Kinase–Assay
Hergestellt von Swathi Arur
Proteinkinase (Stammlösungen von 1-10 mg / ml reinen Kinasen) – für diese Assays verwende ich gereinigte ERK2-Kinase (NEB). Für jedes Enzym ist es wichtig, den optimalen Puffer, die Ionenstärke und den pH-Wert für die Aktivität zu bestimmen. Wenn diese Bedingungen nicht erfüllt sind, kann das unten aufgeführte Protokoll als Ausgangspunkt verwendet werden.
Substrat (Stammlösung von 10 mM) – Substrate enthalten typischerweise ein Serin / Threonin in einem Phosphorylierungsstellenmotiv. Als Kontrolle verwende ich das Myelin-Basisprotein (erhalten von Sigma), das von NEB zur Kaliberation der ERK2-Kinase verwendet wurde.
Darüber hinaus sollten die Substrate eine positive Nettoladung aufweisen, um die Bindung an Phosphozellulosefilter, die im Assay verwendet werden, zu erleichtern. Zur quantitativen Bindung an das Phosphocellulosepapier empfiehlt es sich, mindestens 2 basische Reste und einen freien Aminoterminus aufzuweisen. Wenn ein Phosphorylierungsstellenmotiv nicht bekannt ist, kann ein allgemeines Tyrosinkinase-Substrat verwendet werden. Zum Beispiel „Myelin Basic Protein“ (ist ein unspezifisches Substrat für viele MAPKs). Für erste Reaktionen sollte eine Substratkonzentration von 0,7-1,5 mM verwendet werden. Um die kinetischen Parameter für die Phosphorylierung des synthetischen Peptids zu bestimmen, ist ein Bereich von Peptidkonzentrationen erforderlich
10X Kinase-Puffer – enthält 5 mg / ml BSA (um Kinase-Adsorption an das Assay-Röhrchen zu verhindern), 150 mM Tris-Cl (pH 7,5).
ATP / MgCl2 (gekauft von Upstate Biotech- Magnesium / ATP Cocktail # 20-113) – eine Stammlösung von 1-5 mM ist praktisch. Beachten Sie, dass die meisten MAPKs Km-Werte für ATP im Bereich von 10-150 uM haben, daher ist es für kinetische Experimente wichtig, Sättigungskonzentrationen von ATP zu verwenden, um Werte von Km und Vmax für die Peptide zu erhalten.
ATP – 10 mCi/ml.
ERK2-Kinase-Assays
a) AUTORADIOGRAPHIE-ASSAY:
- Ein Standardkinase-Assay wird in einem Volumen von 25 ul durchgeführt:
- 2,5 ul 10X Kinase-Puffer
- 5 ul 1,0 mM MgCl2/ATP (0,2 mM Endkonzentration)
- ATP (100-500 cpm/pmol)
- 3 ul 10 mM Substrat (1.2 mM Endkonzentration)
- 1 U der ERK2-Kinase
- H2O auf 25 ul
1. Bereiten Sie vor den Experimenten einen Cocktail zu, der genügend Puffer, ATP und ATP enthält, um die Assays abzuschließen. Bei Assays mit unterschiedlichen Substratkonzentrationen sollte das Substrat verdünnt und separat in jedes Röhrchen gegeben werden. Nachdem Sie den Cocktail in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen abgefüllt haben, legen Sie die Röhrchen 30 Minuten lang in ein Wasserbad bei 30 Grad C. Reaktionen sollten durch Zugabe von Kinase initiiert werden und bei 30 Grad C ablaufen.
2. Nach der gewünschten Zeit die Reaktionen durch Zugabe von 2 X SDS-Probenpuffer abbrechen und auf einem Gel auslaufen lassen.
3. Trocknen Sie das Gel auf einem Whatman 3.0-Papier und setzen Sie das trockene Gel einem Autoradiogramm aus und halten Sie die Kassette 2 Stunden lang bei -70C. (bei längeren Belichtungen darauf achten, dass der Film wieder trocken ist, bevor ein neues Autoradiogramm angelegt wird).
b) KINETISCHE ANALYSE:
1. Führen Sie den Kinase-Assay wie oben durch, diesmal verwenden Sie unterschiedliche Konzentrationen der Substrate ab 50 nm bis 1 mm. Stoppen Sie die Reaktion nach 30 Minuten, indem Sie 45 ul eiskalte 10% ige Trichloressigsäure (TCA) zu jeder Reaktion hinzufügen. Wirbeln Sie die Reaktionen.
