Base estructural para el reconocimiento de la cadena Ub enlazada a K48 por el receptor proteasomal Rpn13

La cadena Ub enlazada a K48 fluctúa dinámicamente entre múltiples conformaciones

Utilizamos smFRET para evaluar la disposición espacial de las dos subunidades Ub en K48-diUb libre de ligandos. Se introdujeron fluoróforos, Alexa Fluor 488 y Cy5, en el extremo N de la Ub distal y en el extremo C de la Ub proximal (Suplemento Fig. S1a). Utilizando el algoritmo de maximización de expectativas 32, el perfil smFRET de K48-diUb se puede describir mejor como tres especies de TRASTES superpuestas(Fig. S2). Las especies de TRASTE alto, medio y bajo se centran en eficiencias de TRASTE de 0,74, 0,57 y 0,23, con poblaciones respectivas de ~48, ~39 y ~13% (Fig. 1a). Las distancias de TRASTE entre el centro de fluoróforos se calculan en ~43, ~50, ~64 Å, respectivamente. Por lo tanto, las especies de TRASTE alto, medio y bajo se pueden asignar a estados compactos, semiabiertos y abiertos que son preexistentes para K48-diUb.

a Con fluoróforos conjugados en el sitio de 76 C de la Ub proximal y 0 C de la Ub distal (cf. Suplemento Fig. S1a), el perfil smFRET puede ajustarse a tres especies de TRASTES superpuestas. A menos que se indique lo contrario, este par de sitios de conjugación se utilizan para todos los estudios smFRET de K48-diUb. La especie de TRASTE alto (color rojo) corresponde a un estado compacto preexistente. b-d El estado compacto se puede enriquecer selectivamente con Rpn13 de longitud completa, y el aumento de población se puede ajustar a una isoterma de unión. e-g El estado compacto se puede enriquecer selectivamente con Rpn13NTD, y el aumento de población se puede ajustar para ser una isoterma de unión. h Con los fluoróforos conjugados en sitios N25C/N25C, Rpn13NTD puede enriquecer selectivamente el estado compacto preexistente del diUb distal de K48-tetraUb(cf. Suplemento Fig. S5), que proporciona una afinidad vinculante. Las poblaciones de la especie smFRET se promedian en tres mediciones independientes, con los errores indicando 1 DE; los valores de KD se informan como errores de mejor ajuste ± ajuste

La fluctuación conformacional de K48-diUb se ha investigado previamente utilizando smFRET26. En ese estudio, los autores resolvieron dos especies de smFRET para K48-diUb, a saber, especies de TRASTE alto y bajo con eficiencias de TRASTE central de 0,69 y 0,41, respectivamente, además de una especie sin TRASTE. Los autores demostraron que la titulación de una OTUB1 inactivada (OTUB1i), una desubiquitinasa específica para el enlace del isopéptido K4833, enriquece principalmente a las especies de bajo TRASTE. Su observación llevó a la propuesta de que el K48-diUb puede ser reconocido específicamente por OTUB1 a través de un mecanismo de selección conformacional. Aquí repetimos la titulación smFRET, y encontramos que OTUB1i enriquece a las especies de TRASTES medios(Fig. S3a-c). Además, el aumento poblacional de la especie de TRASTE medio tras la titulación de OTUB1i puede ajustarse a una isoterma de unión con un valor KD de 7,7 ± 0.1 µM (Suplemento Fig. S3d), que se aproxima al valor KD previamente informado26. Por lo tanto, las especies de TRASTE medio en el presente estudio deben corresponder a las especies de TRASTE bajo en el estudio anterior, y la discrepancia puede surgir de diferentes eficiencias de conteo de fotones y rutinas de ajuste de trazas de tiempo smFRET.

