Vergleichende Analyse von KnockOut ™ Serum mit fötalem Rinderserum für die In Vitro Langzeitkultur von humanen limbalen Epithelzellen

Zusammenfassung

Die limbalen Epithelzellen können auf einer 3T3 Feeder-Schicht mit fötalem Rinderserum-supplementiertem Kulturmedium gehalten werden, und diese Zellen wurden verwendet, um erfolgreich einen limbalen Stammzellmangel zu behandeln. Fetales Rinderserum enthält jedoch unbekannte Bestandteile und zeigt quantitative und qualitative Chargenunterschiede. Um den Kulturzustand zu verbessern, wurde der definierte KnockOut-Serumersatz untersucht, um fötales Rinderserum für die Kultivierung menschlicher limbaler Epithelzellen zu ersetzen. Menschliche primäre limbale Epithelzellen wurden in KnockOut-Serum bzw. fötalem Rinderserum-supplementiertem Medium kultiviert. Die Zellwachstumsrate, die Genexpression und der Erhalt limbaler epithelialer Stammzellen wurden untersucht und zwischen diesen beiden Gruppen verglichen. Humane primäre limbale Epithelzellen wurden isoliert und in diesem neuartigen KnockOut-Serum-supplementierten Medium erfolgreich seriell kultiviert; die Zellproliferation und Stammzellerhaltung ähnelten denen von Zellen, die in fötalem Rinderserum-supplementiertem Medium gezüchtet wurden. Diese Daten deuten darauf hin, dass dieses KnockOut-Serum-supplementierte Medium ein effizienter Ersatz für das traditionelle fetale Rinderserum-supplementierte Medium für die limbale Epithelzellkultur ist, und dieses Medium hat ein großes Potenzial für die langfristige Aufrechterhaltung von limbalen Epithelzellen, limbale epitheliale Stammzelltransplantation und Geweberegeneration.

1. Einleitung

Hornhautepithelstammzellen befinden sich in der Basalschicht des Limbus, einer gewellten und pigmentierten Struktur, die als Palisaden von Vogt bezeichnet wird . Diese Stammzellen unterstützen die kontinuierliche Erneuerung des Hornhautepithels über ein Leben lang und ersetzen verletzte oder verlorene Hornhautepithelzellen . Ein limbaler Stammzellmangel (LSCD) und damit verbundene Augenoberflächenerkrankungen können mit kultiviertem limbalem Epithel-Autotransplantat erfolgreich behandelt werden. Der Erfolg dieser chirurgischen Behandlungen hängt von der effizienten Expansion der limbalen epithelialen Stammzellen ab, an denen in den meisten Fällen die 3T3-Feeder-Schicht und das fetale Rinderserum (FBS) beteiligt waren. Das 3T3 Feeder-Layer-Kultursystem wurde von Rheinwald und Green eingerichtet und wurde erfolgreich zur Expansion von Epithelzellen aus menschlicher Haut, Haarfollikel, Limbus, Bindehaut und Mundschleimhautgewebe eingesetzt . FBS ist jedoch nicht genau definiert und zeigt immer quantitative und qualitative Los-zu-Los-Variationen an . FBS enthält auch potenziell schädliche xenogene Komponenten, die immunologische Reaktionen stimulieren und Tierkrankheiten und Krankheitserreger übertragen können . Mit all diesen Bedenken besteht ein zunehmender Bedarf, ein genau definiertes Kulturmedium zu entwickeln, um das traditionelle FBS-Kulturmedium zu ersetzen.

Derzeit gibt es bestimmte serumfreie alternative Medien für das Wachstum von Epithelzellen, wie definiertes Keratinozyten-Serum-freies Medium (KSFM™, Invitrogen, USA), Keratinozyten-Wachstumsmedium (KGM™, Clontech, USA), Epilife™ (Invitrogen, USA) und Progenitor Cell Targeted (PCT) Medien (CellnTEC™, Schweiz). Es wurde gezeigt, dass diese Produkte die Expansion von Hornhautepithelzellen unterstützen. Sie benötigen jedoch immer noch Ergänzungen mit undefinierten Produkten wie Rinderhypophysenextrakt (BPE) oder Humanserumalbumin (HAS). Und die meisten dieser Medien erfordern eine hohe Zellsaatdichte, was für die Expansion menschlicher Hornhautepithelzellen möglicherweise nicht praktikabel ist. Darüber hinaus konnten hornhautepitheliale Stammzellen, die im 3T3-Kultursystem als Holoclone nachgewiesen werden, nicht langfristig in diesem serumfreien Kulturmedium gehalten werden . Bis heute gibt es kein definiertes serumfreies Medium, das die Expansion von hornhautepithelialen Stammzellen langfristig unterstützen könnte.

