Strukturelle Basis für die Erkennung der K48-verknüpften Ub-Kette durch den proteasomalen Rezeptor Rpn13

Die K48-verknüpfte Ub-Kette schwankt dynamisch zwischen mehreren Konformationen

Wir haben smFRET verwendet, um die räumliche Anordnung der beiden Ub-Untereinheiten in ligandenfreien K48-verknüpften diUb. Wir haben Fluorophore, Alexa Fluor 488 und Cy5, am N-Terminus des distalen Ub und am C-Terminus des proximalen Ub eingeführt (Ergänzende Abb. S1a). Unter Verwendung des Erwartungsmaximierungsalgorithmus 32 kann das smFRET-Profil von K48-diUb am besten als drei überlappende FRET-Spezies beschrieben werden (Ergänzende Abb. S2). Die High-, Medium- und Low-FRET-Spezies sind bei FRET-Wirkungsgraden von 0,74, 0,57 und 0,23 zentriert, mit entsprechenden Populationen von ~ 48, ~ 39 und ~ 13% (Abb. 1a). Die Bundabstände zwischen den Zentren der Fluorophore werden mit ~ 43, ~ 50, ~ 64 Å berechnet. Somit können die High-, Medium- und Low-FRET-Spezies kompakten, halboffenen und offenen Zuständen zugeordnet werden, die für K48-diUb bereits existieren.

a Mit Fluorophoren konjugiert an 76 C Stelle der proximalen Ub und 0 C der distalen Ub (vgl. Ergänzende Fig. S1a) kann das smFRET-Profil auf drei überlappende Bundarten montiert werden. Sofern nicht anders angegeben, wird dieses Paar von Konjugationsstellen für alle smFRET-Studien von K48-diUb verwendet. Die High-FRET-Spezies (rot gefärbt) entspricht einem bereits existierenden kompakten Zustand. b-d Der kompakte Zustand kann selektiv durch Rpn13 in voller Länge angereichert werden, und die Populationszunahme kann an eine bindende Isotherme angepasst werden. z.B. kann der kompakte Zustand selektiv durch Rpn13NTD angereichert werden, und die Bevölkerungszunahme kann als bindende Isotherme angepasst werden. h Mit den an N25C/N25C-Stellen konjugierten Fluorophoren kann Rpn13NTD den bereits bestehenden kompakten Zustand des distalen Diubs von K48-tetraUb selektiv anreichern (vgl. Ergänzende Fig. S5), die eine Bindungsaffinität ergeben. Die Populationen der smFRET-Arten werden über drei unabhängige Messungen gemittelt, wobei die Fehler 1 SD anzeigen; Die KD-Werte werden als best fit ± Anpassungsfehler angegeben

Die Konformationsschwankung von K48-diUb wurde zuvor mit smFRET26 untersucht. In dieser Studie lösten die Autoren zwei smFRET-Spezies für K48-diUb auf, nämlich High-FRET- und Low-FRET-Spezies mit Center-FRET-Effizienz bei 0,69 bzw. 0,41, zusätzlich zu einer No-FRET-Spezies. Die Autoren zeigten, dass die Titration eines inaktivierten OTUB1 (OTUB1i), einer Deubiquitinase, die spezifisch für die K48-Isopeptidbindung ist33, hauptsächlich die Low-FRET-Spezies anreichert. Ihre Beobachtung führte zu dem Vorschlag, dass K48-diUb durch einen Konformationsauswahlmechanismus spezifisch von OTUB1 erkannt werden kann. Hier wiederholten wir die smFRET-Titration und fanden heraus, dass OTUB1i die Medium-FRET-Spezies anreichert (Ergänzende Abb. S3a-c). Darüber hinaus kann die Populationszunahme der Medium-FRET-Spezies bei OTUB1i-Titration an eine Bindungsisotherme mit einem KD-Wert von 7,7 ± 0 angepasst werden.1 µM (ergänzende Fig. S3d), die dem zuvor gemeldeten KD-Wert nahe kommt26. Daher sollten die mittleren FRET-Arten in der vorliegenden Studie den niedrigen FRET-Arten in der vorherigen Studie entsprechen, und die Diskrepanz kann sich aus unterschiedlichen Photonenzähleffizienzen und Anpassungsroutinen von smFRET-Zeitspuren ergeben.