Para confirmar aún más que el K48-diUb fluctúa entre tres estados conformacionales preexistentes, introdujimos fluoróforos en pares adicionales de sitios de conjugación de fluoróforos (Fig.Suplementaria. S1b-d). Para los sitios alternativos, aunque las eficiencias centrales de las especies de TRASTE difieren, los perfiles de smFRET aún se pueden describir como tres especies de TRASTE superpuestas con poblaciones similares (Fig. S4). Por ejemplo, para los sitios de conjugación de 25 C / 25 C, las especies de TRASTE alto, medio y bajo se centran en eficiencias de TRASTE de 0,68, 0,54 y 0,21, con poblaciones respectivas de ~48%, ~43% y ~9% (Fig. S4d). Por lo tanto, es poco probable que la conjugación de los fluoróforos perturbe la estructura de la proteína, y las mediciones de smFRET han revelado la dinámica conformacional inherente de K48-diUb independientemente del sitio de conjugación, es decir, el K48-diUb se alterna entre tres estados distintos en ausencia de una proteína asociada.

Para evaluar más a fondo si las subunidades Ub en cadenas Ub enlazadas a K48 más largas también fluctúan entre múltiples estados conformacionales, analizamos el perfil smFRET de tetra-ubiquitina enlazada a K48 (K48-tetraUb). Conjugamos los fluoróforos en dos sitios N25C en el diUb distal (con respecto al diUb proximal) de K48-tetraUb. El perfil smFRET también se puede ajustar como tres especies de TRASTES superpuestas (Fig. S5a). Aunque las poblaciones relativas de las tres especies son diferentes de la de un K48-diUb aislado con fluoróforos conjugados en los mismos sitios (Fig. S4d), las eficiencias del TRASTE central de las especies de TRASTE son casi idénticas. Por lo tanto, es probable que los estados conformacionales de la unidad diUb se conserven en una cadena Ub más larga unida a K48, mientras que la diferencia en las poblaciones relativas puede ser el resultado del efecto modulador del diUb proximal.

La especie de alto TRASTE se enriquece selectivamente con Rpn13

Para evaluar la relación entre la dinámica conformacional de la cadena Ub unida a K48 y el reconocimiento Rpn13, titulamos 150 pM K48-diUb marcado con fluoróforo con proteína Rpn13 de longitud completa humana. Curiosamente, tras la adición de Rpn13 de 100 nM, la especie preexistente de alto TRASTE de K48-diUb se enriquece de ~48% a ~57% (Fig. 1a, b), mientras que la población de especies de traste medio y bajo disminuye. La población de especies de alto TRASTE continúa aumentando con más Rpn13 añadido (Fig. 1c), y la isoterma de unión puede ajustarse a un valor KD de 119 ± 24 nM (Fig. 1d).

Se ha demostrado previamente que Rpn13NTD es el principal responsable de la unión de Ub6, 7. Por lo tanto, realizamos la titulación smFRET para K48-diUb marcado con fluoróforo de 150 pM utilizando solo Rpn13NTD que comprende solo los primeros 150 residuos. Rpn13NTD también enriquece selectivamente las especies de alto TRASTE de K48-diUb (Fig. 1e, f). El aumento de la población de especies de traste alto se puede ajustar para proporcionar un valor KD de 33,1 ± 6,9 nM (Fig. 1g), que es un aumento de aproximadamente 4 veces en la afinidad en comparación con Rpn13 de longitud completa. Si los fluoróforos están unidos en sitios de conjugación alternativos (Suplemento Fig. S1b y S4b), la titulación de Rpn13NTD también causa el enriquecimiento de especies de TRASTES equivalentes siguiendo una tendencia similar, proporcionando un valor KD casi idéntico (Fig. S6). Por lo tanto, la aparición de residuos adicionales puede tener un pequeño efecto inhibidor sobre la interacción entre Rpn13NTD y K48-diUb.