KnockOut Serum Replacement (SR) ist eine definierte serumfreie Formulierung, die entwickelt wurde, um FBS direkt für die Erhaltung von embryonalen Stammzellen (ESCs) und induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) zu ersetzen. Es wurde gezeigt, dass KnockOut SR konsistente Wachstumsbedingungen für ES-Zellen und iPSC-Kultur bietet, und ES-Zellen, die in KnockOut SR-supplementiertem Medium gezüchtet wurden, sind wesentlich weniger differenziert als solche, die in FBS-supplementiertem Medium gezüchtet wurden, und die Keimbahnübertragung wird nicht beeinträchtigt im geringsten. Angesichts der Ähnlichkeiten in den Kulturmethoden von Epithelzellen und ES-Zellen und angesichts der Tatsache, dass KnockOut-SR FBS in der ES-Zellkultur ersetzt, wird hier die Hypothese aufgestellt, dass die KnockOut-SR verwendet werden könnte, um FBS in der limbalen Epithelzellkultur zu ersetzen.

2. Materialien und Reagenzien

Zellkulturschalen, Kolben, Zentrifugenröhrchen und serologische Pipetten wurden von Becton Dickinson (Franklin Lakes, NJ; http://www.bd.com/) gekauft. Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM), Ham’s F-12, HEPES, Penicillin und Streptomycin, L-Glutamin, 0,05% Trypsin-0.02% EDTA-Lösung, hochgestelltes III-Kit und RNeasy ™ -Kit wurden von Invitrogen-GIBCO BRL (Grand Island, NY; http://www.invitrogen.com/) erworben. Fetales Rinderserum (FBS) wurde von Hyclone (Logan, UT; http://www.hyclone.com/) gekauft. Maus-NIH 3T3-Fibroblasten (ATCC CCL 92) wurden aus der American Type Culture Collection (Rockville, MD; http://www.atcc.org/) erhalten. Dispase II war von Roche. Monoklonale Antikörper (mAb) gegen ABCG2 (Klon BXP-21) und Connexin 43 stammten von Millipore; p63 (Klon 4A4), K5 und K19 stammten von Santa Cruz; K3 mAb (Klon AE5) stammte von ICN Pharmaceuticals (Costa Mesa, CA; http://www.mpbio.com/). Der Fluor 568-konjugierte Ziegen-Anti-Maus-Sekundärantikörper war von Invitrogen-GIBCO BRL (Grand Island, NY; http://www.invitrogen.com/). GeneAmp RNA-PCR und Taqman Universal PCR Master Mix AmpErase UNG Kits waren von Applied Biosystems (Foster City, CA; http://www.appliedbiosystems.com/). Mitomycin C, Rinderinsulin, humanes Transferrin, Hydrocortison, humaner epidermaler Wachstumsfaktor (EGF), Choleratoxin und andere Reagenzien wurden von Sigma-Aldrich (St. Louis; http://www.sigmaaldrich.com/).

2.1. Isolierung und Kultivierung menschlicher Limbusepithelzellen

Hornhaut-Limbus-Ringe wurden kurz nach der Hornhauttransplantation von fünf gesunden Spendern geerntet, eine Einverständniserklärung wurde eingeholt und das Probenernteprotokoll wurde vom Institutional Review Board (IRB) der Jilin University genehmigt. Frische Hornhaut-Limbus-Ringe wurden über Nacht mit 0,25% Dispase II bei 4 ° C behandelt, und die Epithelschicht wurde vom darunter liegenden Stromagewebe geschrubbt und mit 0,05% Trypsin-0,02% EDTA bei 37 ° C für 15 Minuten behandelt. Die Trypsinaktivität wurde durch 10% FBS neutralisiert und dissoziierte limbale Epithelzellen wurden gesammelt und 5 Minuten bei 1.500 U / min zentrifugiert. Die Lebensfähigkeit der Epithelzellen wurde durch Trypanblau-Fluoreszenzfärbung bestimmt und die Zellzahl mit einem Hämozytometer gezählt.

Maus-3T3-Fibroblasten wurden in Dulbecco’s modifiziertem Eagle’s Medium (DMEM, High Glucose), ergänzt mit 10% FBS, L-Glutamin (2 mM) und Penicillin-Streptomycin (50 IE / ml), gehalten und mit 5% CO2 und befeuchteter Atmosphäre kultiviert. 3T3-Zellen wurden alle 6 Tage subkultiviert, wenn eine Konfluenz von 80-90% erreicht wurde. 3T3-Zellen wurden seriell gepflegt, und nur Zellen vor Durchgang 20 wurden zur Herstellung der Feeder-Schicht verwendet. Zur Herstellung der Schicht wurden konfluente 3T3-Zellen 2 Stunden bei 37 ° C mit Mitomycin C (10 µg / ml) behandelt, zweimal mit PBS gewaschen und 5 Minuten bei 37 ° C mit 0,05% Trypsin behandelt. 3T3-Fibroblasten wurden dann gesammelt und einen Tag vor der Aussaat von Epithelzellen mit einer Dichte von 30.000 Zellen / cm2 plattiert.

