Análisis comparativo de Suero KnockOut™ con Suero Fetal Bovino para el Cultivo a Largo Plazo In Vitro de Células Epiteliales Limbales Humanas

Resumen

Las células epiteliales limbales se pueden mantener en una capa alimentadora 3T3 con medio de cultivo complementado con suero fetal bovino, y estas células se han utilizado para tratar con éxito la deficiencia de células madre limbales. Sin embargo, el suero fetal bovino contiene componentes desconocidos y muestra variaciones cuantitativas y cualitativas de lote a lote. Para mejorar la condición de cultivo, se investigó el reemplazo de suero KnockOut definido para reemplazar el suero fetal bovino para el cultivo de células epiteliales limbales humanas. Se cultivaron células epiteliales limbales primarias humanas en suero KnockOut y suero fetal bovino suplementado, respectivamente. La tasa de crecimiento celular, la expresión génica y el mantenimiento de las células madre epiteliales limbales se estudiaron y compararon entre estos dos grupos. Las células epiteliales limbales primarias humanas se aislaron y se cultivaron con éxito en serie en este novedoso medio suplementado con suero KnockOut; la proliferación celular y el mantenimiento de células madre fueron similares a los de las células cultivadas en un medio suplementado con suero fetal bovino. Estos datos sugieren que este medio suplementado con suero KnockOut es un reemplazo eficiente del medio tradicional suplementado con suero fetal bovino para el cultivo de células epiteliales limbales, y este medio tiene un gran potencial para el mantenimiento a largo plazo de las células epiteliales limbales, el trasplante de células madre epiteliales limbales y la regeneración de tejidos.

1. Introducción

Las células madre epiteliales corneales se encuentran en la capa basal del limbo, una estructura corrugada y pigmentada llamada empalizadas de Vogt . Estas células madre sostienen la renovación continua del epitelio corneal durante toda la vida y reemplazan las células epiteliales corneales dañadas o perdidas . La deficiencia de células madre limbales (LSCD) y las enfermedades de la superficie ocular asociadas se pueden tratar con éxito utilizando autoinjerto epitelial limbal cultivado . El éxito de estos tratamientos quirúrgicos depende de la expansión eficiente de las células madre epiteliales limbales, que en la mayoría de los casos involucraron la capa alimentadora 3T3 y el suero fetal bovino (FBS). El sistema de cultivo de capas alimentadoras 3T3 fue establecido por Rheinwald y Green y se ha utilizado con éxito para expandir las células epiteliales de la piel humana, el folículo piloso, el limbo, la conjuntiva y el tejido de la mucosa oral . Sin embargo, FBS no está bien definido, y siempre muestra variaciones cuantitativas y cualitativas de lote a lote . El FBS también contiene componentes xenogénicos potencialmente dañinos, que pueden estimular reacciones inmunológicas y transmitir enfermedades animales y patógenos . Con todas estas preocupaciones, existe una creciente necesidad de desarrollar un medio de cultivo bien definido para reemplazar el medio tradicional complementado con FBS.

Actualmente existen ciertos medios alternativos sin suero para el crecimiento de células epiteliales, como el Medio sin Suero definido de Queratinocitos (KSFM™, Invitrogen, EE.UU.), el medio de crecimiento de queratinocitos (KGM™, Clontech, EE. UU.), Epilife™ (Invitrogen, EE. UU.) y los medios dirigidos a células Progenitoras (PCT) (CellnTEC™, Suiza). Se ha demostrado que estos productos apoyan la expansión de las células epiteliales de la córnea. Sin embargo, todavía necesitan suplementos de productos indefinidos, como el extracto de hipófisis bovina (BPE) o la albúmina sérica humana (HAS). Y la mayoría de estos medios requieren una alta densidad de siembra celular, lo que puede no ser práctico para la expansión de las células epiteliales corneales humanas. Además, las células madre epiteliales corneales, que se detectan como holoclonas en el sistema de cultivo 3T3, no pudieron mantenerse en este medio de cultivo libre de suero a largo plazo . Hasta la fecha, no existe un medio libre de suero definido que pueda apoyar la expansión de las células madre epiteliales corneales a largo plazo.

