- Resultados
- La Expresión de KLF2 Se Reduce con la Activación/Diferenciación de Monocitos en Macrófagos.
- KLF2 Inhibe la Activación de Monocitos y la Capacidad Fagocítica.
- KLF2 No Inhibe El Reclutamiento De Monocitos.
- KLF2 Inhibe La Inflamación Inducida Por Carragenina.
- Efecto de la Caída de KLF2 sobre la Expresión Génica Inflamatoria.
- KLF2 Inhibe las Actividades Promotoras de NF-kB y AP-1.
- Reclutamiento del Factor Coactivador Asociado a CBP (PCAF) por KLF2 como Mecanismo Unificador.
Resultados
La Expresión de KLF2 Se Reduce con la Activación/Diferenciación de Monocitos en Macrófagos.
Para comprender mejor el papel de KLF2 en la regulación de células inmunitarias como monocitos/macrófagos, primero evaluamos la expresión de KLF2 en monocitos humanos primarios. Como se muestra en la Fig. 1 Una expresión izquierda de KLF2 es robusta en monocitos humanos primarios y se reduce fuertemente con diferenciación en macrófagos después de 5 días. La expresión de KLF2 en la línea celular monocítica humana THP-1 fue mucho menor que la de los monocitos humanos primarios. Sin embargo, la expresión se redujo aún más con el tratamiento de estas células con LPS o 12-O-tetradecanoilforbol-13-acetato, dos agentes bien establecidos para inducir la activación o diferenciación celular (Fig. 1 A Derecha).
Expresión de KLF2 en monocitos activados in vitro e in vivo. A) El ARNm KLF2 se reduce con la diferenciación y activación de monocitos. Se realizó un análisis de blot norte con 10 µg de ARN total por carril de monocitos y macrófagos humanos (Izquierda). Se realizó un análisis similar con 20 µg de ARN total de células THP-1 cultivadas en células libres de FBS durante 36 h a partir de entonces y una estimulación adicional de 6 h con LPS o 12-O-tetradecanoilforbol-13-acetato (Derecha). (B) La expresión de KLF2 se reduce en monocitos de pacientes con aterosclerosis. Se realizó RT-PCR cuantitativa en tiempo real con monocitos aislados de 14 pacientes (Paciente) y 14 controles sanos de edad emparejados (Control). Los niveles de expresión de genes específicos se normalizaron con el factor de iniciación de la traducción eucariótica del gen de control.
A continuación, buscamos determinar si la expresión de KLF2 está regulada en el entorno inflamatorio in vivo. La activación monocítica es un evento fisiopatológico clave en el desarrollo de aterosclerosis, una afección inflamatoria crónica de bajo grado, por lo que razonamos que la expresión de KLF2 puede reducirse en estos pacientes (11). Examinamos un grupo de 14 sujetos normales de edad emparejados y 14 pacientes con aterosclerosis extensa (≈50% con antecedentes de revascularización de arterias coronarias) estratificados por los niveles más bajos y más altos del gen del osteosarcoma de Finkel–Biskis–Jinkins (FOS), respectivamente, que ha demostrado servir como marcador de inflamación (12). Como se muestra en la Fig. 1 B, la expresión de KLF2 se redujo significativamente en ≈30% en los pacientes. Por el contrario, no se observó ningún efecto significativo para KLF3, KLF6, KLF11 y KLF13. De acuerdo con nuestro estudio anterior, la expresión de FOS aumentó significativamente en pacientes con enfermedad arterial coronaria (12).
KLF2 Inhibe la Activación de Monocitos y la Capacidad Fagocítica.