Además, se realizó la titulación smFRET para 150 pM K48-tetraUb con fluoróforos conjugados en el diUb distal (Suplemento Fig. S5a). La titulación de Rpn13NTD enriquece selectivamente las especies preexistentes de alto TRASTE del diUb distal marcado con fluoróforo (Fig. S5b-d), y la isoterma de unión puede ajustarse a un valor KD de 214 ± 70 nM (Fig. 1h). La reducción de 7 veces en la afinidad de unión en comparación con la interacción Rpn13NTD: K48-diUb se puede atribuir a la auto-asociación entre el diUb distal y el diub34 proximal, lo que hace que la superficie de unión esté menos disponible para la unión Rpn13. Es importante destacar que para todas las titulaciones smFRET de K48-diUb o K48-tetraUb, la eficiencia central de las especies de TRASTE alto cambia poco en ausencia o presencia de Rpn13 o Rpn13NTD. Esto significa que Rpn13 se une a una conformación preexistente de K48-diUb a través de un mecanismo de selección conformacional, ya sea que K48-diUb sea por sí mismo o parte de una cadena Ub más larga. También significa que la especie de alto TRASTE, es decir, el estado compacto preexistente de K48-diUb, no está completamente cerrada y está lista para interactuar con otras proteínas. Es importante destacar que el enriquecimiento selectivo de las especies de alto TRASTE también indica que Rpn13 debería interactuar con ambas subunidades Ub al mismo tiempo.

Rpn13 se une preferentemente a diUb ligado a K48

Para evaluar la especificidad de unión de Rpn13 para el enlace de K48, evaluamos las afinidades de unión entre Rpn13 y otros tipos de proteínas Ub. Con la titulación de 200 nM Rpn13NTD a 150 pM K48-diUb marcado con fluoróforo, la población de las especies de alto TRASTE aumenta en un 15% de ~48% a ~63% (Fig. 1f). A esta concentración, la unión de K48-diUb aún no está saturada con Rpn13NTD (Fig. 1g) y por lo tanto, la población de las especies de TRASTE alto es sensible a pequeños cambios de la concentración de Rpn13NTD disponible. K48-diUb sin etiqueta puede competir por la unión a Rpn13NTD con K48-diUb con etiqueta de fluoróforo. Con la adición de 150 pM de K48-diUb sin etiquetar, la población de las especies de alto TRASTE disminuye en un 7,5%, lo que corresponde a una inhibición del 50% de K48-diUb marcado con fluoróforo unido a Rpn13NTD (Fig. 2a). Con la adición de 300 pM de K48-diUb sin etiquetar, la población de especies de alto TRASTE disminuye en un 11%, lo que equivale a un total de inhibición del 73% (Fig. 2b). Como tal, tanto el K48-diUb etiquetado con fluoróforo como el no etiquetado compiten por la misma interfaz de unión en Rpn13 con afinidad de unión similar. Esto también significa que la conjugación de los fluoróforos con K48-diUb causa poca perturbación a la interacción entre Rpn13NTD y K48-diUb.

a, b La adición de Rpn13NTD de 200 nM enriquece primero las especies de alto TRASTE de K48-diUb marcado con fluoróforo(cf. Figura 1f), y la adición adicional de 150 pM y 300 pM K48-diUb sin etiquetar disminuye la población de las especies de TRASTE alto. c, d La adición de monómero Ub sin etiquetar de 150 y 300 pM tiene un efecto insignificante en la población de las especies de alto TRASTE. e, f La adición de 150 pm K48-diUb y 150 pM M1-diUb causa una disminución muy pequeña de la población de las especies de alto TRASTE

Además, a la mezcla de Rpn13NTD de 200 nM y K48-diUb marcado con fluoróforo de 150 pM, agregamos monómero Ub sin etiquetar, diubiquitina ligada a K63 o diubiquitina ligada a M1, para evaluar si otros tipos de Ub pueden desplazar a K48-diUb. La población de las especies de alto TRASTE cambia poco con la adición de monómero Ub de 150 o 300 pM (Fig. 2c, d). Con la adición de 150 pm K63-diUb y 150 pM M1-diUb, la población de las especies de TRASTE alto también se mantiene sin cambios dentro del rango de error (Fig. 2e, f). Por otro lado, la titulación directa de Rpn13NTD de 1 µM en K63-diUb y M1-diUb conjugados con fluoróforo causa pocos cambios en sus perfiles smFRET preexistentes (Fig. S7). En conjunto, Rpn13NTD interactúa selectivamente con K48-diUb.