Humane limbale Epithelzellen wurden auf 3T3 Feeder Layer kultiviert, wobei entweder FAD Medium oder Serum Replacement (SR) Medium verwendet wurde. Das FAD-Medium ist eine Mischung aus DMEM- und Ham-F-12-Medium (1: 1), das 10% fetales Rinderserum, L-Glutamin (2 mm) und Penicillin-Streptomycin (50 IE / ml), epidermalen Wachstumsfaktor (10 ng / ml), Insulin (5 µg / ml), Adenin (0,18 mm), Hydrocortison (0,4 µg / ml), Choleratoxin (0,1 nM) und Trijodthyronin (2 nM) enthält. Das SR-Medium ist eine Mischung aus DMEM- und Ham-F-12-Medium (1: 1), das 10% KnockOut-SR-Serumersatz, L-Glutamin (2 mm) und Penicillin-Streptomycin (50 IE / ml), epidermalen Wachstumsfaktor (10 ng / ml) enthält), Insulin (5 µg / ml), Adenin (0,18 mm), Hydrocortison (0.4 µg/ml), Choleratoxin (0,1 nM), Trijodthyronin (2 nM), Transferrin (5 µg/ml) und Selen (5 ng/ml). Limbale Epithelzellen wurden auf 3T3 Feeder Layer mit einer Dichte von 6.000 Zellen/cm2 ausgesät und mit 5% CO2 und befeuchteter Atmosphäre kultiviert. Das FAD-Medium wurde alle 3 Tage gewechselt, während das SR-Medium alle 2 Tage gewechselt wurde.

2.2. Colony Forming Efficiency Assay (CFE)

Für den CFE-Assay wurden 200 humane limbale Epithelzellen aus FAD-Kultur oder SR-Kultur auf eine 100 mm Petrischale mit Mitomycin C-behandelter 3T3-Feeder-Schicht plattiert und wie oben beschrieben kultiviert. Nach 12-tägiger Kultur wurden die Schalen 30 Minuten bei Raumtemperatur mit 10% Formalin fixiert und weitere 30 Minuten mit 1% Rhodamin B angefärbt. Nach dem Waschen mit destilliertem Wasser wurden die Koloniezahlen gezählt und analysiert. Die Effizienz der Koloniebildung wurde als Anzahl der gebildeten Kolonien geteilt durch 200 ausgedrückt.

2.3. Zellpopulationsverdopplungstest

Limbale Epithelzellen wurden auf einer mit Mitomycin C behandelten 3T3-Feeder-Schicht unter Verwendung von FAD-Medium oder SR-Medium erhalten. Epithelzellen wurden bei Erreichen einer Konfluenz von 80-90% trypsinisiert und bei einer Dichte von 6.000 Zellen / cm2 passagiert. Die Kulturen wurden 10 Tage lang seriell gepflegt. Bei jeder Passage wurden limbale Epithelzellen geerntet und die Zellzahlen gezählt. Die Anzahl der Populationsverdopplungen (PD) für jede Passage wurde nach folgender Formel berechnet: , wobei die Gesamtzahl der bei jedem Durchgang erhaltenen Zellen und die Anzahl der Plattierungszellen zu Beginn darstellt.

2.4. RNA-Extraktion und quantitative Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion

Zur Bewertung des Genexpressionsniveaus von limbalen Epithelzellen wurden PCR und Echtzeit-PCR durchgeführt. Die Gesamt-RNA wurde unter Verwendung des RNeasy-Kits gemäß den Anweisungen des Herstellers aus den Hornhautepithelzellen extrahiert. Die RNA wurde durch ihre Absorption bei 260 nm quantifiziert und bei -80°C gelagert. Zur Synthese von cDNAs wurde 1 µg Gesamt-RNA mit dem Superscript III Reverse Transcription Kit verwendet. Die PCR wurde mit dem Platinum PCR Master Mix (Life Technology) und die Real-time PCR mit dem SYBR Green PCR Master Mix (Roche) mit den zuvor beschriebenen Primern durchgeführt. Real-Time PCR-Reaktionen wurden in dreifacher Ausfertigung mit einem initialen Aktivierungsschritt bei 95°C für 3 Minuten durchgeführt, gefolgt von 45 Zyklen: 95°C für 30 Sekunden, 60°C für 30 Sekunden und 72°C für 40 Sekunden. Die relative Genexpression wurde berechnet, indem die Differenz des Zyklusschwellwerts (Delta Ct) normalisiert wurde, Werte der Gene zum Delta Ct-Wert der Glyceraldehyde-3-phosphat-Dehydrogenase (GAPDH).