Um weiter zu bestätigen, dass K48-diUb zwischen drei bereits existierenden Konformationszuständen schwankt, haben wir Fluorophore an zusätzlichen Paaren von Fluorophorkonjugationsstellen eingeführt (Ergänzende Abb. S1b-d). Für die alternativen Standorte können die smFRET-Profile, obwohl sich die Mitteneffizienzen der Bundspezies unterscheiden, immer noch als drei überlappende Bundspezies mit ähnlichen Populationen beschrieben werden (Ergänzende Abb. S4). Zum Beispiel sind für die 25 C / 25 C-Konjugationsstellen die Hoch-, Mittel- und Niedrig-FRET-Spezies bei FRET-Wirkungsgraden von 0,68, 0,54 und 0,21 zentriert, mit entsprechenden Populationen von ~ 48%, ~ 43% und ~ 9% (Ergänzende Abb. S4d). Daher ist es unwahrscheinlich, dass die Konjugation der Fluorophore die Proteinstruktur stört, und die smFRET-Messungen haben die inhärente Konformationsdynamik von K48-diUb unabhängig von der Konjugationsstelle gezeigt, dh das K48-diUb wechselt zwischen drei verschiedenen Zuständen in Abwesenheit eines Partnerproteins.

Um weiter zu beurteilen, ob Ub-Untereinheiten in längeren K48-verknüpften Ub-Ketten auch zwischen mehreren Konformationszuständen schwanken, analysierten wir das smFRET-Profil von K48-verknüpftem Tetra-Ubiquitin (K48-tetraUb). Wir konjugierten die Fluorophore an zwei N25C-Stellen im distalen diUb (in Bezug auf den proximalen diUb) von K48-DIUB. Das smFRET-Profil kann auch als drei überlappende Bundarten verwendet werden (Ergänzende Abb. S5a). Obwohl sich die relativen Populationen der drei Arten von denen eines isolierten K48-diUb mit an denselben Stellen konjugierten Fluorophoren unterscheiden (Ergänzende Abb. S4d) sind die Mittelbund-Wirkungsgrade der Bundspezies nahezu identisch. Somit bleiben die Konformationszustände der diUb-Einheit wahrscheinlich in einer längeren K48-verknüpften Ub-Kette erhalten, während der Unterschied in den relativen Populationen ein Ergebnis der modulatorischen Wirkung des proximalen diUb sein kann.

Die High-FRET-Spezies wird selektiv durch Rpn13 angereichert

Um die Beziehung zwischen der Konformationsdynamik der K48-verknüpften Ub-Kette und der Rpn13-Erkennung zu beurteilen, titrierten wir 150 pM fluorophormarkiertes K48-diUb mit humanem Rpn13-Protein in voller Länge. Interessanterweise wird bei Zugabe von 100 nM Rpn13 die bereits vorhandene High-FRET-Spezies von K48-diUb von ~ 48% auf ~ 57% angereichert (Abb. 1a, b), während die Population von Arten mit mittlerem und niedrigem BUND abnimmt. Die Population von High-FRET-Arten nimmt weiter zu, wenn mehr Rpn13 hinzugefügt wird (Abb. 1c), und die Bindungsisotherme kann auf einen KD-Wert von 119 ± 24 nM (Fig. 1d).

Es wurde bereits gezeigt, dass Rpn13NTD hauptsächlich für die Ub-Bindung verantwortlich ist6,7. So führten wir eine smFRET-Titration für 150 pM fluorophormarkiertes K48-diUb unter Verwendung von nur Rpn13NTD durch, das nur die ersten 150 Reste umfasste. Rpn13NTD reichert auch selektiv die High-FRET-Spezies von K48-diUb an (Abb. 1e, f). Die Populationszunahme von High-FRET-Arten kann angepasst werden, um einen KD-Wert von 33,1 ± 6,9 nM zu liefern (Abb. 1g), was einer etwa 4-fachen Erhöhung der Affinität im Vergleich zu Rpn13 in voller Länge entspricht. Werden die Fluorophore an alternativen Konjugationsstellen (Ergänzende Abb. S1b und S4b) bewirkt die Titration von Rpn13NTD auch die Anreicherung äquivalenter FRET-Spezies, die einem ähnlichen Trend folgen und einen nahezu identischen KD-Wert ergeben (Ergänzende Abb. S6). Somit kann das Auftreten zusätzlicher Rückstände eine geringe Hemmwirkung auf die Wechselwirkung zwischen Rpn13NTD und K48-diUb haben.