El reemplazo sérico KnockOut (SR) es una formulación definida sin suero, que fue diseñada para reemplazar directamente las FBS para el mantenimiento de células madre embrionarias (ESC) y células madre pluripotentes inducidas (IPSC). Se ha demostrado que KnockOut SR proporciona condiciones de crecimiento consistentes para el cultivo de células ES e iPSC, y las células ES cultivadas en medio suplementado con KnockOut SR están sustancialmente menos diferenciadas que las cultivadas en medio suplementado con FBS, y la transmisión de la línea germinal no se ve comprometida en lo más mínimo. Dadas las similitudes en los métodos de cultivo de células epiteliales y células ES, y a la luz del hecho de que el SR KnockOut reemplaza el FBS en el cultivo de células ES, aquí se plantea la hipótesis de que el SR KnockOut podría usarse para reemplazar el FBS en el cultivo de células epiteliales limbales.

2. Materiales y reactivos

Se compraron platos de cultivo celular, frascos, tubos de centrífuga y pipetas serológicas a Becton Dickinson (Franklin Lakes, NJ; http://www.bd.com/). Medio de Águila Modificada de Dulbecco (DMEM), F-12 de Ham, HEPES, penicilina y estreptomicina, L-glutamina, tripsina-0 al 0,05%.Solución EDTA al 02%, kit Superíndice III y kit RNeasy™ se adquirieron de Invitrogen-GIBCO BRL (Grand Island, NY; http://www.invitrogen.com/). El suero fetal bovino (FBS) se compró a Hyclone (Logan, UT; http://www.hyclone.com/). Se obtuvieron fibroblastos NIH 3T3 de ratón (ATCC CCL 92) de una Colección de Cultivos de Tipo Americano (Rockville, MD; http://www.atcc.org/). Dispase II era de Roche. El anticuerpo monoclonal (mAb) contra ABCG2 (clon BXP-21) y la conexina 43 provenían de Millipore; p63 (clon 4A4), K5 y K19 provenían de Santa Cruz; K3 mAb (clon AE5) provenía de ICN Pharmaceuticals (Costa Mesa, CA; http://www.mpbio.com/). El anticuerpo secundario conjugado Alexa Fluor 568 anti-ratón de cabra fue de Invitrogen-GIBCO BRL (Grand Island, NY; http://www.invitrogen.com/). Los kits GeneAmp RNA-PCR y Taqman Universal PCR Master Mix AmpErasa UNG fueron de Applied Biosystems (Foster City, CA; http://www.appliedbiosystems.com/). Mitomicina C, insulina bovina, transferrina humana, hidrocortisona, factor de crecimiento epidérmico humano (EGF), toxina del cólera y otros reactivos eran de Sigma-Aldrich (St.Louis; http://www.sigmaaldrich.com/).

2.1. Aislamiento y Cultivo de Células Epiteliales Limbales Humanas

Los anillos córneo-limbales se recolectaron de cinco donantes sanos justo después del trasplante de córnea, se solicitó el consentimiento informado y el protocolo de recolección de muestras fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional (IRB) de la Universidad de Jilin. Los anillos limbales de córnea frescos se trataron con Dispase II al 0,25% a 4°C durante la noche, y la capa epitelial se eliminó del tejido estroma subyacente y se trató con EDTA al 0,05% tripsina-0,02% a 37°C durante 15 minutos. La actividad de la tripsina se neutralizó con un 10% de FBS y se recolectaron células epiteliales limbales disociadas y se centrifugaron a 1.500 rpm durante 5 minutos. La viabilidad de las células epiteliales se determinó mediante azul de tripano, excluyendo la tinción, y el número de células se contó mediante hemocitómetro.