2.5. Immunfluoreszenzfärbung

Humane Limbusepithelzellen wurden in Kulturträger mit 3T3-Feeder-Schicht in FAD-Medium oder SR-Medium ausgesät. Drei Tage nach der Aussaat wurden Kulturen mit 4% Paraformaldehyd oder kaltem Aceton bei 4°C für 10 Minuten fixiert. Nach zweimaligem Waschen mit PBS wurden die Zellen 30 Minuten lang mit 5% igem Ziegenserum in PBS blockiert. Die Maus-Primärantikörper gegen p63 (1:200, 4A4, Santa Cruz), ABCG2 (1:30, BXP-21, Millipore), K3 (1: 400, Millipore) und Connexin 43 (1: 1000, Millipore) wurden appliziert und über Nacht bei 4°C inkubiert. Der Fluor 568-konjugierte Sekundärantikörper wurde nach zweimaligem Waschen mit PBS 1 Stunde appliziert. Anschließend wurden die Zellkerne 20 Minuten lang mit Hoechst 33342 (1 µg/ml in PBS) gegengefärbt. Nach 3maligem Waschen mit PBS wurde die Zellkultur mit Montagemedium (Vector Laboratories, Burlingame, CA) montiert und unter einem Fluoreszenzmikroskop (BX50) untersucht; Olympus, Tokio, Japan).

2.6. Western-Blot-Analyse

Kultivierte limbale Epithelzellen wurden mit RIPA-Puffer (10 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl, 1% Natriumdeoxycholat, 1% Triton X-100, 1 mM EDTA und Proteaseinhibitorcocktail; Roche Diagnostics) 30 Minuten auf Eis lysiert. Die Proteinkonzentration wurde mittels Bicinchoninsäure (BCA) Protein Assay (Pierce, Rockford, IL) quantifiziert. Gesamtzelllysate (40 µg) wurden in 12% Gradient SDS-PAGE Gel elektrophoresiert, auf Nitrozellulosemembran (Bio-Rad) transferiert, mit 5% Magermilch in Tris-gepufferter Kochsalzlösung (TBS) für 1 Stunde blockiert und mit Mausantikörpern gegen proliferierendes Zellkern-Antigen (PCNA, Santa Cruz, CA), ABCG2 (BXP-21, Millipore) oder p63 (4A4, Santa Cruz, CA) über Nacht bei 4°C untersucht. Die die Membranen wurden dann dreimal mit TBS gewaschen, mit Ziegen-Anti-Maus-IgG (1: 5000, HRP-konjugiert, Santa Cruz, CA) oder Kaninchen-Anti-Ziegen-IgG (1) inkubiert : 5000, HRP-konjugiert, Santa Cruz, CA) für 1 Stunde bei Raumtemperatur und entwickelt mit enhanced chemiluminescent substrates (Pierce Biotechnology, Rockford, IL). Die Expressionsniveaus von ABCG2, PCNA und p63 wurden unter Verwendung einer semiquantitativen Intensitätsmessung gemessen und auf den GAPDH-Spiegel normalisiert, der als interne Kontrolle diente.

2.7. Statistics

Zusammenfassung der Daten von CFE und relative fold der Real-time PCR wurde als Mittelwert ± SD berichtet und mit Student’s unpaired -Test mit Microsoft Excel (2003 / XP Version) verglichen. Die Testergebnisse wurden als Zwei-tailed Werte berichtet, wo statistisch signifikant angesehen wurde.

3. Ergebnisse

3.1. Der Phänotyp der hornhautepithelialen Stammzellen im SR-Medium

Insgesamt wurden 5 Hornhaut-Limbus-Ringgewebe von Spendern im Alter von 32 bis 65 Jahren entnommen. Diese Gewebe wurden innerhalb von 24 Stunden nach der Ernte konserviert und verarbeitet. Die humane primäre Hornhautepithelzellkultur wurde erfolgreich in FAD-Medium (Abbildungen 1 (a) und 1 (b)) und SR-Medium (Abbildungen 1 (c) und 1 (d)) aufgebaut. Die Hornhautepithelzellen, die in der SR medium + 3T3 Feeder-Schicht gehalten wurden, zeigten eine Morphologie mit geringer Größe und hohem Kern / Zytoplasma-Verhältnis, was eine typische undifferenzierte Epithelzellmorphologie war, und die großen differenzierenden flachen plattenepithelähnlichen Zellen wurden selten beobachtet (Abbildung 1 (c)). Die in SR-Medium gehaltenen Epithelzellen begannen 3 Tage nach der Aussaat Kolonien zu bilden (Abbildung 1 (c)). Die Größen dieser Kolonien ähnelten denen, die in der FAD medium + 3T3 Feeder-Schicht gebildet wurden (Abbildung 1 (a)), aber diese Kolonien waren weniger dicht verdichtet als die in der FAD + 3T3 Feeder-Schicht. Innerhalb von 7 Tagen erreichten Epithelzellen eine Konfluenz in SR-Medium mit einheitlicher kleiner Größe (Abbildung 1 (d)), die auch in FAD-Kultur beobachtet wurde (Abbildung 1 (b)). In dieser Studie konnten menschliche Hornhautepithelzellen für alle fünf Spender in einer Medium + 3T3-Feeder-Schicht gewonnen und erhalten werden. Für die Langzeitkultivierung wurden humane Hornhautepithelzellen seriell in SR medium + 3T3 Feeder Layer für mehr als 10 Passagen subkultiviert (). Während jeder Passage wurden die Zellen trypsinisiert und gesammelt, wenn die Zellen 80-90% Konfluenz erreichten; Zellzahlen wurden für den Populationsverdopplungstest berechnet. Das Ergebnis zeigt, dass die Ausbeute an Epithelzellen aus SR-Medium der von in FAD-Medium kultivierten Zellen nahe kommt, wie in Abbildung 2 (a) gezeigt, und diese Daten ähneln früheren Berichten . Zusammenfassend zeigen die hier vorgestellten Daten, dass SR-Kulturmedium + Mitomycin C-behandelte 3T3-Feeder-Schicht das klonale Wachstum und die Proliferation menschlicher Hornhautepithelzellen unterstützt.