Weiterhin führten wir eine smFRET-Titration für 150 pM K48-DIUB mit am distalen diUb konjugierten Fluorophoren durch (Ergänzende Abb. S5a). Die Titration von Rpn13NTD reichert selektiv die bereits existierenden High-FRET-Spezies des fluorophormarkierten distalen DIUBS an (Ergänzende Abb. S5b-d), und die Bindungsisotherme kann auf einen KD-Wert von 214 ± 70 nM (Fig. 1 stunde). Die 7-fache Reduktion der Bindungsaffinität im Vergleich zur Rpn13NTD: K48-diUb-Wechselwirkung kann auf die Selbstassoziation zwischen distalem diUb und proximalem diUb34 zurückgeführt werden, wodurch die Bindungsoberfläche für die Rpn13-Bindung weniger verfügbar wird. Wichtig ist, dass sich für alle smFRET-Titrationen von K48-diUb oder K48-tetraUb die Mitteneffizienz der High-FRET-Spezies in Abwesenheit oder Anwesenheit von Rpn13 oder Rpn13NTD wenig ändert. Dies bedeutet, dass Rpn13 durch einen Konformationsauswahlmechanismus an eine bereits vorhandene Konformation von K48-diUb bindet, unabhängig davon, ob K48-diUb allein oder Teil einer längeren Ub-Kette ist. Dies bedeutet auch, dass die High-FRET-Spezies, d. H. Der bereits vorhandene kompakte Zustand von K48-diUb, nicht vollständig geschlossen ist und bereit ist, mit anderen Proteinen zu interagieren. Wichtig ist, dass die selektive Anreicherung der High-FRET-Spezies auch anzeigt, dass Rpn13 mit beiden Ub-Untereinheiten gleichzeitig interagieren sollte.

Rpn13 bindet bevorzugt an K48-verknüpfte DIB

Um die Rpn13-Bindungsspezifität für die K48-Verknüpfung zu bewerten, haben wir die Bindungsaffinitäten zwischen Rpn13 und anderen Arten von Ub-Proteinen bewertet. Mit der Titration von 200 nM Rpn13NTD in 150 pM fluorophormarkiertes K48-diUb steigt die Population der High-FRET-Spezies um 15% von ~ 48% auf ~ 63% (Abb. 1f). Bei dieser Konzentration ist die K48-diUb-Bindung noch nicht mit Rpn13NTD gesättigt (Abb. 1g) und daher reagiert die Population der High-FRET-Spezies empfindlich auf kleine Änderungen der verfügbaren Rpn13NTD-Konzentration. Unmarkiertes K48-diUb kann mit fluorophormarkiertem K48-diUb um die Bindung an Rpn13NTD konkurrieren. Mit der Zugabe von 150 pM unmarkiertem K48-diUb nimmt die Population der High-FRET-Spezies um 7,5% ab, was einer 50%igen Hemmung von Rpn13NTD-gebundenem fluorophormarkiertem K48-diUb entspricht (Fig. 2a). Mit der Zugabe von 300 pM unmarkiertem K48-diUb nimmt die Population der High-FRET-Spezies um 11% ab, was einer Hemmung von insgesamt 73% entspricht (Abb. 2b). Daher konkurrieren sowohl fluorophormarkierte als auch unmarkierte K48-diUb um die gleiche Bindungsschnittstelle auf Rpn13 mit ähnlicher Bindungsaffinität. Dies bedeutet auch, dass die Konjugation der Fluorophore zu K48-diUb die Wechselwirkung zwischen Rpn13NTD und K48-diUb nur wenig stört.