Los fibroblastos 3T3 de ratón se mantuvieron en el Medio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM, glucosa alta) suplementado con 10% de FBS, L-glutamina (2 mm) y penicilina-estreptomicina (50 UI/ml) y se cultivaron con 5% de CO2 y atmósfera humidificada. Las células 3T3 se subcultivaron cada 6 días al alcanzar el 80-90% de confluencia. Las células 3T3 se mantuvieron en serie, y solo las células antes del paso 20 se utilizaron para la preparación de la capa de alimentación. Para preparar la capa alimentadora, las células 3T3 confluentes se trataron con mitomicina C (10 µg/mL) durante 2 horas a 37°C, se lavaron con PBS dos veces y se trataron con tripsina al 0,05% durante 5 minutos a 37°C. Los fibroblastos 3T3 se recolectaron y platearon a una densidad de 30.000 células/cm2 un día antes de sembrar las células epiteliales.

Se cultivaron células epiteliales limbales humanas en la capa alimentadora 3T3 utilizando un medio de DCP o un medio de reemplazo sérico (SR). El medio FAD es una mezcla de DMEM y medio F-12 de Ham (1 : 1) que contiene un 10% de suero fetal bovino, L-glutamina (2 mm) y penicilina-estreptomicina (50 UI/mL), factor de crecimiento epidérmico (10 ng/mL), insulina (5 µg/mL), adenina (0,18 mM), hidrocortisona (0,4 µg/mL), toxina del cólera (0,1 nM) y triyodotironina (2 nM). El medio SR es una mezcla de DMEM y medio F-12 de Ham (1 : 1) que contiene reemplazo sérico KnockOut SR al 10%, L-glutamina (2 mm) y penicilina-estreptomicina (50 UI/ml), factor de crecimiento epidérmico (10 ng/mL), insulina (5 µg/mL), adenina (0,18 mm), hidrocortisona (0.4 µg/ml), toxina del cólera (0,1 nM), triyodotironina (2 nM), transferrina (5 µg/mL) y selenio (5 ng/ml). Las células epiteliales limbales se sembraron en la capa de alimentación 3T3 a una densidad de 6.000 células/cm2 y se cultivaron con un 5% de CO2 y atmósfera humidificada. El medio FAD se cambiaba cada 3 días, mientras que el medio SR se cambiaba cada 2 días.

2.2. Ensayo de Eficiencia Formadora de colonias (EFC)

Para el ensayo EFC, se colocaron 200 células epiteliales limbales humanas procedentes de cultivos de DCP o SR en una placa de petri de 100 mm que contenía una capa alimentadora 3T3 tratada con mitomicina C y se cultivaron como se describió anteriormente. Después de 12 días de cultivo, los platos se fijaron con 10% de formalina durante 30 minutos a temperatura ambiente y se teñieron con 1% de rodamina B durante otros 30 minutos. Después de lavarse con agua destilada, se contaron y analizaron los números de colonias. La eficiencia de formación de colonias se expresó como el número de colonias formadas dividido por 200.

2.3. Ensayo de duplicación de la población celular

Las células epiteliales limbales se mantuvieron en la capa alimentadora 3T3 tratada con mitomicina C utilizando el medio FAD o el medio SR. Las células epiteliales se tripsinizaron al alcanzar una confluencia del 80-90% y se pasaban a una densidad de 6.000 células / cm2. Las culturas se mantuvieron en serie durante 10 pasajes. En cada pasaje, se recolectaron células epiteliales limbales y se contó el número de células. El número de duplicaciones de población (PD) para cada pasaje se calculó de acuerdo con la siguiente fórmula: , donde representa el número total de células obtenidas en cada pasaje y representa el número de células de recubrimiento al principio.

2.4. Extracción de ARN y Reacción Cuantitativa en Cadena de Polimerasa en Tiempo Real

Para evaluar el nivel de expresión génica de las células epiteliales limbales, se realizó PCR y PCR en tiempo real. El ARN total se extrajo de las células epiteliales corneales utilizando el kit RNeasy siguiendo las instrucciones del fabricante. El ARN fue cuantificado por su absorción a 260 nm y almacenado a -80°C. Para sintetizar los ARN CD, se utilizó 1 µg de ARN total con el kit de Transcripción inversa Superíndice III. La PCR se realizó utilizando la mezcla maestra de PCR de platino (Tecnología Life); y la PCR en tiempo real se realizó utilizando la mezcla Maestra de PCR Verde SYBR (Roche) con los cebadores descritos anteriormente . Las reacciones de PCR en tiempo real se realizaron por triplicado con un paso de activación inicial a 95°C durante 3 minutos, seguido de 45 ciclos: 95°C durante 30 segundos, 60°C durante 30 segundos y 72°C durante 40 segundos. La expresión génica relativa se calculó normalizando la diferencia en el valor umbral del ciclo (delta Ct), valores de los genes al valor delta Ct de la gliceraldehídos-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH).