En respuesta a estímulos inflamatorios, los monocitos expresan mayores niveles de factores proinflamatorios y citoquinas/quimioquinas y exhiben una mayor capacidad fagocítica. Para obtener información sobre el papel de KLF2 en la función de los monocitos, realizamos estudios de sobreexpresión. Las células THP-1 se infectaron con virus vacío de control (EV) o KLF2 (Ad-KLF2) durante 24-48 h y luego se estimularon con LPS durante 2 y 6 h, como se muestra en la Fig. 2 A, el tratamiento de células infectadas con EV con LPS (25 ng/ml) resultó en una inducción robusta de ciclooxigenasa (COX)-2, factor tisular y proteína quimioatrayente de monocitos (MCP)-1 ARNm. Por el contrario, esta inducción se atenuó notablemente en las células infectadas por KLF2 (Fig. 2 A). También se observaron efectos similares en la línea celular de monocitos de ratón J774a (datos no mostrados). Además, la sobreexpresión de KLF2 inhibió fuertemente la secreción de varias citocinas y quimiocinas. Como se muestra en la Fig. 2 B, la sobreexpresión de KLF2 atenuó la inducción mediada por LPS de factores como CD40L (en un 49,6%), proteína inflamatoria de macrófagos 1α (48,4%), proteína inflamatoria de macrófagos 1β (64,2%), IL-1β (55,0%), IL-8 (79,1%), TNF-α (50,2%) y MCP-1 (68,8%). Este efecto fue específico porque no se observó ningún efecto significativo en los niveles de otros múltiples factores de crecimiento relevantes (TGFß1, factor de crecimiento derivado de plaquetas y factor estimulante de colonias de granulocitos/macrófagos), citocinas/quimiocinas (IL-4, IL-10, IL-12p40, IL-12p70, IL-1α e IFN-γ), o enzimas que alteran la matriz (metaloproteinasa de matriz tipos 1, 2, 3 y 9) (no se muestran datos).
La sobreexpresión de KLF2 inhibe la activación de los monocitos. A) La sobreexpresión de KLF2 inhibe la expresión génica inflamatoria. Se realizó un análisis de blot norte para los factores indicados con 10 µg de ARN total por carril de THP-1 sobreexpresado con Ad-KLF2 (KLF2) o EV como control después de la estimulación con LPS para varios puntos de tiempo según lo indicado. B) La sobreexpresión de KLF2 inhibe la elaboración de citoquinas/quimioquinas. Un millón de células THP-1 por mililitro se infectaron con adenovirus EV o KLF2 durante 24 h, seguido de estimulación de LPS durante 2 o 6 h adicionales. Después de la estimulación, se recolectaron sobrenadantes de cultivo y se evaluaron mediante Matrices de Proteomas de reflector/ELISA sándwich múltiple. Cada muestra se evaluó por duplicado, y se evaluaron dos experimentos independientes para un panel de marcadores biológicos. Se observó un resultado similar con diferentes experimentos. C) KLF2 inhibe la fagocitosis. Se estimularon células THP – 1 infectadas con EV y KLF2 con LPS (25 ng/ml) y se realizó un ensayo de fagocitosis según se describe en Materiales y Métodos. (D y E) KLF2 no inhibe el reclutamiento monocítico. En D, se muestra un análisis citométrico de flujo representativo de células GFP positivas reclutadas a la cavidad peritoneal después de la inyección de tioglicolato por vía intravenosa. La barra cerrada indica el porcentaje de células GFP positivas en el análisis. En E se proporcionan los resultados resumidos de n = 5 ratones por grupo. F) La reconstitución de ratones inmunodeficientes, como se describe en Materiales y Métodos con células J774a sobreexpresadas con KLF2, revela una reducción del edema en períodos de inflamación inducida por carragenina de 1 y 2 horas. Los datos se expresan en ± SEM (n = 4). G) KLF2 reduce el edema tisular. Las secciones transversales de las patas inyectadas con carragenina (aumento×100) se teñieron con hematoxilina y eosina. Las patas de ratones reconstituidos con monocitos sobreexpresados con KLF2 muestran un líquido extravasado reducido marcado con flechas. Se indican puntos de referencia como músculos (M) y huesos (B). (H e I) El derribo de KLF2 aumenta la expresión génica proinflamatoria. Las células J774a se transfectaron con genes diana inespecíficos (NS) o siRNA a KLF2 (siKLF2) para los genes diana de 48 h evaluados mediante el análisis Northern blot (H) y el análisis cuantitativo de PCR en tiempo real (I). Los gráficos en I representan datos combinados de tres experimentos.
