Utilizando la técnica DBE, recolectamos sistemáticamente biopsias de todo el tracto intestinal humano y caracterizamos la distribución de células enteroendocrinas K y L y la expresión de sus productos hormonales en individuos sanos y en individuos con diabetes tipo 2.
Dado que la diabetes tipo 2 implica sobrepeso/obesidad y homeostasis disfuncional de la glucosa que podría correlacionarse con cambios en las células enteroendocrinas K y L, el estudio se diseñó para describir el patrón de distribución de estas células y la expresión de algunos de sus productos en los dos grupos de voluntarios reclutados prospectivamente, de tamaño similar, bien definidos y emparejados sin trastornos gastrointestinales conocidos. Con el DBE se pudo obtener un elevado número de muestras a lo largo del tracto intestinal: de nueve regiones anatómicamente específicas (Fig. 1) y 7-22 ‘las estaciones a lo largo del yeyuno y el íleon. Las biopsias de las áreas anatómicamente bien definidas fueron altamente comparables. Existe mayor incertidumbre en cuanto a la localización de la biopsia en el yeyuno y elleumeon proximal (localización de la biopsia 3-9, Fig. 1) debido a la duración variable de la intubación y, por tanto, al número de muestras obtenidas entre individuos. Para lidiar con este asunto, que sistemáticamente se divide el yeyuno y el íleon en siete regiones (ver Métodos). La marca de tinta submucosa colocada a la profundidad máxima de inserción durante la enteroscopia anterógrada se observó durante la enteroscopia retrógrada en cuatro de los 24 individuos, lo que indica enteroscopia total (Fig. 2). Se supone que la mayoría del tracto intestinal se investigó en el resto de los participantes, a juzgar por la duración de la intubación lograda (para más detalles, consulte nuestro artículo de metodología ).
Utilizamos inmunohistoquímica y recuento celular para cuantificar las células enteroendocrinas y las enzimas procesadoras de prohormonas, y análisis de expresión de ARNm qPCR para evaluar los productos hormonales/enzimáticos. Ambos métodos están bien establecidos, pero también plantean limitaciones. Una alta especificidad de los anticuerpos utilizados en inmunohistoquímica es de gran importancia para garantizar un mínimo de tinciones inespecíficas (falsos positivos). En consecuencia, elegimos anticuerpos bien establecidos y bien caracterizados . Utilizando inmunohistoquímica y recuento celular a partir de microfotografías de biopsias en rodajas, se evalúan objetos tridimensionales (es decir, células enteroendocrinas) con una técnica de imágenes bidimensionales. Una técnica más óptima para evaluar la distribución celular sería la estereología, en la que se estima la densidad verdadera (es decir, células/tejido mm3). Sin embargo, esta técnica requeriría ‘bloques’ transversales completos de tejido, lo que es incompatible con el alto número de sitios de biopsia, y por lo tanto, el mapeo detallado del tracto intestinal en seres humanos vivos que se pretendía en el presente estudio. Además, debe tenerse en cuenta lo siguiente. En primer lugar, la evaluación de la expresión de ARNm indica la actividad de las células endocrinas, pero no proporciona una medida de la producción total de un determinado producto celular, ya que no todos los ARNm se traducen en un producto activo final. En segundo lugar, la expresión es relativa, ya que las transcripciones específicas de ARNm están relacionadas con la expresión de un gen expresado de forma estable (ver Métodos ESM para más detalles). Teniendo en cuenta la heterogeneidad biológica de la diabetes tipo 2, se podrían haber detectado diferencias más pronunciadas con un mayor tamaño de muestra y la inclusión de pacientes con desregulación de glucosa más extensa.