2.5. Tinción inmunofluorescente

Se sembraron células epiteliales limbales humanas en portaobjetos de cultivo con capa alimentadora 3T3 en medio FAD o medio SR. Tres días después de la siembra, los cultivos se fijaron con paraformaldehído al 4% o acetona fría a 4°C durante 10 minutos. Después de lavarse con PBS dos veces, las células se bloquearon con suero de cabra al 5% en PBS durante 30 minutos. Los anticuerpos primarios de ratón contra p63 (1 : 200, 4A4, Santa Cruz), ABCG2 (1 : 30, BXP-21, Milipora), K3 (1 : 400, Milipora) y connexin 43 (1 : 1000, Milipora) se aplicaron e incubaron durante la noche a 4°C. El anticuerpo secundario conjugado Alexa Fluor 568 se aplicó durante 1 hora después del lavado con PBS dos veces. Los núcleos celulares fueron luego contra-teñidos con Hoechst 33342 (1 µg/ml en PBS) durante 20 minutos. Después de lavarse con PBS 3 veces, el cultivo celular se montó con medio de montaje (Laboratorios Vectoriales, Burlingame, CA) y se examinó bajo un microscopio fluorescente (BX50; Olympus, Tokio, Japón).

2.6. Análisis de Western Blot

Las células epiteliales limbales cultivadas se lisaron con tampón RIPA (10 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl, 1% de desoxicolato de sodio, 1% Tritón X-100, 1 mM EDTA y cóctel inhibidor de proteasa; Roche Diagnostics) en hielo durante 30 minutos. La concentración de proteínas se cuantificó utilizando el ensayo de proteína de ácido biciconínico (BCA) (Pierce, Rockford, IL). Los lisados celulares totales (40 µg) se electroforizaron en gel de gradiente SDS-PAGE al 12%, se transfirieron a la membrana de nitrocelulosa (Bio-Rad), se bloquearon con leche desnatada al 5% en solución salina tamponada Tris (TBS) durante 1 hora y se probaron con anticuerpos de ratón contra el antígeno del núcleo de células proliferantes (PCNA, Santa Cruz, CA), ABCG2 (BXP-21, Milipora) o p63 (4A4, Santa Cruz, CA) durante la noche a 4°C. las membranas se lavaron tres veces con TBS, se incubaron con IgG anti-ratón de cabra (1 : 5000, conjugado con HRP, Santa Cruz, CA) o IgG anti-cabra de conejo (1 : 5000, conjugado con HRP, Santa Cruz, CA) durante 1 hora a temperatura ambiente, y desarrollado con sustratos quimioluminiscentes mejorados (Pierce Biotechnology, Rockford, IL). Los niveles de expresión de ABCG2, PCNA y p63 se midieron mediante medición de intensidad semicuantitativa y se normalizaron a nivel de GAPDH que sirvió como control interno.

2.7. Estadísticas

Resumen de datos de CFE y pliegue relativo de PCR en tiempo real se reportó como medias ± DE y se comparó utilizando la prueba de emparejamiento no emparejado de Student con Microsoft Excel (versión 2003 / XP). Los resultados de las pruebas se notificaron como valores de dos colas, donde se consideraron estadísticamente significativos.