Una característica clásica de los monocitos/macrófagos activados es la fagocitosis. Para determinar si la sobreexpresión de KLF2 afecta la capacidad fagocítica de los monocitos, sobreexpresamos KLF2 o control (EV) en células THP-1, estimuladas con LPS, y evaluamos la capacidad de estas células para absorber biopartículas de zymosan A marcadas con rojo de Texas. Como se muestra en la Fig. 2 C, células infectadas por virus de control ingirieron biopartículas de zymosan. Por el contrario, la captación por los monocitos que expresan KLF2 se redujo notablemente (Fig. 2 C). Tomados en conjunto, estos datos demuestran que KLF2 puede inhibir la secreción de monocitos de citocinas / quimiocinas y fagocitosis.
KLF2 No Inhibe El Reclutamiento De Monocitos.
A continuación, buscamos evaluar el efecto de KLF2 en la función de los monocitos in vivo. En respuesta a una lesión o a un estímulo inflamatorio, los monocitos son reclutados del torrente sanguíneo a los tejidos. En primer lugar, realizamos estudios para evaluar si el reclutamiento de monocitos estaba alterado por la expresión de KLF2. Para minimizar la contribución de otros tipos de células, utilizamos ratones C. B-17-Scid-beige que son deficientes en células T, B y asesinas naturales. Estos animales (n = 5 por grupo) se sometieron a irradiación corporal total y se reconstituyeron con células J774a infectadas adenoviralmente con virus de control (EV) o KLF2 mediante inyección en la vena de la cola (descrita en Materiales y Métodos). Los animales fueron sometidos a inyección i.p. de tioglicolato (un potente irritante químico que induce el reclutamiento de monocitos), y el número de células GFP positivas se evaluó 48 h más tarde mediante análisis citométrico de flujo. Como se muestra en la Fig. 2 C y D, KLF2 no inhibió el reclutamiento de monocitos GFP+ J774a a la cavidad peritoneal. De hecho, observamos de forma reproducible que los animales transductores de KLF2 exhibieron un aumento significativo en las células GFP+. Estos datos sugieren que KLF2 no inhibe, sino que aumenta el reclutamiento monocítico a un sitio inflamatorio.
KLF2 Inhibe La Inflamación Inducida Por Carragenina.
Después del reclutamiento y migración a los tejidos, los monocitos secretan citocinas, quimiocinas y factores de crecimiento para perpetuar la respuesta inflamatoria. Como se muestra en la Fig. 2 B, observamos que la sobreexpresión de KLF2 atenuó la elaboración de varias citocinas y quimiocinas. Para determinar si KLF2 afecta la función proinflamatoria monocítica, utilizamos un modelo bien establecido para la inflamación: inyección de la almohadilla inducida por carragenina. Se ha demostrado previamente que la inyección de esta sustancia química induce de forma reproducible una respuesta inflamatoria caracterizada por edema de la pata (13-15). Los ratones C. B-17-Scid-beige (n = 4 por grupo) fueron irradiados como se describió anteriormente, reconstituidos con células J774a de control o que expresaban KLF2, y luego desafiados con inyección de carragenina en la almohadilla (descrita en Materiales y métodos). El volumen de la pata se determinó utilizando un hidropletismómetro modificado para volúmenes pequeños (Ugo Basile, Milán). Como se muestra en la Fig. 2 Animales infectados con VE F mostraron un aumento de 17 ± 1,08-mm3 y 23,3 ± 3,05-mm3 en el volumen de la pata después de 1 y 2 h de inyección de carragenina, respectivamente. Por el contrario, los animales reconstituidos con células J774a que expresaban KLF2 mostraron solo un aumento de 6,25 ± 0,85-mm3 y 7,5 ± 0,95-mm3 en el volumen de la pata a las 1 y 2 h después de la inyección de carragenina, respectivamente (Fig. 2 F). De acuerdo con este efecto macroscópico, el análisis histológico de las patas reveló una reducción de la extravasación de líquido, lo que conduce a la formación de edema (Fig. 2 G, flechas).