Estructura de solución de Rpn13NTD:Complejo K48-diUb

Aunque ahora hemos demostrado que Rpn13NTD interactúa selectivamente con K48-diUb, solo se ha determinado la estructura compleja entre el monómero Rpn13NTD y Ub6,8. Para comprender cómo las dos subunidades en K48-diUb pueden interactuar simultáneamente con Rpn13NTD, nos propusimos determinar la estructura de solución del complejo Rpn13NTD: K48-diUb mediante resonancia magnética nuclear (RMN). Tras la formación de complejos proteicos, los residuos interfaciales experimentarían un entorno local diferente y, por lo tanto, mostrarían señales de RMN. Encontramos que la titulación de K48-diUb sin etiquetar a Rpn13 marcado con 15N causa grandes perturbaciones de desplazamiento químico (CSP), que involucran principalmente residuos 73-83 y 93-106 (Fig. 3a). Estos residuos forman una superficie contigua en Rpn13, cubriendo un área mayor de lo esperado de la estructura compleja previamente determinada entre Rpn13NTD y el monómero Ub6,7. Por otro lado, titulando Rpn13NTD sin etiquetar a K48-dUb, con Ub 15N etiquetado proximal o distal y la otra subunidad sin etiquetar, los CSP se observan principalmente para residuos en la región de lámina β de ambas subunidades Ub. Algunos de los residuos interfaciales también desaparecieron al formarse el complejo (Fig. 3b, c).

a-CSP promedió más de 1H y 15N de dimensiones de protones de amidas troncales tras la formación del complejo con proteínas etiquetadas con isótopos de 0,2 mM y sin etiquetar. Inserciones: la subunidad etiquetada con 15N se ilustra con una representación de superficie, y los residuos de color rojo tienen CSP por encima de la línea de puntos. d, e Con una sonda paramagnética conjugada en el sitio E24C de la Ub distal, se evaluaron las relaciones de intensidad entre los espectros paramagnéticos y diamagnéticos,y los valores PRE Γ2 para protones de amida troncal de Rpn13NTD marcado con 15N. Cajas grises indicaban residuos con PREs intermoleculares muy grandes. f Con la sonda paramagnética conjugada en el sitio N25C de la Ub proximal, se midieron valores Γ2 para protones de amida de Ub distal marcada con 15N en K48-diUb. Las barras de error indican 1 S. D., y los residuos completamente ampliados en el complejo se denotan con estrellas

El efecto de sobrecarga nuclear (NOE) informa la relación a distancia (<6 Å) entre núcleos. Además, el experimento de RMN medio filtrado de 13C puede proporcionar NOE entre protones unidos a 12C y protones unidos a 13C, es decir, relación de distancia intermolecular. Se obtuvieron NO intermoleculares entre Rpn13NTD y Ub proximal, entre Rpn13NTD y Ub distal, y entre Ub proximal y Ub distal (Suplemento Fig. S8). Además, conjugamos una sonda paramagnética de maleimida-EDTA-Mn2 + en el sitio E24C de la Ub distal y recogimos realce de relajación paramagnética (PRE) para protones de amida troncal de Rpn13NTD, siguiendo el protocolo establecido22,35. Según lo evaluado por la relación de intensidad máxima de espectros paramagnéticos versus diamagnéticos o por la velocidad Γ2 de realce de relajación transversal, los residuos Rpn13 30-42 y 101-106 experimentan un PREs grande con un ensanchamiento severo de la línea (Fig. 3d, e). También conjugamos la sonda paramagnética en el sitio N25C de la Ub proximal y evaluamos la tasa de realce de relajación transversal Γ2 para la Ub distal (Fig. 3f). Se observan grandes valores PRE entre las dos subunidades Ub del K48-diUb libre de ligandos, y la adición de Rpn13NTD aumenta el PRE inter-Ub pero con un perfil PRE similar. Los experimentos PREVIOS a la RMN confirman que Rpn13NTD enriquece el estado compacto preexistente de K48-diUb.

