bei menschlichen Krankheiten in der T-Box-Domäne, die mit KDM6A interagiert.23

KDM6A entgeht der X-Inaktivierung,17 Es wurde jedoch vorgeschlagen, dass bei Mäusen die Kdm6a-Expression des inaktiven X-Chromosoms signifikant geringer ist als die des aktiven X-Chromosoms.Die 25-Kdm6a-Expression ist im adulten Gehirn, in der adulten Leber und in bestimmten sich entwickelnden Hirnregionen bei Frauen höher als bei Männern.25A ist das Paralog von KDM6A auf dem Y-Chromosom.17a hat 84% Aminosäuresequenz Ähnlichkeit mit KDM6A und könnte für die erhöhte Expression von KDM6A bei Frauen kompensieren, trotz der Tatsache, dass die Demethylase-Aktivität noch für diese KDM6A paralog nachgewiesen werden.14,25

Es ist nicht überraschend, ein anderes mit KS assoziiertes Gen auf dem X-Chromosom zu finden, da Berichte über KS-ähnliche Patienten mit kleinen Ring-X (r) -Chromosomen vorliegen.26-34 Darüber hinaus gibt es eine deutliche Überschneidung zwischen den angeborenen Herzfehlern, die bei männlichen KS-Patienten (Aortenkoarktation und andere linksseitige Obstruktionen) und bei Patienten mit Monosomie-X- und r (X) -Chromosomen auftreten.28,35 Kleine r (X) -Chromosomen führen typischerweise zum Turner-Syndrom durch die vollständige Inaktivierung des r (X). Es ist jedoch unklar, warum einige Personen einen KS-ähnlichen Phänotyp entwickeln. Eine unvollständige Inaktivierung des X-Chromosoms und die anschließende Expression normalerweise unterdrückter Gene wurde als Erklärung für den KS-Phänotyp bei einigen r (X) -Patienten vorgeschlagen.32-34 KDM6A wurde bei den drei Patienten gelöscht, die sowohl einen KS-ähnlichen Phänotyp als auch ein r (X) hatten, in dem die Haltepunkte abgebildet worden waren; Dieser Befund stimmt mit der Hypothese überein, dass die KDM6A-Deletion eine wichtige Rolle im KS-ähnlichen Phänotyp spielt, der bei einigen Patienten mit einem r (X) beobachtet wurde.30,32,34 Wir konnten keine Haploinsuffizienz für KDM6A bei Patienten 1 und 2 nachweisen, da die KDM6A-Expression in peripheren Blutlymphozyten sehr niedrig war (Daten nicht gezeigt). Dennoch haben Studien gezeigt, dass zwei Kopien von Kdm6a für die normale Expression in weiblichen Mausembryonen und erwachsenen Mäusen notwendig sind,25 was darauf hindeutet, dass Haploinsuffizienz der pathogene Mechanismus sein könnte. Diese Erklärung würde jedoch nicht die Tatsache erklären, dass 45, X und andere r (X) -Patienten mit einer KDM6A-Deletion nicht alle den Kabuki-Phänotyp entwickeln.

Bei Patienten 1 und 2 sind die Molecular X-Inaktivierungsverhältnisse stark verzerrt und betragen 89:11 bzw. 97:3. Das X-Inaktivierungsprofil wurde über PCR-Amplifikation des CAG-Repeats im Exon 1 des Androgenrezeptorgens vor und nach DNA-Verdau mit HpaII und CfoI bestimmt. Um festzustellen, ob sich die deletierte Kopie von KDM6A auf dem aktiven oder inaktiven X-Chromosom befand, führten wir eine Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierungsanalyse (FISH) mit einer KDM6A-Sonde auf den X-Chromosomen durch, die durch den Einbau von 5-Brom-2′-Desoxyuridin (5-BrdU) differentiell markiert worden waren. Die Ergebnisse zeigten, dass sich die gelöschte Kopie von KDM6A in allen 70 Mitosen, die bei beiden Patienten analysiert wurden, auf dem inaktiven X-Chromosom befand (Abbildung 4). Die Tatsache, dass KDM6A der X-Inaktivierung entweicht17 legt nahe, dass die Phytohämagglutinin (PHA) -stimulierten Lymphozyten, die eine gelöschte Kopie von KDM6A auf dem inaktiven X-Chromosom aufweisen, einen Überlebensvorteil gegenüber Zelllinien haben, die eine gelöschte Kopie von KDM6A auf dem aktiven X-Chromosom aufweisen. Dieser Vorschlag steht im Einklang mit der Hypothese, dass, obwohl KDM6A der X-Inaktivierung entgeht, seine Expression vom inaktiven X-Chromosom geringer ist als vom aktiven X-Chromosom.25

Bild einer Fischstudie an X-Chromosomen, die mit 5-BrdU differentiell markiert sind