3. Resultados

3.1. El Fenotipo de Células Madre Epiteliales Corneales en Medio RS

Se recolectaron un total de 5 tejidos de anillo córnea-limbal de donantes en el rango de edad de 32-65 años. Estos tejidos se conservaron y procesaron dentro de las 24 horas posteriores a la cosecha. El cultivo de células epiteliales corneales primarias humanas también se estableció con éxito en medio de DCP (Figuras 1(a) y 1(b)) y en medio SR (Figuras 1(c) y 1(d)). Las células epiteliales corneales mantenidas en la capa de alimentación media + 3T3 de SR mostraron una morfología de pequeño tamaño y alta relación núcleo/citoplasma, que era la morfología típica de las células epiteliales indiferenciadas, y las células planas escamosas de gran diferenciación rara vez se observaron (Figura 1(c)). Las células epiteliales mantenidas en el medio SR comenzaron a formar colonias 3 días después de la siembra (Figura 1(c)). Los tamaños de estas colonias eran similares a los formados dentro de la capa alimentadora media + 3T3 de DCP (Figura 1(a)), pero estas colonias estaban menos compactadas que las de la capa alimentadora de DCP + 3T3. En 7 días, las células epiteliales alcanzaron la confluencia en el RS medio con el tamaño pequeño uniforme (Figura 1 (d)), lo que también se observó en el cultivo de DCP (Figura 1(b)). En este estudio, las células epiteliales corneales humanas pudieron derivarse y mantenerse en una capa alimentadora de medio SR + 3T3 para los cinco donantes. Para el cultivo a largo plazo, las células epiteliales corneales humanas se subculturaron en serie en una capa alimentadora de medio SR + 3T3 durante más de 10 pasajes (). Durante cada paso, las células se tripsinizaron y recogieron cuando las células alcanzaron la confluencia del 80-90%; se calcularon los números de células para el ensayo de duplicación de la población. El resultado muestra que el rendimiento de células epiteliales del medio SR es cercano al de las células cultivadas en medio FAD, como se muestra en la Figura 2(a), y estos datos son similares a los de informes anteriores . En resumen, los datos presentados aquí muestran que el medio de cultivo SR + la capa alimentadora 3T3 tratada con mitomicina C apoya el crecimiento y la proliferación clonales de células epiteliales corneales humanas.

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Figura 1

La cultura de limbo humanos de las células epiteliales en el SR medio. a) Las células epiteliales de la córnea humana formaron colonias muy compactas en medio de DCP después de sembrar las células durante 3 días. (b) Después de 7 días, las células epiteliales alcanzaron la confluencia en el DCP medio con el tamaño pequeño uniforme. c) Las células epiteliales corneales humanas formaron colonias dentro del medio SR, que eran similares a las formadas dentro del medio FAD, pero estas colonias estaban menos compactadas que las del FAD. (d) Después de 7 días, las células epiteliales alcanzaron la confluencia en el medio SR con un tamaño pequeño uniforme que fue similar a las del aumento original del cultivo de DCP: (a) ×10; (b) ×10 (barras de escala: 100 µm).

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Figura 2

Comparación de la celda de duplicación de la población (DP) y formadoras de colonias eficiencia (CFE) de limbo humanos de las células epiteliales cultivadas en SR y FAD medios de comunicación. a) Las células epiteliales limbales humanas se subculturaron en serie en medio SR y medio FAD durante 10 pasajes (); se calcularon y trazaron el número de duplicaciones de la población celular (DP) y el DP acumulado. La PD se calculó de acuerdo con la siguiente fórmula: , donde representa el número total de celdas obtenidas en cada pasaje y representa el número de celdas de recubrimiento al comienzo de cada pasaje. b) Para analizar la EFC, se sembraron células epiteliales limbales a una densidad de 200 células por placa de petri de 100 mm en medios SR y FAD y se dejó crecer durante 12 días. (c) Los valores de CFE para células epiteliales en medios SR y DCP fueron y , respectivamente. No se encontraron diferencias de EFC entre el medio de RS y el grupo medio de DCP (, ). (d) Porcentaje de área colonizada en MODA era similar a la de SR medio. Las células epiteliales limbales mantenidas en el medio SR mostraron una EFC y un tamaño de colonia similares en comparación con las células mantenidas en el medio DCP.