Para refinar el Rpn13NTD:Estructura compleja K48-diUb contra restricciones experimentales, realizamos acoplamiento de cuerpo rígido con libertad de ángulo de torsión dada a los residuos del enlazador diUb y a las cadenas laterales de residuos interfaciales. Para los 20 conformadores de energía más baja, la desviación de la media cuadrada de la raíz (RMS) para los átomos pesados de la columna vertebral de todos los residuos rígidos es de 0,86 ± 0,54 Å (Fig. S9 y cuadro S1). Las dos subunidades Ub de K48-diUb permanecen asociadas en el complejo área de superficie accesible a solventes enterrados (SASA) de ~1130 Å2. Por otro lado, Rpn13NTD se introduce, enterrando ~940 Å2 de SASA con la Ub proximal y ~1300 Å2 de SASA con la Ub distal (Fig. 4a). La estructura compleja entre Rpn13NTD y Ub proximal de K48-diUb en el presente estudio es similar a la estructura compleja conocida entre Rpn13NTD y Ub monómero 6,7, con la diferencia RMS para átomos pesados troncales de 2,17 ± 0,31 Å (Suplemento Fig. S10a). Curiosamente, aunque los residuos hidrofóbicos L8, I44 y V70 en la Ub proximal están involucrados para interactuar con Rpn13, los mismos tres residuos en la Ub distal están enterrados en la interfaz Ub-Ub.

una estructura de Rpn13NTD: complejo K48-diUb. La formación del complejo entierra extensas interfaces entre las subunidades. b Superficies de potencial electrostático de Rpn13NTD y Ub distal de K48-diUb, dibujadas a escala de ± 3 kBT. Los residuos R104 en Rpn13NTD y D39 en Ub distal se muestran como bolas y palos. la mutación de reversión de carga c R104E en Rpn13NTD causa una disminución de 300 veces en la afinidad de unión para K48-diUb, según la evaluación de smFRET (cf. Suplemento Fig. S11). El valor KD se informa como error de ajuste ± ajuste óptimo. los análisis de Western blot muestran que la transfección del mutante Rpn13 R104E (con una bandera N-terminal) aumenta la cantidad total de proteínas poliUb ligadas a K48 en la célula. las viabilidades de las células e tras el choque térmico (en relación con las células sin choque térmico) muestran que la transfección de Rpn13 mutante R104E, pero no de Rpn13 de tipo salvaje, confiere termotolerancia. * P < 0,05, * * * P < 0.001, para controlar las células del mismo grupo, prueba t no apareada; ##P < 0,01, ###P < 0,001, para las células no tratadas con choque térmico, ANOVA unidireccional; & & P < 0.01, &&&P < 0,001, a células transfectadas Rpn13 de tipo salvaje con choque térmico, ANOVA unidireccional

La estructura compleja Rpn13NTD: K48-diUb también puede ser corroborada por datos de TRASTE de una sola molécula. Basándonos en la estructura compleja, modelamos los fluoróforos en sus sitios de conjugación en K48-diUb. La distancia media es de 43,2 ± 5.8 Å entre los centros geométricos de los anillos aromáticos fluoróforos, lo que corresponde a una eficiencia teórica del TRASTE de 0,73 ± 0,13 (Fig. S10b). Este valor es casi el mismo que la eficiencia central observada para las especies de TRASTE alto (Fig. 1a).

Interrupción de Rpn13NTD: la interacción distal de la Ub causa acumulación de proteínas ubiquitinadas en la célula

En la estructura compleja entre Rpn13NTD y K48-diUb, la interacción entre Rpn13NTD y la Ub proximal es similar a la entre Rpn13NTD y el monómero Ub, como se informó anteriormente (Fig. Suplementaria. S10a). Por lo tanto, diseñamos experimentos para evaluar la importancia funcional de la interacción entre Rpn13NTD y la Ub distal de K48-diUb. Muchos residuos cargados se encuentran en la interfaz entre Rpn13NTD y la Ub distal de K48-diUb, y por lo tanto la fuerza electrostática puede desempeñar un papel importante para estabilizar el complejo (Fig. 4b). Entre ellos, el residuo D39 en la Ub distal es cercano al residuo R104 en Rpn13. Por lo tanto, mutamos el residuo Rpn13 R104 a un glutamato, y titulamos el mutante Rpn13NTD a K48-diUb marcado con fluoróforo. La proteína mutada enriquece las especies de alto TRASTE de K48-diUb (Suplemento Fig. S11). Sin embargo, la afinidad de unión se vuelve mucho más débil. La isoterma de unión se puede ajustar a un valor KD de 10,0 ± 3,3 µM, aproximadamente 300 veces más débil que el Rpn13NTD de tipo salvaje (Fig. 4c). Como tal, la asociación con la Ub distal es importante para el reconocimiento específico entre Rpn13 y K48-diUb.