Ein Bild einer Fischstudie zeigt X-Chromosomen, die durch den Einbau von 5-BrdU differentiell markiert sind. Das inaktive X-Chromosom (im weißen Kreis) erscheint heller als das aktive X-Chromosom. Xqter subtelomere Sonden hybridisieren an beide X-Chromosomen (blaue Pfeile). Das KDM6A-Signal (weißer Pfeil) fehlt auf dem inaktiven X-Chromosom und ist auf dem aktiven X-Chromosom vorhanden. Für dieses Experiment wurden periphere Blutlymphozyten von Patienten 1 und 2 mit Phytohämagglutinin stimuliert und 72 Stunden lang kultiviert. Um das spät replizierende inaktive X-Chromosom zu identifizieren, behandelten wir die Zellen 5 Stunden vor der Ernte mit 5-BrdU (30 µg / ml). Colcemid wurde dann in einer Konzentration von 0,2 µg / ml zugegeben und 1 Stunde später wurden Metaphasenpräparate über Standardverfahren hergestellt, bei denen in 75 mM KCl gequellt und in 3: 1 Methanol / Essigsäure fixiert wurde. Wir führten eine FISH-Analyse durch, indem wir gleichzeitig eine subtelomere Xqter-Sonde verwendeten, die mit SpectrumOrange (Vysis) markiert war, um die X-Chromosomen anzuzeigen (blauer Pfeil), und RP11-435K1, das mit SpectrumOrange (AmpliTech) markiert war, um zwischen den gelöschten und nicht gelöschten X-Chromosomen zu unterscheiden (weißer Pfeil). Um den Nachweis von inkorporiertem 5-BrdU zu erleichtern, denaturierten wir zelluläre DNA in 2N HCl für 30 min bei 37 °C. 5-BrdU wurde dann mit einem 5-BrdU-spezifischen monoklonalen Antikörper markiert, der an Fluorescein (Roche) konjugiert war (1 µg /ml). Schließlich, Wir haben die DNA durch Auftragen einer Antifade-Lösung gegengefärbt 0.1 µg/ml DAPI.

Die Rolle von UT ist weitgehend unbekannt, und es hat keine In-vitro-Demethylase-Aktivität. Der Befund eines männlichen KS-Individuums (Patient 3) mit einer intragenen Deletion von KDM6A und einem klinischen Schweregrad ähnlich dem von Patient 1 legt nahe, dass ES den Verlust von KDM6A bei männlichen Individuen teilweise kompensieren könnte, wie zuvor in der Literatur vorgeschlagen.25

Für MLL2 wurden somatische homozygote und hemizygote Mutationen in KDM6A bei verschiedenen Krebsarten (multiples Myelom, Plattenepithelkarzinom der Speiseröhre, Nierenzellkarzinom, myeloische Leukämie, Brustkrebs, Darmkrebs und Glioblastom) identifiziert, was darauf hindeutet, dass KDM6A ein tumorsupprimierendes Gen ist.14 Dennoch ist Krebs kein Schlüsselmerkmal von KS, da diese Komplikation nur bei sieben KS-Patienten berichtet wurde36,37 (akute lymphoblastische Leukämie, Burkitt-Lymphom, Fibromyxoid-Sarkom, Synovial-Sarkom und Hepatoblastom wurden einmal berichtet, und Neuroblastom wurde bei zwei KS-Patienten berichtet).35,36 Wenn der Verlust beider Allele ausreicht, um Krebs zu verursachen, würde man erwarten, dass Krebs bei KS häufiger auftritt, beispielsweise beim Retinoblastom (MIM 180200) oder beim Wilms-Tumor (MIM 194070). Dies deutet entweder darauf hin, dass der Verlust des zweiten Allels in MLL2, KDM6A oder UTY notwendig, aber nicht ausreichend für die Krebsentstehung ist, oder dass diese Komplikation nicht erkannt wird, was die Bedeutung von naturhistorischen Studien bei seltenen Syndromen zeigt.37

Die folgenden Histonmethylasen und Histondemethylasen wurden mit anderen multiplen Anomaliesyndromen in Verbindung gebracht: EHMT1 (MIM 607001; Kleefstra-Syndrom), SETBP1 (MIM 611060; Schinzel-Giedion-Syndrom), JARID1C (MIM 314690; Claes-Jensen-Typ, X-chromosomales Syndrom mit geistiger Behinderung), PHF8 (MIM 300560; Siderius-Typ, X-gebundenes mentales Retardierungssyndrom) und MLL2 bei KS. Die Identifizierung von KDM6A-pathogenen Mutationen bei KS-Patienten erweitert die Rolle von Histonmodifikationsfaktoren bei geistiger Behinderung und angeborener Fehlbildung.

Abschließend berichten wir über KDM6A-Mutationen als Ursache von KS bei einem Mann und zwei Frauen. Unsere Ergebnisse bestätigen sowohl die genetische Heterogenität von KS als auch einen Locus auf dem X-Chromosom, wie bereits vorgeschlagen. Da einige KS-Patienten negativ für die MLL2-, KDM6A- und DNA-Sequenzierung waren und während des Screenings keine Deletionen oder Duplikationen zeigten, ist es wahrscheinlich, dass andere KS-assoziierte Gene noch entdeckt werden müssen.