Reinigung und Charakterisierung von Asparaginase aus Phaseolus vulgaris Samen

Zusammenfassung

L-Asparaginase aus Bakterien wurde bei der Behandlung von akuter lymphoblastischer Leukämie verwendet. Ziel dieser Studie war es, L-Asparaginase aus Phaseolus vulgaris-Samen anstelle von mikrobiellen Quellen zu reinigen und zu charakterisieren. L-Asparaginase wurde bis zur scheinbaren Homogenität gereinigt. Das Enzym hat eine Molekülmasse von 79 kDa. Die gereinigte Asparaginase hatte eine sehr geringe Aktivität gegenüber einer Reihe von Asparagin- und Glutaminanaloga. L-Asparaginase war frei von Glutaminase-Aktivität. Die kinetischen Parameter Km und Vmax des gereinigten Enzyms betrugen 6,72 mM bzw. 0,16 µM. Das Enzym hatte einen optimalen pH-Wert von 8,0. Das Enzym zeigte eine hohe Stabilität bei alkalischem pH-Wert (pH 7,5–9,0), wenn es bis zu 24 h inkubiert wurde. L-Asparaginase hatte das gleiche Temperaturoptimum und die gleiche thermische Stabilität bei 37 ° C. K + konnte die Aktivität von Asparaginase im Vergleich zu anderen getesteten Metallen um 150% stark erhöhen. Zusammenfassend zeigte L-Asparaginase keine Glutaminaseaktivität und eine gute Stabilität über einen weiten Bereich von physiologischen Bedingungen und könnte daher als potenzieller Kandidat für die Behandlung von akuter lymphoblastischer Leukämie verwendet werden.

1. Einleitung

L-Asparaginase (L-Asparaginamidohydrolase E.C.3.5.1.1) wird bei der Behandlung von akuter lymphoblastischer Leukämie und Non-Hodgkin-Lymphom verwendet. Die Verwendung von L-Asparaginase in der Krebstherapie beruht auf seiner Fähigkeit, L-Asparagin, eine für das Wachstum von Lymphoblasten essentielle Aminosäure, in Ammoniak und L-Asparaginsäure im Serum und in der Zerebrospinalflüssigkeit zu spalten, da Lymphoblasten nicht in der Lage sind, endogenes L-Asparagin zu produzieren, was zum Tod dieser Zellen führt . Die meisten Krebszellen sind zum Überleben auf eine exogene Quelle dieser Aminosäure angewiesen. Normale Zellen sind jedoch in der Lage, L-Asparagin zu synthetisieren, und sind daher weniger von seiner schnellen Erschöpfung aufgrund der Behandlung mit diesem Enzym betroffen. L-Asparaginase kann auch verwendet werden, um die Bildung von Acrylamid in gebratenen und im Ofen gekochten Lebensmitteln, insbesondere in Kartoffelchips, zu reduzieren . Die Bildung von Acrylamid wurde der Reaktion von freiem Asparagin und reduzierenden Zuckern zugeschrieben . Die Abreicherung von Asparagin durch Asparaginase verhinderte die Acrylamidbildung .

L-Asparaginase ist unter Pflanzen, Tieren und Mikroorganismen weit verbreitet . In der Pflanze wurde dieses Enzym erstmals in den sich entwickelnden Samen von Lupinus albus nachgewiesen . Asparaginase wurde auch aus dem Testa von reifenden Samen von L. polyphyllus gereinigt. Zwei Formen des Enzyms wurden identifiziert. Eine K + -unabhängige Form findet sich in L. arboreus und L. polyphyllus und eine K + -abhängige Form findet sich in Pisum sativum und mehreren anderen Hülsenfruchtarten, einschließlich anderer Lupinusarten . Die Arbeit mit Antikörpern gegen die K + -unabhängige Form von L. polyphyllus ergab keine Kreuzreaktion mit Erbsenasparaginase oder einer Reihe von Lupinusarten, die das K + -abhängige Enzym enthielten, was darauf hindeutet, dass die beiden Formen der Asparaginase immunologisch verschieden sind .