a, b Zugabe von 200 nM Rpn13NTD reichert zunächst die High-FRET-Spezies von fluorophormarkiertem K48-diUb an (vgl. Abbildung 1f) und weitere Zugabe von 150 pM und 300 pM unmarkiertem K48-diUb verringern die Population der High-FRET-Spezies. c, d Die Zugabe von 150 pM und 300 pM unmarkiertem Ub-Monomer hat einen vernachlässigbaren Effekt auf die Population der High-FRET-Spezies. e, f Zugabe von 150 pM K48-diUb und 150 pM M1-diUb verursachen sehr geringe Abnahme der Population der High-FRET-Arten

Außerdem fügten wir der Mischung aus 200 nM Rpn13NTD und 150 pM fluorophormarkiertem K48-diUb unmarkiertes Ub-Monomer, K63-gebundenes Diubiquitin oder M1-gebundenes Diubiquitin hinzu, um zu beurteilen, ob andere Arten von Ub K48-diUb verdrängen können. Die Population der High-FRET-Spezies ändert sich mit der Zugabe von 150 pM oder 300 pM Ub Monomer wenig (Abb. 2c, d). Mit der Zugabe von 150 pM K63-diUb und 150 pM M1-diUb bleibt auch die Population der HOCHFRET-Spezies im Fehlerbereich unverändert (Abb. 2e, f). Andererseits bewirkt die direkte Titration von 1 µM Rpn13NTD in fluorophorkonjugiertes K63-diUb und M1-diUb eine geringe Änderung ihrer bereits vorhandenen smFRET-Profile (Ergänzende Abb. S7). Zusammen interagiert Rpn13NTD selektiv mit K48-diUb.

Lösungsstruktur von Rpn13NTD:K48-diUb-Komplex

Obwohl wir nun gezeigt haben, dass Rpn13NTD selektiv mit K48-diUb interagiert, wurde nur die komplexe Struktur zwischen Rpn13NTD und Ub-Monomer bestimmt6,8. Um zu verstehen, wie die beiden Untereinheiten in K48-diUb gleichzeitig mit Rpn13NTD interagieren können, haben wir die Lösungsstruktur von Rpn13NTD: K48-diUb-Komplex unter Verwendung von Kernspinresonanz (NMR) bestimmt. Bei der Bildung eines Proteinkomplexes würden Grenzflächenreste eine andere lokale Umgebung erfahren und daher NMR-Signale anzeigen. Wir fanden heraus, dass die Titration von unmarkiertem K48-diUb zu 15N-markiertem Rpn13 große chemische Verschiebungsstörungen (CSPs) verursacht, an denen hauptsächlich die Reste 73-83 und 93-106 beteiligt sind (Abb. 3a). Diese Reste bilden eine zusammenhängende Oberfläche auf Rpn13, die eine Fläche bedeckt, die größer ist als erwartet von der zuvor bestimmten komplexen Struktur zwischen Rpn13NTD und Ub Monomer6,7. Auf der anderen Seite werden bei der Titration von unmarkiertem Rpn13NTD auf K48-dUb, wobei entweder proximal oder distal Ub 15N markiert und die andere Untereinheit unmarkiert ist, die CSPs hauptsächlich für Rückstände im β-Blattbereich beider Ub-Untereinheiten beobachtet. Einige der Grenzflächenreste verschwanden auch bei der Bildung des Komplexes (Abb. 3b, c).

a-c CSP gemittelt über 1H und 15N Dimensionen von Backbone-Amid-Protonen bei der Bildung des Komplexes mit 0,2 mM isotopenmarkierten und unmarkierten Proteinen. Einfügungen: Die 15N-markierte Untereinheit ist mit Oberflächendarstellung dargestellt, und die rot gefärbten Reste haben CSPs über der gepunkteten Linie. d, e Mit einer paramagnetischen Sonde, die an der E24C-Stelle des distalen Ub konjugiert ist, die Intensitätsverhältnisse zwischen paramagnetischen und diamagnetischen Spektren, und die PRE Γ2-Werte wurden für Backbone-Amidprotonen von 15N-markiertem Rpn13NTD bewertet. Graue Kästen zeigten Rückstände mit sehr großen intermolekularen PREs. f Mit der paramagnetischen Sonde, die an der N25C-Stelle des proximalen Ub konjugiert ist, Γ2-Werte wurden für Amidprotonen von 15N-markiertem distalem Ub in K48-diUb gemessen. Die Fehlerbalken zeigen 1 S.D., und Rückstände, die im Komplex vollständig verbreitert sind, werden mit Sternen bezeichnet