3.2. Ensayo CFE

A continuación examinamos y comparamos el CFE de células epiteliales corneales cultivadas en medios FAD y SR. Para el análisis de la EFC, se recolectaron y sembraron células epiteliales corneales cultivadas en medios SR y FAD a una densidad de 200 células por placa de petri de 100 mm, que se presiembra con capa alimentadora 3T3 tratada con mitomicina C, y se permitió que este cultivo creciera durante 12 días. Las células epiteliales de la córnea comenzaron a formar colonias 5-7 días después del inicio del cultivo. Como se muestra en la Figura 2 (b), después de un cultivo de 12 días, las células epiteliales corneales mantenidas en el medio SR mostraron una EFC y un tamaño de colonia similares en comparación con las células mantenidas en el medio DCP. El valor de CFE para células epiteliales en medios SR y DCP fue y, respectivamente (Figura 2 (c)). El análisis estadístico demostró que no había diferencias significativas en la eficiencia de formación de colonias () y el área promedio de las colonias () entre los medios SR y FAD (Figura 2(c)). Cuantificamos el porcentaje de los tipos de colonias en función del área de las colonias. Los resultados mostraron que el porcentaje de colonias abortivas (área de colonia <1 mm2) formadas en medio SR fue similar al del medio FAD (). De manera similar, el porcentaje de colonias grandes (área de colonia >4 mm2) formadas en el medio SR fue cercano al del medio FAD () (Figura 2(d)). Estos resultados indican que las células epiteliales corneales cultivadas en medio SR poseen un mayor grado de potencial proliferativo similar cuando se comparan con las células cultivadas en medio FAD.

3.3. Análisis de PCR y PCR en Tiempo Real

Para estudiar la expresión génica, se realizaron PCR y PCR en tiempo real en células epiteliales cultivadas en medios FAD y SR. El gen de limpieza GAPDH se utilizó como control interno. Los datos de la PCR muestran que las células cultivadas tanto en el medio FAD como en el medio SR muestran una expresión de transcripción de alto nivel del marcador proliferativo PCNA. Las células en ambos medios muestran una expresión positiva de citoqueratina 3 y citoqueratina 12, que es consistente con su origen limbo. La expresión positiva del marcador de células epiteliales de la capa basal, citoqueratina 15, también se observó en ambos cultivos. La expresión de ABCG2 y ΔNp63α se detectó en ambos cultivos, aunque la expresión de ABCG2 disminuyó ligeramente después del cultivo primario en medio SR. El bajo nivel de expresión de conexina 43 se observó en ambos cultivos e implicó un bajo nivel de diferenciación de células epiteliales en ambos medios. Para la PCR en tiempo real, el análisis cuantitativo del nivel de ARNm mostró que no había diferencia significativa de expresión () de p63 y ABCG2 entre las células epiteliales cultivadas en medios FAD y SR (Figura 4(a)). También se realizó un análisis en tiempo real del marcador de diferenciación epitelial corneal citoqueratina 3 y citoqueratina 12. Ambos marcadores fueron apenas detectables en cultivos celulares FAD y SR, y, sorprendentemente, no hay diferencia significativa () en el nivel de expresión entre estos dos cultivos.

3.4. Tinción inmunofluorescente

Para confirmar que las células epiteliales cultivadas en medio SR mantenían el tallo y el estado indiferenciado, se realizó una tinción inmunofluorescente de varios marcadores de células madre epiteliales de proliferación, diferenciación y supuestos. Como se muestra en la Figura 4, en el medio SR, la mayoría de las células epiteliales mostraron una morfología pequeña y uniforme, y la mayoría de las células se tiñeron fuertemente con p63, el marcador de células madre epiteliales putativo. También se observaron células teñidas positivas a ABCG2 en una distribución irregular dentro de las colonias de células epiteliales limbales. Las células mantenidas en el medio SR estaban débilmente teñidas para la conexina 43 y la citoqueratina 3. La baja expresión de estos dos marcadores de diferenciación sugiere un bajo nivel de diferenciación de células epiteliales en el cultivo celular. El estilo de tinción similar también se observó en células mantenidas con medio de DCP(Figura 4 (b)). Estos datos implican que las células epiteliales limbales humanas cultivadas en RS media mantuvieron una expresión de alto nivel de marcadores de células madre epiteliales putativos, mientras expresaban un bajo nivel de marcadores de diferenciación.

