Ahora capaz de sintetizar los cinco nucleótidos (un colega de la Universidad de Washington había encontrado una enzima que fabricaba el nucleótido de timina), Kornberg se sintió listo para buscar las enzimas que ensamblan nucleótidos en ARN o ADN. Durante un corto tiempo, el grupo de investigación trabajó en ambos ácidos nucleicos, pero en 1955 el laboratorio de Severo Ochoa anunció su descubrimiento de una enzima que sintetizaba ARN (aunque resultó ser solo una cadena similar al ARN).; Kornberg entonces centró todos sus esfuerzos en la síntesis de ADN. Para encontrar la enzima crucial en los extractos de células rotas de la bacteria E. coli, agregó ATP, además de los nucleótidos apropiados, etiquetados con isótopos radiactivos para rastrear su incorporación a la cadena de ácido nucleico, y luego agregó ADN como imprimación para la cadena. Tomó muchos meses lograr un rastro confiable de la síntesis con timidina radiactiva, de modo que se pudiera rastrear la actividad de la enzima, pero esto se logró en 1956. A continuación, Kornberg tuvo que aislar y purificar la enzima de ensamblaje de ADN, a la que llamó ADN polimerasa, del extracto de células bacterianas, separándola de todas las demás proteínas (incluidas muchas enzimas que interfieren con la síntesis) utilizando una amplia gama de procedimientos. En un año, Kornberg fue capaz de sintetizar ADN de una variedad de fuentes con esta polimerasa. Dos artículos que describen este trabajo fueron enviados al Journal of Biological Chemistry en octubre de 1957. Los árbitros de la JBC, sin embargo, rechazaron los artículos; algunos se opusieron a llamar al producto «ADN», prefiriendo el término técnicamente preciso pero engorroso, «polideoxirribonucleótido».»Uno insistió en que se debe demostrar que el producto tiene actividad genética para calificar como ADN (un criterio cumplido por muy pocos investigadores en ese momento). Disgustado, Kornberg retiró inicialmente los periódicos, pero fueron publicados en la edición de mayo de 1958 de JBC, después de que un nuevo editor asumiera su cargo.