Nuclear Overhauser Effect (NOE) berichtet Entfernungsbeziehung (< 6 Å) zwischen Kernen. Darüber hinaus kann ein 13C-halbgefiltertes NMR-Experiment NOE zwischen 12C-gebundenem Proton und 13C-gebundenem Proton liefern, d. H. intermolekulare Entfernungsbeziehung. Wir erhielten intermolekulare NOEs zwischen Rpn13NTD und der proximalen Ub, zwischen Rpn13NTD und der distalen Ub und zwischen proximaler Ub und distaler Ub (Ergänzende Abb. S8). Darüber hinaus konjugierten wir eine paramagnetische Maleimid-EDTA-Mn2 + -Sonde an der E24C-Stelle des distalen Ub und sammelten paramagnetische Relaxationsverbesserung (PRE) für Rückgratamidprotonen von Rpn13NTD gemäß dem etablierten Protokoll22,35. Wie entweder durch das Spitzenintensitätsverhältnis von paramagnetischen zu diamagnetischen Spektren oder durch die transversale Relaxationsverbesserungs-Γ2-Rate beurteilt, erfahren die Rpn13-Reste 30-42 und 101-106 große PREs mit starker Linienverbreiterung (Abb. 3d, e). Wir konjugierten auch die paramagnetische Sonde an der N25C-Stelle des proximalen Ub und bewerteten die transversale Relaxationsverbesserungsrate Γ2 für den distalen Ub (Abb. 3f). Zwischen den beiden Ub-Untereinheiten des ligandenfreien K48-diUb werden große PRE-Werte beobachtet, und die Zugabe von Rpn13NTD erhöht inter-Ub PREs, jedoch mit einem ähnlichen PRE-Profil. Die PRE-NMR-Experimente bestätigen somit, dass Rpn13NTD den bereits bestehenden kompakten Zustand von K48-diUb anreichert.

Zur Verfeinerung des Rpn13NTD:K48-diUb komplexe Struktur Gegen experimentelle Beschränkungen führten wir starres Körperdocken mit Torsionswinkelfreiheit durch, die den diUb-Linkerresten und den Seitenketten der Grenzflächenreste gegeben ist. Für die 20 Konformatoren mit der niedrigsten Energie beträgt die Abweichung des quadratischen Mittelwerts (RMS) für die schweren Atome aller starren Reste 0,86 ± 0,54 Å (Ergänzende Abb. S9 und Tabelle S1). Die beiden Ub-Untereinheiten von K48-diUb bleiben in dem Komplex verbunden und begraben eine Solvent Accessible Surface Area (SASA) von ~ 1130 Å2. Andererseits verkeilt sich Rpn13NTD und vergräbt ~ 940 Å2 von SASA mit dem proximalen Ub und ~ 1300 Å2 von SASA mit dem distalen Ub (Abb. 4a). Die komplexe Struktur zwischen Rpn13NTD und proximalem Ub von K48-diUb in der vorliegenden Studie ähnelt der bekannten komplexen Struktur zwischen Rpn13NTD und Ub Monomer6,7, mit der RMS-Differenz für schwere Rückgratatome 2,17 ± 0,31 Å (Ergänzende Abb. S10a). Interessanterweise sind, obwohl die hydrophoben Reste L8, I44 und V70 in der proximalen Ub an der Wechselwirkung mit Rpn13 beteiligt sind, dieselben drei Reste in der distalen Ub in der Ub-Ub-Grenzfläche vergraben.