Über die Verwendung von pflanzlicher Asparaginase bei der Behandlung von akuter lymphoblastischer Leukämie wurde nur sehr wenig berichtet . Daher bestand das Hauptziel dieser Studie darin, L-Asparaginase aus Phaseolus vulgaris-Samen, die frei von L-Glutaminase sind, anstelle von L-Asparaginase aus mikrobiellen Quellen zu reinigen und zu charakterisieren, die als Krebsmedikament verwendet wird und aufgrund ihrer immunologischen Reaktionen Nebenwirkungen verursacht.

2. Material und Methoden

2.1. Pflanzenmaterial

Reife Samen aus Phaseolus vulgaris cv. Giza 6 wurden vom Agricultural Research Centre, Kairo, Ägypten, erhalten.

2.2. Reinigung von Asparaginase

2.2.1. Rohextrakt

Der Rohextrakt der Asparaginase wurde durch Homogenisierung von 50 g Samen aus Phaseolus vulgaris cv hergestellt. Giza 6 in 20 mM Tris-HCl-Puffer, pH 8,0 enthaltend 10% Glycerin, 50 mM KCl, 12,5 mM β-Mercaptoethanol und 1 mM PMSF. Das Homogenat wurde bei 10.000 ×g zentrifugiert und der Überstand als Rohextrakt bezeichnet. Der Rohextrakt wurde durch Dialyse gegen feste Saccharose eingeengt.

2.2.2. DEAE-Sepharose-Säule

Konzentrierter Rohextrakt wurde auf eine DEAE-Sepharose-Säule (15 × 1,6 cm i.d.) aufgebracht, die zuvor mit 20 mM Tris-HCl-Puffer, pH 8,0, äquilibriert wurde. Das Enzym wurde durch verschiedene Konzentrationen von KCl eluiert, die in demselben Puffer mit einer Flussrate von 60 ml / h hergestellt wurden, und es wurden 3 ml-Fraktionen gesammelt. Drei Proteinpeaks wurden mit Asparaginaseaktivität gemäß der Elutionsreihenfolge eluiert (Asparaginasen I, II und III).

2.2.3. Sephacryl S-200

Asparaginase I mit höchster Aktivität wurde auf eine Sephacryl S-200 Säule (90 ×0.6 cm i.d.), der zuvor mit dem gleichen Puffer bei einer Flussrate von 30 ml/h äquilibriert wurde und 3 ml Fraktionen gesammelt wurden.

2.3. Asparaginase-Assay

Die Aktivität von L-Asparaginase wurde nach modifizierter Methode von Wriston gemessen. Die L-Asparaginase katalysiert L-Asparagin zu L-Asparaginsäure und Ammoniak und letztere reagieren mit Nesslers Reagenz zu einem orangefarbenen Produkt. Das Enzym-Assay-Gemisch bestand aus 900 µL frisch hergestelltem L-Asparagin (20 mM) in 50 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8,0), 50 mM KCl und 100 µL Rohextrakt des Enzyms. Das Reaktionsgemisch wurde 30 min bei 37°C inkubiert und die Reaktion durch Zugabe von 100 µL 15%iger Trichloressigsäure gestoppt. Das Reaktionsgemisch wurde bei 10.000 ×g für 5 min bei 4°C zentrifugiert, um die Ausfällungen zu entfernen. Der im Überstand freigesetzte Ammoniak wurde kolorimetrisch bestimmt, indem 100 µL Nessler-Reagenz in die Probe mit 100 µL Überstand und 800 µL destilliertem Wasser gegeben wurden. Der Inhalt in der Probe wurde vortext und 10 min bei Raumtemperatur inkubiert und OD bei 425 nm gemessen. Der bei der Reaktion entstehende Ammoniak wurde anhand der mit Ammoniumsulfat erhaltenen Standardkurve bestimmt. Eine Einheit der L-Asparaginase-Aktivität ist definiert als die Menge des Enzyms, die 1 µmol Ammoniak pro min bei 37°C freisetzt.

2.4. Proteinbestimmung

Protein wurde nach der Methode von Bradford mit Rinderserumalbumin als Standard quantifiziert.