Efecto de la Caída de KLF2 sobre la Expresión Génica Inflamatoria.
Para determinar la importancia de KLF2 en la expresión génica inflamatoria monocítica, también se llevaron a cabo pequeños estudios de derribo mediados por ARN de interferencia (siRNA). Como se muestra en la Fig. 2 H, en comparación con las células no tratadas (control) e inespecíficas tratadas con siRNA, la caída de KLF2 (≈60% de caída) en las células J774a resultó en una inducción de genes inflamatorios como MCP-1 y un efecto más modesto en los niveles de expresión de COX-2 y del factor tisular. Estos resultados también se verificaron con análisis de PCR en tiempo real (Fig. 2 I).
KLF2 Inhibe las Actividades Promotoras de NF-kB y AP-1.
KLF2 puede inhibir de forma potente la inducción mediada por LPS de MCP-1, COX-2 y factor tisular (Fig. 2 A). Se sabe que la inducción de estos blancos por estímulos proinflamatorios está regulada por vías transcripcionales como NF-kB y AP-1. Razonamos que, en principio, KLF2 puede inhibir estas vías en múltiples niveles, como la expresión, la unión al ADN o la inducción de la actividad transcripcional.
Primero nos enfocamos en NF-kB dado su papel central en la inflamación. La sobreexpresión de KLF2 no alteró la acumulación nuclear de p65 ni los niveles nucleares de IkB quinasa (IKK) α e IKKy (Fig. 3 A). Además, la sobreexpresión de KLF2 no alteró la cinética de la fosforilación o degradación de IkB ni los niveles citoplásmicos de IKKa, IKKß e IKKy (Fig. 3 B). Consistente con estas observaciones, KLF2 no afectó la unión de NF-kB al ADN. Como se muestra en la Fig. 3 C, tratamiento de células infectadas por virus de control (VE) con LPS inducido por una sola banda mayor. Los estudios de competencia y supertransporte verificaron que esta banda representa NF-κΒ. Se observó un patrón casi idéntico de unión de NF-kB en células que sobreexpresan KLF2. Para evaluar si KLF2 puede afectar la activación transcripcional mediada por NF-kB, se realizaron ensayos de reportero genético. Como se muestra en la Fig. 3 D, transfección de p65 con una actividad transcripcional inducida por plásmido reportero de luciferasa NF-kB por ≈11 veces. Esta inducción se redujo fuertemente en presencia de KLF2, lo que indica que KLF2 inhibe la actividad transcripcional de NF-kB. Se observaron efectos similares de KLF2 para la vía AP-1 (Fig. 5 A-C, que se publica como información de apoyo en el sitio web de la PNAS).
KLF2 inhibe la actividad transcripcional de NF-kB. (A y B) KLF2 no altera la expresión de los componentes de la ruta NF-kB. Las células THP-1 fueron infectadas con el adenovirus (EV o KLF2), estimuladas con LPS durante 30 min, 1 h o 2 h, y evaluadas para la expresión de los factores indicados mediante análisis de Western blot utilizando extractos nucleares y citoplásmicos. (C) KLF2 no afecta a la unión de ADN NF-kB. Las células THP-1 se infectaron con el adenovirus (EV o KLF2) y se estimularon con LPS durante 1 h, y se utilizaron extractos nucleares para ensayos de cambio de gel. La banda NF-kB está designada por una flecha. La especificidad se verificó mediante estudios de competencia y supershift. D) KLF2 inhibe la transactivación mediada por p65 del concatemer NF-kB. Se realizaron estudios de transfección transitoria en células RAW264, 7 con los constructos indicados. Estos experimentos se realizaron por triplicado y se repitieron al menos tres veces.