(ein)

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(d)

Abbildung 1

Die Kultur menschlicher limbaler Epithelzellen in SR-Medium. (a) Die menschlichen Hornhautepithelzellen bildeten nach 3-tägiger Aussaat von Zellen dicht verdichtete Kolonien in FAD-Medium. (b) Nach 7 Tagen erreichten Epithelzellen einen Zusammenfluss in FAD-Medium mit einheitlicher kleiner Größe. (c) Menschliche Hornhautepithelzellen bildeten Kolonien innerhalb des SR-Mediums, die denen ähnlich waren, die innerhalb des FAD-Mediums gebildet wurden, aber diese Kolonien waren weniger dicht verdichtet als die in FAD. (d) Nach 7 Tagen erreichten Epithelzellen eine Konfluenz in SR-Medium mit einheitlicher kleiner Größe, die denen in der FAD-Kultur-Originalvergrößerung ähnlich war: (a) × 10; (b) × 10 (Skalenbalken: 100 µm).

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(b)

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Abbildung 2

Vergleich der Zellpopulationsverdopplung (PD) und der koloniebildenden Effizienz (CFE) humaner limbaler Epithelzellen, die in SR- und FAD-Medien kultiviert wurden. (a) Menschliche limbale Epithelzellen wurden seriell in SR-Medium und FAD-Medium für 10 Passagen subkultiviert (); Zellpopulationsverdopplungen (PD) Anzahl und akkumulierte PD wurden berechnet und aufgetragen. PD wurde nach folgender Formel berechnet: , wobei die Gesamtzahl der bei jedem Durchgang erhaltenen Zellen und die Anzahl der Plattierungszellen zu Beginn jedes Durchgangs darstellt. (b) Zur Analyse des CFE wurden limbale Epithelzellen mit einer Dichte von 200 Zellen pro 100 mm Petrischale in SR- und FAD-Medien ausgesät und 12 Tage wachsen gelassen. (c) Die CFE-Werte für Epithelzellen in SR- und FAD-Medien waren und. Keine Unterschiede von CFE wurden zwischen SR-Medium und FAD-Medium-Gruppe (, ) gefunden. (d) Der Prozentsatz der kolonisierten Fläche in FAD lag nahe an dem von SR-Medium. Die im SR-Medium gehaltenen limbalen Epithelzellen zeigten im Vergleich zu den im FAD-Medium gehaltenen Zellen eine ähnliche CFE- und Koloniegröße.

3.2. CFE-Assay

Als nächstes untersuchten und verglichen wir das CFE von Hornhautepithelzellen, die in FAD- und SR-Medien kultiviert wurden. Zur Analyse des CFE wurden in SR- und FAD-Medien kultivierte Hornhautepithelzellen geerntet und mit einer Dichte von 200 Zellen pro 100 mm Petrischale ausgesät, die mit einer mit Mitomycin C behandelten 3T3-Feeder-Schicht vorgesät wurde, und diese Kultur wurde 12 Tage wachsen gelassen. Die Hornhautepithelzellen begannen 5-7 Tage nach Kulturbeginn Kolonien zu bilden. Wie in Abbildung 2 (b) gezeigt, zeigten die in SR-Medium gehaltenen Hornhautepithelzellen nach 12-tägiger Kultivierung eine ähnliche CFE- und Koloniegröße wie in FAD-Medium gehaltene Zellen. Der CFE-Wert für Epithelzellen in SR- und FAD-Medien war und (Abbildung 2 (c)). Die statistische Analyse zeigte, dass es keine signifikanten Unterschiede in der Effizienz der Koloniebildung () und der durchschnittlichen Fläche der Kolonien () zwischen SR- und FAD-Medien gab (Abbildung 2 (c)). Wir quantifizierten den Prozentsatz der Koloniearten basierend auf der Fläche der Kolonien. Die Ergebnisse zeigten, dass der Prozentsatz der abortiven Kolonien (Koloniefläche < 1 mm2), die im SR-Medium gebildet wurden, dem im FAD-Medium ähnlich war (). In ähnlicher Weise war der Prozentsatz der großen Kolonien (Koloniefläche > 4 mm2), die in SR-Medium gebildet wurden, nahe dem in FAD-Medium () (Abbildung 2 (d)). Diese Ergebnisse zeigen, dass in SR-Medium kultivierte Hornhautepithelzellen im Vergleich zu in FAD-Medium gezüchteten Zellen ein ähnlich hohes Proliferationspotential aufweisen.