2.5. Molekulargewichtsbestimmung

Das native Molekulargewicht wurde mit Sephacryl S-200 bestimmt. Die Säule wurde mit Cytochrom C (12.400), Carboanhydrase (29.000), Rinderserumalbumin (67.000), Alkoholdehydrogenase (150.000) und β-Amylase (200.000) kalibriert. Dextranblau (2.000.000) wurde zur Bestimmung des Hohlraumvolumens (Vo) verwendet. Das Molekulargewicht der Untereinheit wurde durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese geschätzt. SDS-denaturierte Phosphorylase b (94.000), Rinderserumalbumin (67.000), Ovalbumin (43.000), Carboanhydrase (30.000), Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor (20.000) und α-Lactalbumin (14.200) wurden für die Kalibrierungskurve verwendet.

2.6. Charakterisierung von Asparaginase

2.6.1. Substratspezifität

Die Asparaginaseaktivität wurde mit einigen Analoga von L-Asparagin bestimmt. Die relative Aktivität wurde ausgedrückt als prozentuales Verhältnis der Enzymaktivität, die gegen verschiedene Strukturanaloga von L-Asparagin bestimmt wurde, zur Enzymaktivität mit L-Asparagin.

2.6.2. Kinetische Parameter

Die Werte der Michaelis-Konstanten (Km) und der maximalen Geschwindigkeit (Vmax) wurden mit L-Asparagin als Substrat im Bereich von 2-20 mM bestimmt. Kinetische Parameter wurden aus Lineweaver-Burk-Plot bestimmt.

2.6.3. Wirkung von pH

Der optimale pH-Wert für die Asparaginaseaktivität wurde durch Bestimmung der Aktivität bei verschiedenen pH-Werten bestimmt. Die pH–Stabilität wurde durch Inkubation des Enzyms bei einem pH-Wert von 5,0-9,0 für 24 h bei 4°C in Abwesenheit von Substrat getestet und die Restaktivität wurde unter den Standard-Assaybedingungen bestimmt.

2.6.4. Einfluss der Temperatur

Die optimale Temperatur für die Asparaginaseaktivität wurde bestimmt, indem das Enzym bei verschiedenen Temperaturen untersucht wurde. Die Wärmestabilität wurde gemessen, indem das Enzym allein 1 h bei verschiedenen Temperaturen inkubiert wurde. Nach der Wärmebehandlung wurde die Enzymlösung abgekühlt und die Restaktivität nach Zugabe der Substrate bestimmt.

2.6.5. Metallioneneffekt

Die Wirkungen verschiedener Metallionen auf die Enzymaktivität wurden bestimmt, indem das Enzym allein mit 10 mM Metallionen vor Zugabe des Substrats für 15 min vorinkubiert wurde. Die Aktivität, die in Abwesenheit von Metallionen untersucht wurde, wurde als 100% angenommen.

3. Ergebnisse und Diskussion

Die Ergebnisse von Reinigungsschritten von Asparaginase aus P. vulgaris sind in Tabelle 1 zusammengefasst. Das Elutionsprofil der Chromatographie an der DEAE-Sepharose-Säule (Abbildung 1) zeigte drei Peaks von Proteinen mit Asparaginaseaktivität. Peak eins mit der höchsten Asparaginase-Aktivität wurde auf eine Sephacryl S-200-Säule aufgebracht (Abbildung 2). L-Asparaginase I wurde 21,7-fach mit einer spezifischen Aktivität von 846 Einheiten/mg Protein gereinigt. Die Asparaginase I erwies sich nach der Sephacryl S-200-Säule als rein, wie durch SDS-PAGE beurteilt (Abbildung 3). Das Molekulargewicht der Asparaginase I nach Sephacryl S-200 und SDS-PAGE-Verfahren ergab einen Wert von 79 kDa als Monomeruntereinheit. Dieser Befund stimmt mit den Molekulargewichten für Asparaginasen aus Vigna unguiculata (70 kDa) und Lupinus polyphyllus (75 kDa) überein. Für Asparaginase aus Erbsenblättern wurde ein mittleres Molekulargewicht von 58 kDa nachgewiesen. Für bakterielle Asparaginasen lag das Molekulargewicht bei Tetramer-Untereinheiten zwischen 140 und 160 kDa. Für Streptobacillus sp. KK2S4 Asparaginase .