El trabajo de Sjölund et al de 1983 sobre la distribución de células enteroendocrinas es el más detallado realizado en el intestino humano hasta ahora utilizando IHS con una amplia gama de antisueros (25 tipos) contra péptidos neurohormonales intestinales conocidos o propuestos . Las técnicas mínimamente invasivas no estaban disponibles en ese momento. En consecuencia, se obtuvieron muestras de solo siete regiones: duodeno proximal y distal, yeyuno medio ,leumeon distal, colon ascendente, parte distal del colon transverso o colon sigmoide y recto. Para cada región, se obtuvo material tisular de 9 a 17 individuos. Las muestras se recuperaron durante una cirugía abdominal (realizada principalmente debido a neoplasias malignas) o durante exámenes enteroscópicos con biopsias en individuos con «otros trastornos gastrointestinales», incluyendo una variedad de síntomas y enfermedades no especificados (por ejemplo, «sangrado oculto» y «enfermedad hepática»). En 1985, Adrian et al utilizaron una técnica de radioinmunoanálisis para determinar la cantidad de PYY en el fondo gástrico y el antro, duodeno, yeyuno ,leumeon, colon ascendente, colon sigmoide y recto . Se obtuvieron muestras de cada localización de 5 a 8 individuos sometidos a cirugía por carcinoma o úlceras gástricas. En 1992, un estudio que investigaba la distribución de células L enteroendocrinas en humanos fue reportado por Eissele et al . Se obtuvieron muestras de siete regiones: duodeno, yeyuno proximal y distal ,leumeon, colon ascendente, colon transverso y recto. Las muestras se obtuvieron de solo cinco participantes que se sometieron a cirugía por carcinoma o enfermedad de Crohn. En 2005, Guedes et al investigaron la distribución de células GIP, GLP-1 y CgA positivas, respectivamente, utilizando IHS en muestras de cada 20 cm del intestino delgado en 30 cadáveres humanos .
Cabe destacar que los cuatro estudios mencionados anteriormente investigaron muestras de tejido de apariencia normal sin signos de cambios patológicos. Sin embargo, la presencia de cambios malignos o inflamatorios en el área intestinal o el rápido comienzo de la degradación celular post mortem podría haber influido en la distribución y función general de las células enteroendocrinas. Además, la heterogeneidad de los participantes puede haber influido en los resultados.
De acuerdo con nuestros resultados, Sjölund et al, Eissele et al, Adrian et al y Guedes et al, respectivamente, describieron la variación en los productos de células L (GLP-1 y/o PYY) dependiendo de la localización intestinal, con una mayor densidad/cantidad en el yeyuno distal y elleumeon en comparación con el duodeno y el yeyuno proximal , y una mayor densidad/cantidad desde el colon proximal al distal, con los niveles más altos en el recto . Nuestros resultados apoyan este patrón de distribución de células L en individuos sanos y en diabetes tipo 2, con un aumento de la expresión génica de GCG y PYY, así como una mayor densidad de células GLP-1 y PYY positivas, a lo largo del intestino delgado y a lo largo del colon. También observamos la mayor señal de marcadores de células L (células positivas a PYY y GLP – 1 y expresión de ARNm PYY) en el recto, a excepción de la expresión de GCG. Las implicaciones, si las hay, de las diferencias observadas entre los grupos (significativamente mayor expresión de GCG y PYY en el colon de los participantes con diabetes tipo 2 en comparación con los individuos sanos) son actualmente desconocidas. Está bien establecido que el efecto de la incretina se reduce en la diabetes tipo 2, y se ha propuesto que un defecto en la secreción de GLP-1 inducida por nutrientes puede contribuir a explicar este fenómeno. Sin embargo, los estudios que investigan las respuestas de GLP-1 a estímulos nutritivos en personas con diabetes tipo 2 y no diabéticas han demostrado que, en general, las personas con diabetes tipo 2 no muestran una reducción de las respuestas plasmáticas totales de GLP-1 .
Observamos una discrepancia entre los niveles de expresión de GCG y la densidad de células GLP-1 positivas a lo largo del intestino. Esto enfatiza que las células L en una parte del intestino delgado pueden comportarse de manera diferente a las células L enteroendocrinas en otra parte del intestino delgado, como sugiere Svendsen et al, que observaron que el patrón de secreción de las células L cambia a lo largo del tracto gastrointestinal en ratas, es decir, que las células L secretan diferentes proporciones de PYY y GLP-1, y algunas secretan solo GLP-1 . De acuerdo con estos hallazgos, es probable que más células L localizadas distalmente expresen proglucagón en mayor medida que las células L localizadas más proximalmente.