3.3. PCR- und Echtzeit-PCR-Analyse

Zur Untersuchung der Genexpression wurden PCR und Echtzeit-PCR an Epithelzellen durchgeführt, die sowohl in FAD- als auch in SR-Medien kultiviert wurden. Das Gen GAPDH wurde als interne Kontrolle verwendet. PCR-Daten zeigen, dass die sowohl im FAD-Medium als auch im SR-Medium kultivierten Zellen eine hochgradige Transkriptexpression der proliferativen Marker-PCNA aufweisen. Die Zellen in beiden Medien zeigen eine positive Expression von Cytokeratin 3 und Cytokeratin 12, was mit ihrem Limbusursprung übereinstimmt. Die positive Expression des Basalschichtepithelzellmarkers Cytokeratin 15 wurde ebenfalls in beiden Kulturen beobachtet. Die Expression von ABCG2 und ΔNp63α wurde in beiden Kulturen nachgewiesen, obwohl die Expression von ABCG2 nach der Primärkultur in SR-Medium leicht abnahm. Die geringe Expression von Connexin 43 wurde in beiden Kulturen beobachtet und implizierte eine geringe Differenzierung der Epithelzellen in beiden Medien. Für die Echtzeit-PCR zeigte die quantitative Analyse des mRNA-Spiegels, dass es keinen signifikanten Expressionsunterschied () von p63 und ABCG2 zwischen Epithelzellen gab, die in FAD- und SR-Medien gezüchtet wurden (Abbildung 4 (a)). Eine Echtzeitanalyse der hornhautepithelialen Differenzierungsmarker Cytokeratin 3 und Cytokeratin 12 wurde ebenfalls durchgeführt. Beide dieser beiden Marker waren in FAD- und SR-Zellkulturen kaum nachweisbar, und überraschenderweise gibt es keinen signifikanten Unterschied () im Expressionsniveau zwischen diesen beiden Kulturen.

3.4. Immunfluoreszenzfärbung

Um zu bestätigen, dass die in SR-Medium gewachsenen Epithelzellen die Stammheit und den undifferenzierten Zustand beibehielten, wurde eine Immunfluoreszenzfärbung mehrerer Proliferations-, Differenzierungs- und mutmaßlicher epithelialer Stammzellmarker durchgeführt. Wie in Abbildung 4 gezeigt, zeigten die meisten Epithelzellen in SR-Medium eine kleine und gleichmäßige Morphologie, und die meisten Zellen wurden stark mit p63, dem mutmaßlichen epithelialen Stammzellmarker, gefärbt. ABCG2-positiv gefärbte Zellen wurden auch in einer fleckigen Verteilung innerhalb der limbalen Epithelzellkolonien beobachtet. Die in SR-Medium gehaltenen Zellen waren schwach für Connexin 43 und Cytokeratin 3 gefärbt. Die geringe Expression dieser beiden Differenzierungsmarker deutet auf eine geringe Differenzierung der Epithelzellen in der Zellkultur hin. Der ähnliche Färbestil wurde auch in Zellen beobachtet, die mit FAD-Medium gehalten wurden (Abbildung 4 (b)). Diese Daten deuten darauf hin, dass menschliche limbale Epithelzellen, die in SR-Medium kultiviert wurden, eine hohe Expression mutmaßlicher epithelialer Stammzellmarker beibehielten, während sie niedrige Differenzierungsmarker exprimierten.

