Enzima PCR de alta fidelidad & Enzima PCR eficiente: Polimerasa de ADN KOD
La archaea hipertermófila Thermococcus kodakaraensis KOD1 (anteriormente Pyrococcus kodakaraensis KOD1) (Fig. 1) se aisló de una fuente termal solfatárica (Fig. 2) en la isla de Kodakara (Fig. 3) en Japón, y fue identificado y caracterizado.
Se encontró una polimerasa de ADN de la familia B (polimerasa de ADN KOD) en esta cepa KOD1 y muestra varias propiedades únicas (1).
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Fig. 1. Thermococcus kodakaraensis KOD1
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Fig. 2. Solfatara (Kodakara isla, Japón)
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Fig. 3. Isla de Kodakara (prefectura de Kagoshima, Japón)
La polimerasa de ADN KOD exhibe una fuerte actividad de exonucleasa de 3 ‘→5’ (actividad de corrección de pruebas), una actividad de la que carece la polimerasa de ADN Taq.
Además, esta enzima exhibe una excelente capacidad de procesamiento y elongación, mostrando una tasa de extensión cinco veces mayor (100-130 nucleótidos/segundo) y una processividad 10-15 veces mayor (>300 bases) que la de Pyrococcus furiosus (Pfu ADN polimerasa). La tasa de elongación de esta enzima es aproximadamente 2 veces mayor que la de la ADN polimerasa Taq (Tabla 1)(Fig. 4) (1).
Cuadro 1. Propiedades de las polimerasas de ADN termoestables
| Valor de Proterty | para la polimerasa de ADN indicada | ||
|---|---|---|---|
| Polimerasa de ADN KOD | Polimerasa de ADN UFP | Polimerasa de ADN Taq | |
| Origen | Archaea | Archaea | Bacterias |
| Masa molecular deducida (kDa) | 90.0 | 90.1 | 93.9 |
| Óptima de la temperatura (en ºC) | 75 | 75 | 75 |
| pH Óptimo en 75ºC | 6.5 | 6.5 | 8.0-8.5 |
| Termoestabilidad (half-life) | 95 ° C,12 h; 100 ° c,3.0 h | 95ºC, 6h; 100ºC, 2.9 h | 95 ° C, 1.6h |
| 5’→3′ exonuclease activity | – | – | – |
| 3’→5′ exonuclease activity | + | + | – |
| Terminal transferase activity | – | – | – |
| Processivity (bases) | >300 | <20 | ND |
| Elongation rate (bases/s) | 106-138 | 25 | 61 |
Fig. 4. Comparación de las tasas de elongación de la UFP KOD y la polimerasa de ADN Taq.
La velocidad de elongación se midió de acuerdo con la longitud del ADN sintetizado, utilizando el ADNss M13 como plantilla a 75ºC.
Paralelamente al estudio de las actividades de la polimerasa de ADN KOD, se desarrollaron anticuerpos de neutralización para la polimerasa y actividades de corrección de pruebas (2). Estos anticuerpos se pueden aplicar a la «tecnología de PCR de arranque en caliente» utilizando la polimerasa de ADN KOD.
La estructura 3D de la ADN polimerasa se caracterizó en 2003 (Fig. 5) (3).
Fig. 5. Estructura 3D de la polimerasa de ADN KOD
J. Mol. Biol., 306: 469-477 (2001)
KOD-Plus – (Código No. KOD-201) se desarrolló sobre la base de la polimerasa de ADN KOD y presenta una alta fidelidad a la PCR (Tabla 2).
Cuadro 2. Comparación de la frecuencia de mutación de cada enzima PCR.
| Total de bases Secuenciadas | Número de mutado bases | frecuencia de Mutación (x10-5) | |
|---|---|---|---|
| KOD -Plus- | 145,753 | 5 | 3.4 |
| KOD FX | 144,535 | 19 | 13.1 |
| Pfu ADN polimerasa | 113,080 | 12 | 10.6 |
| la Taq-base de tiempo-PCR enzima | 167,343 | 218 | 130.3 |
| Polimerasa de ADN Taq | 102,708 | 145 | 141.2 |
La fidelidad se midió como la frecuencia de mutación secuenciando el producto de PCR. Después de clonar el producto de PCR (2,4 kb de la región de la beta-globina humana), se seleccionaron y secuenciaron unos 96 clones.
KOD FX (Código No. KFX-101) se desarrolló sobre la base de la polimerasa de ADN KOD y muestra una tasa de éxito de PCR mucho mayor (basada en la eficiencia y las capacidades de elongación) que KOD-Plus (Código No. KOD-201) u otras enzimas PCR basadas en Taq. KOD FX también es eficaz para la amplificación de muestras brutas (por ejemplo, lisado de cola de ratón, células cultivadas).
Fig. 6. Amplificación directa a partir de un lisado de cola de ratón crudo
1,2: KOD FX
3~6: Enzimas de otras empresas
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