Nuestros hallazgos de mayor expresión de GIP y densidad de células GIP positivas en la parte proximal del intestino delgado, ambas disminuyendo distalmente a la región ileocecal en individuos sanos y en aquellos con diabetes tipo 2, están en línea con hallazgos previos . A diferencia de Sjölund et al , que encontraron que las células GIP positivas estaban ausentes del intestino grueso, pudimos detectar niveles bajos de células GIP positivas en la parte distal del tracto intestinal. Sin embargo, no podemos descartar que esto sea el resultado de la unión inespecífica de anticuerpos. Sin embargo, observamos expresión de ARNm de IPG en el colon de ambos grupos, aunque a niveles muy bajos. La expresión de GIP fue significativamente mayor en individuos con diabetes tipo 2 a lo largo de todo el tracto intestinal. Se podría especular que la transcripción de GIP se incrementa como resultado compensatorio de la resistencia a GIP, es decir, el efecto insulinotrópico reducido de GIP observado en individuos con diabetes tipo 2 . En línea con esto, se ha demostrado que los niveles de GIP en ayunas son más altos en los participantes con diabetes tipo 2 en comparación con los participantes de control no diabéticos , y, además, se ha propuesto que el GIP contribuye a la hiperglucemia observada en la diabetes tipo 2 (debido principalmente al efecto glucagonotrópico del GIP) . Sin embargo, los datos relativos a las respuestas de la PIG después de la glucosa oral o comidas mixtas en individuos con diabetes tipo 2 han sido inconsistentes, y una revisión sistemática con metanálisis ha sugerido que las respuestas de la PIG posprandial son similares en aquellos con diabetes tipo 2 y en individuos sanos .
Dado que la glicoproteína ácida CgA es un componente de las vesículas celulares y se considera que desempeña múltiples funciones en el proceso secretor de productos endocrinos, se utiliza como marcador general de células enteroendocrinas . A diferencia de Guedes et al, que observaron una densidad constante de células CgA positivas a lo largo del intestino delgado, nuestro estudio mostró una disminución significativa. Además, observamos una mayor densidad de células CgA positivas en el intestino delgado de individuos sanos que de participantes con diabetes tipo 2. Se podría especular que el número total de células CgA positivas (células enteroendocrinas) está alterado en la diabetes tipo 2, ya sea como consecuencia del estado diabético tipo 2 o, tal vez, contribuyendo a la patogénesis de la diabetes tipo 2. Observamos un número bastante alto de células CgA positivas en el recto de ambos grupos. Recientemente, Engelstoft et al mostraron en ratones que la CgA se localizó principalmente en células enteroendocrinas secretoras de monoamina y más escasamente en células enteroendocrinas secretoras de péptidos, tal vez apoyando la propuesta de Sjölund et al de que las células enteroendocrinas rectales podrían tener una función principalmente local (paracrina) en lugar de una función sistémica .
Dado que se sabe que el PC1/3 procesa prohormonas que conducen a la formación de GIP y GLP-1, respectivamente, esperábamos encontrar la presencia de PC1/3 a lo largo de todo el tracto intestinal. Observamos, respectivamente, una discrepancia que implica una mayor expresión de PCSK1 / 3 y densidades más bajas de células PC1/3 positivas en el intestino delgado de participantes con diabetes tipo 2 en comparación con participantes sanos. Como se ha señalado anteriormente, este hallazgo debe interpretarse con la opinión de que algunas células enteroendocrinas pueden ser muy activas en algunas regiones y tener baja actividad en otras regiones.
Dado que el PC2 es conocido principalmente por el procesamiento de proglucagón a glucagón en células alfa pancreáticas, fue interesante encontrar expresión de ARNm de células PCSK2 y PC2 positivas a lo largo de todo el tracto intestinal. Esto podría indicar que el glucagón se produce en el intestino, como sugirieron recientemente Lund et al . En línea con esto, se podría especular que la mayor expresión de PCSK2 en el intestino delgado de individuos con diabetes tipo 2 conduce a la formación de exceso de glucagón, contribuyendo a la hiperglucagonemia diabética tipo 2. Para aclarar aún más este aspecto, se justifican los estudios que incluyen la doble tinción inmunohistoquímica.
En conclusión, el presente mapeo de la distribución de las células enteroendocrinas K y L y las variaciones observadas en los niveles de expresión de sus productos relacionados a lo largo del tracto intestinal humano, combinado con las diferencias demostradas entre los participantes con diabetes tipo 2 y los individuos sanos, proporcionan un trabajo de referencia para científicos y clínicos. Combinados con el conocimiento de estudios fisiológicos sobre las hormonas intestinales circulantes, nuestros datos podrían ser útiles para comprender cómo el intestino contribuye a regular el metabolismo de la glucosa y el apetito. La identificación de PC2 en células enteroendocrinas es interesante porque esto podría ser consistente con la formación de glucagón en el intestino humano. Sin embargo, se necesitan más estudios para probar esta posibilidad y vincular nuestros hallazgos con la fisiopatología de la diabetes tipo 2.