3.5. Western Blot

Um die quantitativen Ergebnisse der Genexpression und der Immunfluoreszenzfärbung doppelt zu bestätigen, wurde die Expression potenzieller epithelialer Stammzellmarker (p63 und ABCG2) und Proliferationsmarker (PCNA) unter Verwendung von Western Blot ausgewertet. Mit monoklonalem p63-Antikörper (Klon 4A4, Santa Cruz) wurde das p63-Protein (70 KD, ΔNα-Isoform) bei hohem Expressionsniveau in SR-Medium nachgewiesen. Die Expression von ABCG2 (70 KD) wurde in jeder Passage von in SR-Medium kultivierten Zellen nachgewiesen. PCNA, Proliferationsmarker, wurde auch in Zellen nachgewiesen, die in SR-Medium kultiviert wurden (Abbildung 3 (c)). Und die Expressionsniveaus von p63, ABCG2 und PCNA waren in 10 Passagen mit semiquantitativer Intensitätsmessung ähnlich (Abbildung 3 (d)) unter Verwendung von GAPDH als interne Kontrolle.

(ein)

(b)

(c)

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(a)
(b)
(c)
(d)

Abbildung 3

Genexpression und Proteinexpression in menschlichen limbalen Epithelzellen. (a) Genexpressionsanalyse von menschlichen limbalen Epithelzellen. PCR-Daten zeigen, dass die Zellen, die sowohl im FAD-Medium als auch im SR-Medium kultiviert wurden, eine hohe Expression des Proliferationstranskripts PCNA in P1, P4, P7 und P10 aufweisen. Die Zellen in beiden Medien zeigen eine positive Expression von Cytokeratin 3 und Cytokeratin 12, was ihren Limbusursprung impliziert. Die positive Expression des Basalschichtepithelzellmarkers Cytokeratin 15 wurde ebenfalls in beiden Kulturen beobachtet. Die Expression von ABCG2 und ΔNp63α wurde in beiden Kulturen nachgewiesen; es wurde beobachtet, dass ihre Expression nach Passage 7 (P7) in beiden Kulturmedien leicht abnahm. Die geringe Expression von Connexin 43 (Cx43) wurde in beiden Kulturen beobachtet und implizierte eine geringe Differenzierung der Epithelzellen in beiden Medien. (b) Quantitative Echtzeit-PCR-Analyse von menschlichen limbalen Epithelzellen, die in SR- und FAD-Medien kultiviert wurden. Echtzeit-PCR wurde an Epithelzellen durchgeführt, die sowohl mit FAD- als auch mit SR-Medien kultiviert wurden. Das Gen GAPDH wurde als interne Kontrolle verwendet. Die Analyse der limbalen epithelialen Stammzellmarker p63 und ABCG2 mRNA ergab, dass es keinen signifikanten Unterschied (, ) in der Expression zwischen Epithelzellen gab, die in FAD- und SR-Medien gezüchtet wurden. Echtzeitanalyse der hornhautepithelialen Differenzierungsmarker Cytokeratin 3 und Connexin 43 wurde durchgeführt. Alle diese Marker waren sowohl in FAD- als auch in SR-Zellkulturen kaum nachweisbar, und überraschenderweise gibt es keinen signifikanten Unterschied (, ) des Expressionsniveaus zwischen diesen beiden Kulturen. Alle Real-Time PCR Experimente wurden in dreifacher Ausfertigung durchgeführt. (c) Western-Blot-Assay von humanen limbalen Epithelzellen, die in FAD- und SR-Medien kultiviert wurden. Die Expression von Proliferationsmarkern (PCNA) und potentiellen epithelialen Stammzellmarkern (p63 und ABCG2) wurde mittels Western Blot ausgewertet. Unter Verwendung des monoklonalen Antikörperklons 4A4 wurde das p63-Protein (70 KD) mit hohem Expressionsniveau in SR-Medium nachgewiesen. Die Expression von ABCG2 wurde in jeder Passage von in SR-Medium kultivierten Zellen nachgewiesen. PCNA, das Zellkernantigen, ein Zellproliferationsmarker, wurde auch in in SR-Medium kultivierten Epithelzellen nachgewiesen. (d) Die Expression von ABCG2, p63 und PCNA wurde quantifiziert und mittels semiquantitativer Intensitätsmessung aufgetragen. Die Blot-Dichte von ABCG2, p63 und PCNA wurde gemessen und auf das Niveau von GAPDH normalisiert.

(ein)

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(b)

Abbildung 4

Expression von epithelialen Stammzellmachern und Differenzierungsmarkern in humanen limbalen Epithelzellen. Die humanen Limbusepithelzellen wurden in SR- und FAD-Medien stark mit ABCG2 und p63 (grün) angefärbt. Die in SR- und FAD-Medien gehaltenen Zellen zeigten eine schwache Färbung für Connexin 43 (Cx43) und Cytokeratin 3 (K3). (a) SR Medium und (b) FAD Medium. Ursprüngliche Vergrößerung: (a) ×10; (b) ×10 (Skalenbalken: 100 µm). Die Studien wurden in dreifacher Ausfertigung durchgeführt, und repräsentative Zahlen sind hier gezeigt.