die Struktur Rpn13NTD:der Komplex K48-diUb. Die Bildung des Komplexes vergräbt umfangreiche Schnittstellen zwischen den Untereinheiten. b Elektrostatische Potentialflächen von Rpn13NTD und distales Ub von K48-diUb, gezeichnet im ± 3 kBT-Maßstab. Die Reste R104 in Rpn13NTD und D39 in distaler Ub sind als Kugeln und Stöcke dargestellt. c R104E Charge-Reversal-Mutation in Rpn13NTD verursacht eine 300-fache Abnahme der Bindungsaffinität für K48-diUb, wie von smFRET beurteilt (vgl. Ergänzende Fig. S11). Der KD-Wert wird als Best fit ± Anpassungsfehler gemeldet. d Western Blot Analysen zeigen, dass die Transfektion der Rpn13 R104E Mutante (mit einem N-terminalen Flag) die Gesamtmenge an K48-verknüpften polyUb Proteinen in der Zelle erhöht. e Zellviabilitäten bei Hitzeschock (relativ zu Zellen ohne Hitzeschock) zeigen, dass die Transfektion der Rpn13 R104E-Mutante, aber nicht des Wildtyps Rpn13, Thermotoleranz verleiht. *P < 0,05, ***P < 0.001, um Zellen in der gleichen Gruppe zu kontrollieren, ungepaarter T-Test; ##P < 0,01, ### P < 0,001, zu den unbehandelten Zellen mit Hitzeschock, Einweg-ANOVA; && P < 0.01, &&& P < 0,001, an Wildtyp-Rpn13-transfizierte Zellen mit Hitzeschock, Einweg-ANOVA

Die Rpn13NTD: K48-diUb-Komplexstruktur kann auch durch Einzelmolekül-FRET-Daten bestätigt werden. Basierend auf der komplexen Struktur modellierten wir die Fluorophore an ihren Konjugationsstellen in K48-diUb. Der durchschnittliche Abstand beträgt 43,2 ± 5.8 Å zwischen den geometrischen Zentren fluorophoraromatischer Ringe, was einer theoretischen FRET-Effizienz von 0,73 ± 0,13 entspricht (Ergänzende Fig. S10b). Dieser Wert ist fast der gleiche wie der Mittenwirkungsgrad, der für die High-FRET-Spezies beobachtet wurde (Abb. 1a).

Störung von Rpn13NTD: distale Ub-Wechselwirkung verursacht Akkumulation von ubiquitinierten Proteinen in der Zelle

In der komplexen Struktur zwischen Rpn13NTD und K48-diUb ist die Wechselwirkung zwischen Rpn13NTD und dem proximalen Ub ähnlich der zwischen Rpn13NTD und Ub Monomer, wie zuvor berichtet (Ergänzende Abb. S10a). Daher haben wir Experimente entwickelt, um die funktionelle Bedeutung für die Interaktion zwischen Rpn13NTD und dem distalen Ub von K48-diUb zu bewerten. Viele geladene Reste befinden sich an der Grenzfläche zwischen Rpn13NTD und dem distalen Ub von K48-diUb, und daher kann die elektrostatische Kraft eine wichtige Rolle bei der Stabilisierung des Komplexes spielen (Abb. 4b). Unter ihnen liegt der Rückstand D39 im distalen Ub nahe dem Rückstand R104 in Rpn13. Wir mutierten also den Rpn13-Rest R104 zu einem Glutamat und titrierten die Mutante Rpn13NTD zu fluorophormarkiertem K48-diUb. Das mutierte Protein reichert die High-FRET-Spezies von K48-diUb an (Ergänzende Abb. S11). Die Bindungsaffinität wird jedoch viel schwächer. Die Bindungsisotherme kann auf einen KD-Wert von 10,0 ± 3,3 µM angepasst werden, etwa 300-mal schwächer als der Wildtyp Rpn13NTD (Abb. 4c). Daher ist die Assoziation mit dem distalen Ub wichtig für die spezifische Erkennung zwischen Rpn13 und K48-diUb.