Reclutamiento del Factor Coactivador Asociado a CBP (PCAF) por KLF2 como Mecanismo Unificador.
Tomados en conjunto, los resultados se muestran en la Fig. 3 indican que KLF2 puede inhibir la transactivación mediada por NF-kB independientemente de los efectos sobre la unión al ADN de estos factores. Un posible mecanismo es el reclutamiento de coactivadores críticos. Por ejemplo, la unión óptima de NF-kB requiere interacción con varios coactivadores clave, como el coactivador de receptores de esteroides (SRC)-1, PCAF y p300/CBP. KLF2 puede interactuar con uno o más de estos factores, reclutarlos lejos de NF-kB y, como consecuencia, reducir la actividad transcripcional mediada por NF-kB.
Para determinar el papel de la PCAF en la inhibición mediada por KLF2 de la actividad transcripcional de NF-kB, realizamos estudios de cotransfección con PCAF exógena. Transfección de PCAF (pero no de p300; datos no mostrados) rescató significativamente la represión mediada por KLF2 del concatemer NF-kB (Fig. 4 A). También se observó un rescate parcial de la capacidad de KLF2 para inhibir la actividad transcripcional de AP-1 (Fig. 5D). Para determinar si KLF2 y PCAF interactúan entre sí, realizamos ensayos de extracción y coinmunoprecipitación de GST. Utilizando productos transcritos y traducidos in vitro, encontramos que KLF2 y PCAF pueden interactuar directamente en un sistema libre de células (Fig. 4 B). Para saber si la PCAF se une a KLF2 in vivo, sobreexpresamos KLF2 (marcado con hemaglutinina) y PCAF (marcado con bandera) en células COS-7. La inmunoprecipitación con un anticuerpo anti-Flag seguido de Western blot con un anticuerpo anti-hemaglutinina mostró que KLF2 se une a PCAF en las células (Fig. 4 C).
KLF2 interactúa directamente con PCAF. A) La sobreexpresión de PCAF rescata la inhibición mediada por KLF2 de la actividad transcripcional de NF-kB. Se realizaron estudios de transfección transitoria con los plásmidos indicados en células CRUDAS 264,7 como se describió anteriormente (n = 9-12 por grupo). B) KLF2 interactúa con PCAF en un sistema sin células. Los experimentos de unión se realizaron utilizando productos transcritos y traducidos in vitro (TNT) de PCAF y GST-KLF2. Los datos del autorradiógrafo (Superior) y la tinción de Coomassie del gel (Inferior) indican la cantidad de carga y la proteína PCAF (∗). La entrada es del 2% del PCAF-TNT. C) KLF2 y PCAF interactúan en las células. Las células COS-7 se transfectaron con los constructos indicados, y se realizaron estudios de inmunoprecipitación como se describe en Materiales y Métodos. D) KLF2 reduce el reclutamiento de PCAF. Las células THP-1 se infectaron con virus que contenían Ad-KLF2 o EV y se estimularon con LPS, y se realizaron ensayos de ChIP para los factores indicados en el promotor de COX-2 (ver Materiales y Métodos para obtener más información).
Para determinar si los mecanismos subyacentes a los efectos observados son operativos in vivo, realizamos estudios de inmunoprecipitación con cromatina (ChIP). Como era de esperar, la estimulación del LPS de las células THP-1 llevó al reclutamiento de p65 y PCAF al promotor COX-2 (Fig. 4 D). Además, se observó acetilación concomitante de HH3 y HH4. Sin embargo, en el contexto de la sobreexpresión de KLF2, el reclutamiento de PCAF y la acetilación de histonas están fuertemente atenuados (Fig. 4 D). De acuerdo con nuestros ensayos de cambio de gel, no se observó un efecto significativo de KLF2 en el reclutamiento de p65.