Abbildung 1

Ein typisches Elutionsprofil für die Chromatographie von Asparaginase aus P. vulgaris an DEAE-Sepharose-Säule (15 × 1,6 cm i.d.) zuvor mit 20 mM Tris-HCl-Puffer, pH 8,0 bei einer Flussrate von 60 mL/h und 3 ml Fraktionen äquilibriert.

Abbildung 2

Gelfiltration von Asparaginase I aus DEAE-Sepharose-Fraktion auf Sephacryl S-200 Säule (90 × 1,6 cm i.d.). Die Säule wurde mit 20 mM Tris-HCl-Puffer, pH 8,0 bei einer Flussrate von 30 mL/h und 3 ml Fraktionen äquilibriert.

Abbildung 3

SDS-PAGE zur Homogenitäts- und Molekulargewichtsbestimmung von Asparaginase I aus Phaseolus vulgaris. (1) Proteinmarker; (2) Sephacryl S-200 Asparaginase I.

Die Substratspezifität von Asparaginase I wurde unter Verwendung einer Reihe von Asparagin- und Glutaminanaloga untersucht (Tabelle 2). Die Aktivität mit dem L-Asparagin wurde als 100%ige Aktivität angesehen. DL-Asparagin zeigte 30% der Enzymaktivität, wobei DL-Asparagin aus a 1 besteht : 1 racemische Mischung. D-Asparagin, L-Asparaginsäure und L-Glutaminsäure-Analoga hatten eine sehr geringe Aktivität gegenüber Asparaginase I. In Gegenwart von L-Glutamin wurde keine Aktivität nachgewiesen. Daher ist die Asparaginase I aus P. vulgaris frei von Glutaminase. Die Kontamination von Asparaginase mit Glutaminase-Aktivität verursachte Nebenwirkungen im Verlauf der Krebstherapie . Die L. arboreus Asparaginase hydrolysierte nur L-Asparagin und DL-Aspartylhydroxamat . Die V. unguiculata-Asparaginase war spezifisch für L-Asparagin, hydrolysierte D-Asparagin nicht und war nicht spezifisch für L-Glutamin .

Die kinetischen Parameter Km und Vmax des gereinigten Enzyms betrugen 6,72 mm Asparagin bzw. 0,16 µM Ammoniak/ml (Abbildung 4). Ähnliche Km-Werte von 6,6 und 7,0 mM wurden für Asparaginasen aus L. arboreus bzw. L. angustifolius bestimmt. Asparaginase aus Lupinussamen hat einen hohen Km für Asparagin (12,2 mM) . Niedrige Km (1.2 mM) wurde für Asparaginase aus V. unguiculata bestimmt. Für Bakterien lagen die Km-Werte für L-Asparaginase aus Escherichia coli und Erwinia carotovora bei 3,5 bzw. 7,14 mM .

Abbildung 4

Lineweaver-Burk-Diagramm zur Bestimmung von Asparaginase I aus P. vulgaris-Geschwindigkeiten zu verschiedenen L-Asparagin-Konzentrationen.

Asparaginase I zeigte ein pH-Optimum von 8,0 (Abbildung 5). Zwischen pH 6,0 und 9,0 blieben mehr als 50% seiner Aktivität erhalten. Obwohl die maximale Aktivität bei physiologischem pH-Wert eine der Voraussetzungen der L-Asparaginase für die Antitumoraktivität ist, wäre das gereinigte Enzym nützlich, da 80% der Enzymaktivität bei pH 7,5 erhalten blieben. Das Enzym zeigte Stabilität bei alkalischem pH-Wert (pH 7,5–9,0), da es 90% seiner ursprünglichen Aktivität beibehielt, wenn es bis zu 24 h inkubiert wurde (Abbildung 6). Das pH-Optimum von L-Asparaginasen aus mehreren Pflanzen lag jedoch zwischen 8,0 und 8,5 . Die meisten L-Asparaginasen aus Bakterien zeigten alkalische pH-Optima (8,0–10) .

Abbildung 5

pH-Optimum der Asparaginase I aus P. vulgaris. Die Enzymaktivität wurde bei verschiedenen pH-Werten unter Verwendung der Standard-Assay-Methode wie zuvor beschrieben gemessen.