Die verminderte Bindungsaffinität der R104E-Mutante ermöglichte es uns, die funktionelle Bedeutung der Wechselwirkung zwischen Rpn13 und K48-verknüpfter Ub-Kette zu beurteilen. Die transiente Transfektion von Wildtyp-Rpn13 erhöht die Menge an K48-verknüpften polyUb-Proteinen geringfügig (Abb. 4d). Es ist möglich, dass bei der Rpn13-Transfektion eine überschüssige Menge an freiem Rpn13 um die Bindung an die K48-verknüpften polyUb-Proteine mit Proteasom-assoziiertem Rpn13 konkurriert, wodurch die Rekrutierung von ubiquitinierten Substratproteinen an das Proteasom weniger effizient wird. Andererseits erhöht die Transfektion der Rpn13-R104E-Mutante die Menge an K48-verknüpften polyUb-Proteinen im Vergleich zu den mit dem Wildtyp Rpn13 transfizierten Zellen stark (Abb. 4d). Als Positivkontrolle inkubierten wir die Zellen mit 1 µM MG132, einem potenten Proteasom-Inhibitor36. Aufgrund der Blockade des Abbaus labiler Proteine erhöht die Zugabe von MG132 die Menge an K48-verknüpften polyUb-Proteinen signifikant. Zusammengenommen kann die R104E-Mutation von Rpn13 zur Akkumulation von ubiquitinierten Substratproteinen führen. Dies kann auf eine schwächere Wechselwirkung zwischen der Proteasom-assoziierten Rpn13-Mutante und K48-diUb und K48-poyUb zurückgeführt werden.

Hitzeschock kann die Zelllebensfähigkeit verringern. Wir fanden heraus, dass ein 30-minütiger Hitzeschock bei 43 ° C die Lebensfähigkeit von HEK293-Zellen auf 75% verringern kann. Ähnlich wie in den vorherigen Berichten36,37 fanden wir auch heraus, dass die Behandlung von MG132 eine schützende Wirkung auf das Überleben der Zellen bei Hitzeschock hat, wobei die Lebensfähigkeit der Zellen auf ~ 90% abnahm (Abb. 4e). Dies liegt daran, dass MG132 den proteasomalen Abbau hemmt und die ansonsten kurzlebigen Hitzeschockproteine verfügbarer macht (Abb. 4d). Wir untersuchten auch die Lebensfähigkeit von hitzegeschockten Zellen, die mit Wildtyp Rpn13 transfiziert wurden, und fanden keinen signifikanten Unterschied zu den Kontrollzellen ohne Rpn13-Transfektion. Andererseits verringerte sich die Zelllebensfähigkeit von Rpn13 R104E-transfizierten Zellen bei Hitzeschock auf ~ 83%, was signifikant höher ist als die von Kontrollzellen und Zellen, die mit Wildtyp Rpn13 transfiziert wurden (Abb. 4e). Dies impliziert, dass die Mutante Rpn13 eine schützende Wirkung auf das Zellüberleben bei Hitzeschock hat, ähnlich der Wirkung von MG132. Zusammengenommen ist die Wechselwirkung zwischen Rpn13 und der K48-verknüpften Ub-Kette für die Rpn13-vermittelte Erkennung von ubiquitinierten Substratproteinen durch das Proteasom essentiell, während eine Grenzflächenpunktmutation in Rpn13 eine Akkumulation bestimmter Substratproteine wie Hitzeschockproteine verursachen und den transfizierten Zellen Thermotoleranz verleihen kann.

Rpn13NTD: Die K48-diUb-Interaktion kann gezielt die Rpn13-Funktion modulieren

Rpn13 wird über die Interaktion zwischen Rpn13NTD und dem C-terminalen Schwanz von Rpn27,13 dynamisch für das Proteasom rekrutiert. Die komplexe Struktur hier zeigt an, dass die Bindungsschnittstelle an Rpn13NTD für Rpn2 nahe an der Bindungsschnittstelle für das distale Ub von K48-diUb liegt, sich jedoch nicht überlappt (Abb. 5a). Wir haben also die letzten 16 Reste von Rpn2 (Rpn2CTD) mit Rpn13NTD oder mit Rpn13 in voller Länge im Verhältnis 1: 1 vorgemischt und den RPN13NTD: Rpn2CTD-Komplex zu fluorophormarkiertem K48-diUb titriert. Die Vormischung von Rpn2CTD erhöhte den KD-Wert von Rpn13NTD:K48-diUb von 33,1 ± 6,9 nM (Fig. 1g) bis 66,8 ± 13,9 nM (Ergänzende Abb. S12a-c und Fig. 5b), während der KD-Wert von Rpn13:K48-diUb von 119 ± 24 nM (Fig. 1d) bis 43,9 ± 12,8 nM (Ergänzende Fig. S12d-f und Fig. 5c). Somit verursacht die Assoziation von Rpn2CTD bei den Messunsicherheiten nur eine geringe Störung der Bindungsaffinität zwischen Rpn13 und K48-diUb, was auch mit der Anwesenheit von Linker und der C-terminalen Domäne von Rpn13 zu tun haben kann.