La disminución de la afinidad de unión del mutante R104E nos permitió evaluar la importancia funcional de la interacción entre la cadena Rpn13 y la cadena Ub unida a K48. La transfección transitoria de Rpn13 de tipo salvaje aumenta ligeramente la cantidad de proteínas poliUb ligadas a K48 (Fig. 4d). Es posible que, tras la transfección de Rpn13, una cantidad excesiva de Rpn13 libre compita por la unión a las proteínas poliUb ligadas a K48 con Rpn13 asociada al proteasoma, lo que hace que el reclutamiento de proteínas de sustrato ubiquitinado al proteasoma sea menos eficiente. Por otro lado, la transfección del mutante Rpn13 R104E aumenta en gran medida la cantidad de proteínas poliUb ligadas a K48, en comparación con las células transfectadas con Rpn13 de tipo salvaje (Fig. 4d). Como control positivo, incubamos las células con 1 µM MG132, un potente inhibidor del proteosoma 36. Debido al bloqueo de la degradación de las proteínas lábiles, la adición de MG132 aumenta significativamente la cantidad de proteínas poliUb ligadas a K48. En conjunto, la mutación R104E de Rpn13 puede conducir a la acumulación de proteínas de sustrato ubiquitinadas. Esto se puede atribuir a una interacción más débil entre el mutante Rpn13 asociado al proteosoma y K48-diUb y K48-poyUb.

El choque térmico puede disminuir la viabilidad celular. Encontramos que el choque térmico de 30 minutos a 43 °C puede disminuir la viabilidad de las células HEK293 al 75%. Al igual que en los informes anteriores36,37, también encontramos que el tratamiento con MG132 tiene un efecto protector sobre la supervivencia celular en caso de choque térmico, con una viabilidad celular reducida a ~90% (Fig. 4e). Esto se debe a que MG132 inhibe la degradación proteosómica, haciendo que las proteínas de choque térmico de vida corta estén más disponibles (Fig. 4d). También analizamos la viabilidad de las células de choque térmico transfectadas con Rpn13 de tipo salvaje, y no encontramos diferencias significativas con las células de control sin transfección Rpn13. Por otro lado, la viabilidad celular de las células transfectadas Rpn13 R104E disminuyó a ~83% tras el choque térmico, que es significativamente mayor que la de las células de control y las células transfectadas con Rpn13 de tipo salvaje (Fig. 4e). Esto implica que el mutante Rpn13 tiene un efecto protector sobre la supervivencia celular en caso de choque térmico, similar al efecto de MG132. En conjunto, la interacción entre Rpn13 y la cadena Ub unida a K48 es esencial para el reconocimiento mediado por Rpn13 de proteínas de sustrato ubiquitinadas por el proteosoma, mientras que una mutación de punto interfacial en Rpn13 puede causar acumulación de ciertas proteínas de sustrato, como las proteínas de choque térmico, y conferir termotolerancia a las células transfectadas.