3.5. Western Blot

Para confirmar dos veces los resultados cuantitativos de expresión génica y tinción inmunofluorescente, se evaluó la expresión de marcadores potenciales de células madre epiteliales (p63 y ABCG2) y marcador de proliferación (PCNA) utilizando western blot. Utilizando el anticuerpo monoclonal p63 (clon 4A4, Santa Cruz), se detectó la proteína p63 (70 KD, isoforma ΔNα) a un alto nivel de expresión en el medio SR. Se detectó la expresión de ABCG2 (70 KD) en cada paso de células cultivadas en medio SR. También se detectó PCNA, marcador de proliferación, en células cultivadas en medio RS (Figura 3 c)). Y los niveles de expresión de p63, ABCG2 y PCNA fueron similares en 10 pasajes con medición de intensidad semicuantitativa(Figura 3 (d)) utilizando GAPDH como control interno.

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Figura 3

la expresión de Genes y la expresión de la proteína en las células epiteliales del limbo humanos. a) Análisis de la expresión génica de células epiteliales limbales humanas. Los datos de PCR muestran que las células cultivadas en medio FAD y medio SR muestran una expresión de alto nivel de transcripción de proliferación PCNA en P1, P4, P7 y P10. Las células en ambos medios muestran una expresión positiva de citoqueratina 3 y citoqueratina 12, lo que implica su origen limbo. La expresión positiva del marcador de células epiteliales de la capa basal, citoqueratina 15, también se observó en ambos cultivos. La expresión de ABCG2 y ΔNp63α se detectó en ambos cultivos; se observó que su expresión disminuyó ligeramente después del paso 7 (P7) en ambos medios de cultivo. Se observó un bajo nivel de expresión de conexina 43 (Cx43) en ambos cultivos e implicó un bajo nivel de diferenciación de células epiteliales en ambos medios. b) Análisis cuantitativo de PCR en tiempo real de células epiteliales limbales humanas cultivadas en medios SR y DCP. Se realizó PCR en tiempo real en células epiteliales cultivadas utilizando medios de DCP y SR. El gen de limpieza GAPDH se utilizó como control interno. El análisis de los marcadores de células madre epiteliales limbales p63 y el ARNm ABCG2 encontró que no había diferencia significativa (, ) en la expresión entre las células epiteliales cultivadas en medios FAD y SR. Se realizó un análisis en tiempo real del marcador de diferenciación epitelial corneal citoqueratina 3 y conexina 43. Todos estos marcadores eran apenas detectables en cultivos celulares FAD y SR, y, sorprendentemente, no hay diferencia significativa (,) de nivel de expresión entre estos dos cultivos. Todos los experimentos de PCR en tiempo real se llevaron a cabo por triplicado. c) Ensayo de Western blot de células epiteliales limbales humanas cultivadas en medios FAD y SR. La expresión del marcador de proliferación (PCNA) y los posibles marcadores de células madre epiteliales (p63 y ABCG2) se evaluaron mediante western blot. Utilizando el clon de anticuerpos monoclonales 4A4, se detectó la proteína p63 (70 KD) a un nivel de expresión alto en el medio SR. Se detectó la expresión de ABCG2 en cada paso de células cultivadas en medio RS. También se detectó PCNA, el antígeno del núcleo celular, un marcador de proliferación celular, en células epiteliales cultivadas en medio RS. d) La expresión de ABCG2, p63 y PCNA se cuantificó y trazó mediante medición de intensidad semicuantitativa. Se midió la densidad de blot de ABCG2, p63 y PCNA y se normalizó al nivel de GAPDH.

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Figura 4

la Expresión de las células madre epiteliales de políticas y de los marcadores de diferenciación en el limbo humanos de las células epiteliales. Las células epiteliales limbales humanas se tiñeron fuertemente con ABCG2 y p63 (verde) en medios SR y DCP. Las células mantenidas en los medios SR y FAD mostraron tinción débil para la conexina 43 (Cx43) y la citoqueratina 3 (K3). a) Medio RS y b) medio DCP. Ampliación original: a) ×10; b) ×10 (barras de escala: 100 µm). Los estudios se realizaron por triplicado, y aquí se muestran cifras representativas.