a Die Bindungsfläche des distalen Ub von K48-diUb auf Rpn13NTD grenzt an die Bindungsfläche von Rpn2CTD an. Mit RPN13NTD-Rpn2CTD komplexe struktur (PDB code 5V1Y) überlagert durch Rpn13NTD, Rpn2CTD ist gezeigt als rot cartoon. Rpn13-Rest K34 befindet sich in der Nähe des C-Terminus des distalen Ub (als gepunktete Linie dargestellt). b, c-Bindungsaffinitäten wurden aus smFRET-Titrationen von äquimolarem Rpn13NTD:Rpn2CTD oder Rpn13:Rpn2CTD an fluorophormarkiertes K48-diUb erhalten. Die KD-Werte werden als Best fit ± Anpassungsfehler gemeldet. die Bindung des Rpn2-verankerten Ub-Monomers nimmt wahrscheinlich die gleiche Bindungsfläche des distalen Ub ein, was zu dessen Verschiebung führt. e, f Die smFRET-Wettbewerbsexperimente unter weiterer Zugabe von 150 pM Rpn2CTD-Ub-Fusionsprotein zu der Mischung aus 200 nM Rpn13NTD oder Rpn13 in voller Länge und 150 pM fluorophormarkiertem K48-diUb (siehe Abbildung 1c und f). Der Fehler zeigt 1 S.D. aus drei unabhängigen Messungen der Populationen der smFRET-Arten an

Rpn2 und distales Ub von K48-diUb besetzen nahe gelegene Oberflächen auf Rpn13NTD. Daher kann ein Fusionsprotein mit Ub-Monomer, das am C-Terminus von Rpn2CTD angehängt ist, herausragen und die Wechselwirkung zwischen Rpn13NTD und dem distalen Ub von K48-diUb stören (Abb. 5d). Wie wir gezeigt haben, erhöht die Zugabe von 200 nM Rpn13NTD die Population der High-FRET-Spezies von 150 pM Fluorophor-markiertem K48-diUb auf ~ 63% (Abb. 1f), während die Zugabe von Ub-Monomer nicht um die Rpn13NTD-Bindung konkurrieren kann (Abb. 2c, d). Wenn wir zusätzliches 150 pM unmarkiertes Rpn2CTD-Ub-Fusionsprotein hinzufügen, nimmt die Population der High-FRET-Spezies um ~ 4% bis ~ 59% ab (Abb. 5e). Auf der anderen Seite haben wir gezeigt, dass die Zugabe von 200 nM Rpn13 in voller Länge die Population der High-FRET-Spezies von 150 pM Fluorophor-markiertem K48-diUb auf ~ 60% erhöht (Abb. 1c). Die weitere Zugabe von 150 pM unmarkiertem Rpn2CTD-Ub-Fusionsprotein verringert die Population von High-FRET-Spezies um ~ 4,5 bis ~ 55,5% (Abb. 5f). Beachten Sie, dass das Anhängen eines Ub an Rpn2CTD fast keinen Einfluss auf die Wechselwirkung zwischen Rpn2CTD und Rpn13NTD hat (Ergänzende Abb. S13). Somit zeigen unsere Daten, dass Rpn2- und K48-diUb-Bindungsschnittstellen auf Rpn13NTD nahe beieinander liegen. Noch wichtiger ist, dass Rpn2-verankertes Ub den Zugang des distalen diUb zu Rpn13 physisch blockieren und die Wechselwirkung zwischen K48-diUb und Rpn13 schwächen kann.