Rpn13NTD: La interacción K48-diUb puede ser dirigida para modular la función Rpn13

Rpn13 es reclutada dinámicamente al proteosoma a través de la interacción entre Rpn13NTD y la cola C-terminal de Rpn27,13. La compleja estructura aquí indica que la interfaz de unión en Rpn13NTD para Rpn2 es cercana pero no se superpone con la interfaz de unión para la Ub distal de K48-diUb (Fig. 5a). Por lo tanto, premezclamos los últimos 16 residuos de Rpn2 (Rpn2CTD) con Rpn13NTD o con Rpn13 de longitud completa en una proporción de 1:1, y valoramos el complejo Rpn13NTD:Rpn2CTD a K48-diUb marcado con fluoróforo. La premezcla de Rpn2CTD aumentó el valor KD de Rpn13NTD: K48-diUb de 33,1 ± 6,9 nM (Figs. 1g) a 66,8 ± 13,9 nM (Suplemento Fig. S12a – c y Fig. 5b), mientras que disminuyó el valor KD de Rpn13:K48-diUb de 119 ± 24 nM (Figs. 1d)a 43,9 ± 12,8 nM (Suplemento Fig. S12d-f y Fig. 5c). Por lo tanto, proporcionando las incertidumbres de medición, la asociación de Rpn2CTD causa solo una pequeña perturbación para la afinidad de unión entre Rpn13 y K48-diUb, que también puede tener que ver con la presencia de enlazador y el dominio C-terminal de Rpn13.

a La superficie de unión de la Ub distal de K48-diUb en Rpn13NTD es adyacente a la superficie de unión de Rpn2CTD. Con la estructura compleja Rpn13NTD-Rpn2CTD (código PDB 5V1Y) superpuesta por Rpn13NTD, Rpn2CTD se muestra como caricatura roja. El residuo Rpn13 K34 está cerca del extremo C de la Ub distal (se muestra como una línea de puntos). b, c Afinidades de unión se obtuvieron de titulaciones smFRET de Rpn13NTD equimolar: Rpn2CTD o Rpn13: Rpn2CTD a K48-diUb marcado con fluoróforo. Los valores KD se notifican como errores de mejor ajuste ± ajuste. la unión d del monómero Ub anclado a Rpn2 probablemente ocupa la misma superficie de unión de la Ub distal, causando el desplazamiento de esta última. e, f Los experimentos de competencia smFRET, con adición adicional de proteína de fusión Rpn2CTD-Ub de 150 pM, a la mezcla de Rpn13NTD de 200 nM o Rpn13 de longitud completa y K48-diUb marcado con fluoróforo de 150 pM (cf Figura 1c y f). El error indica 1 SD de tres mediciones independientes de las poblaciones de la especie smFRET

Rpn2 y Ub distal de K48-diUb ocupan superficies cercanas en Rpn13NTD. Por lo tanto, una proteína de fusión con monómero Ub anexado en el extremo C de Rpn2CTD puede sobresalir e interferir con la interacción entre Rpn13NTD y la Ub distal de K48-diUb (Fig. 5d). Como hemos demostrado, la adición de 200 nM Rpn13NTD aumenta la población de las especies de alto TRASTE de 150 pM con K48-diUb marcado con fluoróforo a ~63% (Fig. 1f), mientras que la adición de monómero Ub no puede competir por la unión Rpn13NTD (Fig. 2c, d). Cuando agregamos proteína de fusión Rpn2CTD-Ub sin etiquetar adicional de 150 pM, la población de especies de alto TRASTE disminuye en ~4% a ~59% (Fig. 5e). Por otro lado, hemos demostrado que, la adición de Rpn13 de 200 nM de longitud completa aumenta la población de las especies de alto TRASTE de 150 pM con K48-diUb marcado con fluoróforo a ~60% (Fig. 1c). La adición adicional de proteína de fusión Rpn2CTD-Ub sin etiquetar de 150 pM disminuye la población de especies de alto TRASTE en ~4,5 a ~55,5% (Fig. 5f). Tenga en cuenta que añadir un Ub en Rpn2CTD casi no tiene efecto en la interacción entre Rpn2CTD y Rpn13NTD (Suplemento Fig. S13). Por lo tanto, nuestros datos indican que las interfaces de enlace Rpn2 y K48-diUb en Rpn13NTD están cerca unas de otras. Más importante aún, la Ub anclada a Rpn2 puede bloquear físicamente el acceso del diUb distal a Rpn13 y debilitar la interacción entre K48-diUb y Rpn13.