Abbildung 6

pH-Stabilität von Asparaginase I aus P. vulgaris bei unterschiedlichem pH-Wert nach 24 h Inkubation bei 4°C.

Asparaginase I zeigte ein Temperaturoptimum von 37°C (Abbildung 7). Ein ähnliches Temperaturoptimum von Asparaginase aus V. unguiculata (40°C) wurde berichtet. Diese Temperatur war auch ähnlich wie bei Pseudomonas aeruginosa und Pectobacterium carotovorum . Die optimale Aktivität von Streptobacillus sp. Asparaginase wurde bei 35 °C aufgezeichnet. Im Gegensatz dazu wurde L-Asparaginase aus Chrombacteriaceae und Proteus vulgaris bei 20 ° C bzw. 57 ° C beobachtet. Eine nichtlineare Beziehung zwischen Asparaginase I und Temperaturstabilität wurde nachgewiesen (Abbildung 8). Die Enzymaktivität war nach 1 h Inkubation bis 37°C stabil. unguiculata war nach 15 min Inkubation bis 40°C stabil. Asparaginasen aus P. carotovorum und C. annuum behielten ihre anfängliche Aktivität nach Inkubation bei 40 ° C bzw. 45 ° C für 60 min bei.

Abbildung 7

Temperaturoptimum der Asparaginase I aus P. vulgaris. Die Enzymaktivität wurde bei verschiedenen Temperaturen unter Verwendung der Standard-Assay-Methode wie zuvor beschrieben gemessen.

Abbildung 8

Thermische Stabilität von Asparaginase I aus P. vulgaris. Das Reaktionsgemisch wurde vor der Substratzugabe 60 min bei verschiedenen Temperaturen vorinkubiert und anschließend im Eisbad abgekühlt. Die Enzymaktivität wurde mit der Standard-Assay-Methode wie zuvor beschrieben gemessen. Die Aktivität zur Nullzeit wurde als 100% ige Aktivität angenommen.

Die Wirkung verschiedener Metallionen auf Asparaginase I wurde untersucht (Tabelle 3). Die Metallionen wurden in der Konzentration von 10 mM verwendet. K + konnte die Aktivität von Asparaginase I um 150% stark steigern. In Pflanzen wurden K + -unabhängige und K+ -abhängige Asparaginasen identifiziert . K + fungierte auch als Enhancer auf P. carotovorum Asparaginase . Ca2 + erhöhte die Aktivität leicht um 110%, aber Cu2 + hemmte leicht die Aktivität von Asparaginase I. Zusätzlich verursachten Pb2 + und Hg2 + eine teilweise inhibitorische Wirkung auf Asparaginase I. V. unguiculata-Asparaginase wurde jedoch durch Ni2 + und Co2 + aktiviert und durch Mn2 +, Zn2 +, Ba2 + und Hg2 + inhibiert . EDTA als Metallchelator verursachte eine teilweise hemmende Wirkung auf Asparaginase I. EDTA hatte jedoch keine Wirkung auf P. carotovorum asparaginase.

4. Schlussfolgerungen

Die L-Asparaginase I aus P. vulgaris wurde in glutaminase-freier Form gereinigt, was die Möglichkeit von Nebenwirkungen im Verlauf der Krebstherapie reduzieren kann. Das Enzym zeigte eine gute Stabilität über einen weiten Bereich von physiologischen Bedingungen wie pH-Wert und Temperatur. Im nächsten Schritt unseres Projekts wird L-Asparaginase I aus P. vulgaris als potenzieller Kandidat für die Behandlung der akuten lymphoblastischen Leukämie eingesetzt.

Interessenkonflikt

Die Autoren haben keinen für dieses Papier relevanten Interessenkonflikt offenzulegen.

Danksagungen

Dieses Projekt wurde vom National Plan for Science, Technology and Innovation (MAARIFAH), King Abdulaziz City for Science and Technology, Saudi Arabia, award No. (11-BIO-1516-03). Die Autoren erkennen auch mit Dank Science and Technology Unit, King Abdulaziz University, für die technische Unterstützung.