4. Discusión

Las células epiteliales cultivadas en la capa alimentadora 3T3 se han derivado con éxito y se han utilizado para el tratamiento de diversas situaciones clínicas, como quemaduras graves, úlceras en el pie diabético, defectos de la piel y defectos de la mucosa oral . El primer trasplante de células madre epiteliales limbales fue descrito en 1997 por Pellegrini et al. . Durante las últimas décadas, se han desarrollado varios métodos de cultivo diferentes, incluido el cultivo de células epiteliales limbales en membrana amniótica humana (HAM) con o sin capa alimentadora 3T3 , el cultivo de células epiteliales en placas que responden a la temperatura y el cultivo de células epiteliales con medio de cultivo comercial libre de suero. Como un informe reciente indica que el resultado clínico del trasplante de células epiteliales de córnea/limbo depende de si las células madre limbales se conservan en el cultivo celular, se señaló que las holoclonas solo se retienen en el sistema de cultivo FAD + 3T3 . Como este protocolo de cultivo implica el uso de FBS, hay crecientes preocupaciones de seguridad de que el FBS es un producto animal mal definido y tiene el potencial de transmitir enfermedades derivadas de animales a los pacientes . Por lo tanto, cada vez es más necesario desarrollar un medio de cultivo libre de productos animales y de BFS para sustituir al medio tradicional de DCP .

En este estudio, desarrollamos un novedoso medio de cultivo sin suero, en el que KnockOut SR reemplazó a FBS. Los fenotipos de células madre epiteliales limbales en este nuevo medio de cultivo libre de suero se evaluaron mediante inmunotinción con anticuerpos para los marcadores de células madre propuestos (p63, ABCG2) y los marcadores de diferenciación (citoqueratina 3, conexina 43).

El factor de transcripción nuclear p63 se propuso previamente como un marcador de células madre epiteliales, y ΔNα es la isoforma predominante de las isoformas p63 en estas células . Nuestros resultados son consistentes con estos informes anteriores; el p63 nuclear se expresó fuertemente en el cultivo de células limbales, lo que se demostró mediante inmunotinción, PCR en tiempo real y western blot. La presencia de p63 en cultivos celulares limbales indica su alto potencial proliferativo y de autorrenovación. ABCG2, un miembro de los transportadores de casete de unión a ATP (ABC), originalmente conocidos como proteína 1 resistente al cáncer de mama (BCRP1), se ha propuesto como otro marcador de células madre putativo para las células madre adultas, incluidas las células madre epiteliales limbo . La alta expresión de ABCG2 en el medio SR se evidenció por inmunotinción y PCR en tiempo real.

K3 y K12 son bien conocidos como marcadores específicos de la córnea . Consistentemente, nuestros resultados de inmunotinción y PCR en tiempo real mostraron que las células eran K3 y K12 negativas, confirmando su origen limbo. La conexina 43 es un miembro de la familia de proteínas de unión de brecha; permite la difusión directa de solutos de bajo peso molecular entre células vecinas. Se informó que la conexina 43 se expresaba por células epiteliales diferenciadas, y la ausencia de estas moléculas de comunicación intercelular puede ser una característica de las células madre epiteliales.

En nuestros resultados, un mayor porcentaje de células expresaban p63 y ABCG2, mientras que pocas células expresaban marcadores de diferenciación K3 / K12 y CX43. Por lo tanto, las células madre epiteliales limbales humanas en el medio libre de suero SR mostraron fenotipos similares y mantienen condiciones indiferenciadas, en comparación con el medio FBS.

En conclusión, utilizando KnockOut SR en sustitución de FBS, nuestro novedoso medio sin suero mantiene el crecimiento y la proliferación de las células epiteliales corneales humanas y retiene las células madre epiteliales en su fenotipo indiferenciado. Este novedoso método de cultivo sin suero está definido por suplementos y es relativamente fácil de controlar. Tiene un gran potencial para ser utilizado en trasplantes clínicos de células epiteliales limbales y regeneración de tejidos.

Intereses contrapuestos

Los autores declaran que no tienen conflictos de intereses.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por una subvención de la Universidad Jilin y la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (NSFC 30500548).