3. Spin für 2 Minuten in Mikrozentrifuge (10K rpm).
4. 35 ul der Überstände auf Whatman P81 Cellulosephosphatfilterkreise mit 2,1 cm Durchmesser aufstreichen.
6. Waschen Sie die P81-Filterkreise dreimal mit 500 ml 0,5% iger Phosphorsäure (5-10 Minuten pro Waschgang). Der Fortschritt der Waschschritte kann verfolgt werden, indem der P81-Filterkreis für eine Blindreaktion entfernt und mit einem Geigerzähler überprüft wird.
7. Einmal mit 200 ml Aceton 5 Minuten bei Raumtemperatur waschen.
8. Lassen Sie die Filterkreise bei Raumtemperatur trocknen.
9. Setzen filter kreise in szintillation fläschchen und messen 32 stücke durch zählen die pads trockenen in eine szintillation zähler. Die spezifische Aktivität von ATP in einer Kinasereaktion (z. B. in cpm / pmol) kann bestimmt werden, indem eine kleine Probe (2-5 ul) der Reaktion auf einen P81-Filterkreis gespottet und direkt gezählt wird (kein Waschen). Die bei der Kinasereaktion erhaltenen Zählungen pro Minute (minus Leerwert) werden dann durch die spezifische Aktivität geteilt, um die in der Reaktion übertragenen Mol Phosphat zu bestimmen.
Kinetik der Substratphosphorylierung
Die kinetischen Parameter für die Phosphorylierung eines Substrats durch ein MAPK können unter Verwendung einer Variation des obigen Protokolls bestimmt werden.
1. Führen Sie eine Reaktion bei einer hohen Substratkonzentration durch, um festzustellen, dass das Protein ein Substrat ist.
2. Variieren Sie die Enzymkonzentration im Assay. Die Geschwindigkeit der Substratphosphorylierung sollte proportional zur Enzymkonzentration unter den Bedingungen des Tests sein. Dieses Experiment wird auch verwendet, um die Menge an Enzym zu bestimmen, die für die kinetischen Studien benötigt wird.
Zur Bestimmung der Raten sollte ein zeitlicher Verlauf der Substratphosphorylierung durchgeführt werden. Bereiten Sie in diesem Fall eine größere Enzymreaktion vor (wir verwenden 150 ul). Zu den gewünschten Zeitpunkten werden 25 ul Aliquots entnommen und in Mikrozentrifugenröhrchen mit 45 ul eiskaltem 10% TCA überführt und die Reaktionen wie oben beschrieben analysiert. Die Phosphorylierung des Substrats sollte zeitlich linear sein, und zur Messung der kinetischen Konstanten sollten die anfänglichen Reaktionsraten (5%) verwendet werden.
3. Variieren Sie die Substratkonzentration im Assay. Verwenden Sie ein Diagramm der Geschwindigkeit vs. Peptidkonzentration, um eine erste Schätzung des Wertes von Km zu erhalten. Ein breiter Bereich von Substratkonzentrationen (z. B. 20 uM bis 2 mM) sollte bei dieser ersten Messung verwendet werden.
4. Um Km (Substrat) und Vmax zu bestimmen, variieren Sie die Substratkonzentration und messen Sie die Geschwindigkeit des Phosphattransfers. Ein guter Bereich von Substratkonzentrationen sind die folgenden Vielfachen von Km: 0,125 x Km, 0,25 x Km, 0,5 x Km, 1,0 x Km, 2,0 x Km, 4,0 x Km, 8,0 x Km. Die Reaktionen sollten für beste Ergebnisse in dreifacher Ausfertigung durchgeführt werden.
5. Kinetische Konstanten werden durch gewichtete nichtlineare Anpassung der kleinsten Quadrate an die hyperbolische Geschwindigkeit im Vergleich zu Plots unter Verwendung iterativer Programme wie NFIT (Island Products, Galveston, TX) bestimmt.
BERECHNUNG von RAR:
RAR: Relatives Akzeptorverhältnis = Vmax / Km definiert als Gesamtmaß für die Fähigkeit eines Proteins, als Substrat zu fungieren.
Ich normalisiere die RAR eines gegebenen Substrats mit Myelin-Basisprotein, dh berechne den Wert von RAR für jedes Substrat und dividiere ihn dann durch den Wert von RAR des Myelin-Basisproteins (wodurch MBP auf 1,0 gesetzt wird).