4. Diskussion

Epithelzellen, die auf einer 3T3-Feeder-Schicht kultiviert wurden, wurden erfolgreich abgeleitet und zur Behandlung verschiedener klinischer Situationen wie schwerer Verbrennungen, diabetischer Fußgeschwüre, Hautdefekte und Mundschleimhautdefekte verwendet . Die erste Transplantation von limbalen epithelialen Stammzellen wurde 1997 von Pellegrini et al. . In den letzten Jahrzehnten wurden verschiedene Kulturmethoden entwickelt, darunter die Kultur von limbalen Epithelzellen auf menschlicher Amnionmembran (HAM) mit oder ohne 3T3-Feeder-Schicht , die Kultur von Epithelzellen auf temperaturempfindlichen Platten und die Kultur von Epithelzellen mit kommerziellem serumfreiem Kulturmedium. Da der jüngste Bericht darauf hinweist, dass das klinische Ergebnis der Hornhaut- / Limbusepithelzelltransplantation davon abhängt, ob die limbalen Stammzellen in der Zellkultur konserviert sind, wurde darauf hingewiesen, dass Holoclone nur im FAD + 3T3-Kultursystem erhalten blieben . Da dieses Kulturprotokoll die Verwendung von FBS beinhaltet, gibt es wachsende Sicherheitsbedenken, dass FBS schlecht definierte Tierprodukte sind und das Potenzial haben, Krankheiten tierischen Ursprungs auf Patienten zu übertragen . Daher besteht ein zunehmender Bedarf, ein tierproduktfreies und FBS-freies Kulturmedium zu entwickeln, um das traditionelle FAD-Medium zu ersetzen.

In dieser Studie entwickelten wir ein neuartiges serumfreies Kulturmedium, in dem KnockOut SR FBS ersetzte. Die Phänotypen der limbalen epithelialen Stammzellen in diesem neuen serumfreien Kulturmedium wurden durch Immunfärbung mit Antikörpern auf vorgeschlagene Stammzellmarker (p63, ABCG2) und Differenzierungsmarker (Cytokeratin 3, Connexin 43) untersucht.

Der Kerntranskriptfaktor p63 wurde zuvor als Marker für epitheliale Stammzellen vorgeschlagen, und ΔNα ist die vorherrschende Isoform der p63-Isoformen in diesen Zellen . Unsere Ergebnisse stimmen mit diesen früheren Berichten überein; nuclear p63 wurde in limbaler Zellkultur stark exprimiert, was durch Immunfärbung, Echtzeit-PCR und Western Blot gezeigt wurde. Das Vorhandensein von p63 in der limbalen Zellkultur zeigt ihr hohes proliferatives und Selbsterneuerungspotential. ABCG2, ein Mitglied der ATP-bindenden Kassette (ABC) -Transporter, ursprünglich bekannt als Brustkrebs-resistentes Protein 1 (BCRP1), wurde als ein weiterer mutmaßlicher Stammzellmarker für adulte Stammzellen, einschließlich limbusepithelialer Stammzellen, vorgeschlagen . Die hohe Expression von ABCG2 im SR-Medium wurde durch Immunfärbung und Echtzeit-PCR nachgewiesen.

K3 und K12 sind als hornhautspezifische Marker bekannt . Konsistent zeigten unsere Immunfärbungs- und Echtzeit-PCR-Ergebnisse, dass die Zellen K3- und K12-negativ waren, was ihren Limbus-Ursprung bestätigte. Connexin 43 ist ein Mitglied der Gap Junction Proteine Familie; es ermöglicht die direkte Diffusion von niedermolekularen gelösten Stoffen zwischen benachbarten Zellen. Es wurde berichtet, dass Connexin 43 von differenzierten Epithelzellen exprimiert wird , und das Fehlen dieser interzellulären Kommunikationsmoleküle kann ein Merkmal epithelialer Stammzellen sein.

In unseren Ergebnissen exprimierte ein größerer Prozentsatz der Zellen p63 und ABCG2, während nur wenige Zellen die Differenzierungsmarker K3 / K12 und CX43 exprimierten. Daher zeigten menschliche limbale epitheliale Stammzellen in SR-serumfreiem Medium ähnliche Phänotypen und behielten im Vergleich zu FBS-Medium undifferenzierte Bedingungen bei.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass unser neuartiges serumfreies Medium unter Verwendung von KnockOut SR anstelle von FBS das Wachstum und die Proliferation menschlicher Hornhautepithelzellen aufrechterhält und epitheliale Stammzellen in ihrem undifferenzierten Phänotyp beibehält. Diese neuartige serumfreie Kulturmethode ist gut definiert und relativ einfach zu kontrollieren. Es hat großes Potenzial, in der Klinik limbale Epithelzelltransplantation und Geweberegeneration verwendet werden.

Konkurrierende Interessen

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden Interessen haben.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium der Jilin University und der National Natural Science Foundation of China (NSFC 30500548) unterstützt.