- Resumen
- 1. Introducción
- 2. Materiales y Métodos
- 2.1. Microorganismos y Condiciones de crecimiento
- 2.2. Se prepararon análisis de Crecimiento y Viabilidad con pH Variado
- 2.3. Tolerancia in Vitro a Condiciones Gastrointestinales
- 2.4. Supervivencia durante el almacenamiento en frío en Leche acidificada
- 2.5. Análisis de Autoagregación
- 2.6. Prueba de sensibilidad a antibióticos
- 2.7. Análisis estadísticos
- 3. Resultados
- 3.1. Efecto del pH en el Crecimiento y Viabilidad de L. fermentum TCUESC01
- 3.2. Tolerancia de L. fermentum TCUESC01 a Condiciones Gastrointestinales In Vitro
- 3.3. Supervivencia de L. fermentum TCUESC01 en condiciones comerciales de almacenamiento
- 3.4. Autoagregación de L. fermentum TCUESC01
- 3.5. Sensibilidad de L. fermentum TCUESC01 a antibióticos
- 4. Discusión
- 5. Conclusiones
- Conflictos de intereses
- Agradecimientos
Resumen
El uso de bacterias probióticas intestinales es muy común en la industria alimentaria y ha sido el foco de la mayoría de las investigaciones en este campo. Sin embargo, en los últimos años, la investigación sobre microorganismos extraintestinales ha aumentado considerablemente debido a su conocido potencial como probióticos. Así, estudiamos una cepa de Lactobacillus fermentum (TCUESC01) extraída del cacao en fermentación. En primer lugar, examinamos el impacto del pH en el crecimiento de esta cepa y estudiamos su supervivencia en condiciones similares a las del tracto gastrointestinal humano. L. fermentum TCUESC01 demostró resistencia a condiciones que imitan el estómago y los intestinos humanos y creció bien entre pH 5 y pH 7. A continuación, se sometió a L. fermentum TCUESC01 a almacenamiento a 4 ° C en una solución de leche y se encontró que sobrevivió bien durante 28 días. Por último, se midió la susceptibilidad de esta cepa a numerosos antibióticos y su tendencia a la autoagregación. L. fermentum TCUESC01 mostró una autoagregación significativa, así como susceptibilidad a la mayoría de los antibióticos analizados. En general, nuestros hallazgos respaldan el uso potencial de esta bacteria extraintestinal como probiótico dietético.
1. Introducción
La búsqueda de nuevos probióticos está motivada por el conocimiento de que cada cepa de microorganismos posee propiedades diferentes y podría tener efectos únicos en la salud humana. Históricamente, se creía que las bacterias lácticas en los productos probióticos tenían que provenir de seres humanos debido a la especificidad del huésped . Sin embargo, los microorganismos extraintestinales aislados de alimentos fermentados que contienen lactosa o vegetales fermentados también exhiben efectos probióticos prometedores . Evidencia preliminar de nuestro laboratorio indica que las cepas de lactobacilos derivadas de la fermentación de cacao de alta calidad exhiben propiedades probióticas: reducen el daño histológico, reducen la concentración sistémica de citoquinas inflamatorias y aumentan los niveles séricos de IgA en un modelo experimental de colitis in vivo . Sin embargo, el posible uso de estas cepas en productos comerciales depende de una serie de pruebas recomendadas por organizaciones internacionales. Según la Organización de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentación (FAO) y la Organización Mundial de la Salud (OMS), las cepas probióticas potenciales deben evaluarse por sus características funcionales y tecnológicas, incluida su resistencia durante el tránsito gastrointestinal y su estabilidad durante el almacenamiento . Por lo tanto, se evaluaron las propiedades funcionales y la seguridad de la cepa TCUESC01 de Lactobacillus fermentum que se aisló durante la fermentación de cacao de alta calidad.
2. Materiales y Métodos
2.1. Microorganismos y Condiciones de crecimiento
La cepa Lactobacillus fermentum TCUESC01 (número de adhesión KU244478, GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/KU244478)) se cultivó en caldo MRS de lactobacilos (1% de peptona, 0,8% de extracto de carne, 0,4% de extracto de levadura, 2% de glicosa, 0,5% de acetato de sodio, 0,2% de hidrogenofosfato dipotásico, 0,02% de sulfato de magnesio heptahidratado, 0.005% de sulfato de manganeso tetrahidratado y 0,02% de sal de triamonio de ácido cítrico) (HIMEDIA®, India) durante 18 h a 37°C y almacenado a -80°C en una solución de leche al 10% (Molico®, Brasil) que contiene un 30% de glicerol.
2.2. Se prepararon análisis de Crecimiento y Viabilidad con pH Variado
Soluciones de caldo MRS de pH 2, pH 3, pH 4, pH 5, pH 6, pH 7, pH 8 y pH 9 mediante la adición de 1 mol·L−1 de ácido clorhídrico o 1 mol·L−1 de hidróxido de sodio. Antes del ensayo, L. fermentum TCUESC01 se cultivó durante 18 h y luego se diluyó en una solución salina (0.cloruro de sodio al 85%) a una densidad óptica (DO) de 0,3 medida a 600 nm (OD600 = 0,3). Los ensayos se realizaron en microplacas de 96 pocillos (Costar®), en las que se inocularon 180 µL de MRS a cada pH con 20 µL de cultivo activo o solución salina como control. La microplaca se incubó a 37°C y el DO a 600 nm se determinó cada hora durante 10 horas utilizando un espectrofotómetro (Molecular Devices®, lector de microplacas sintonizable Versamax). Paralelamente, se tomaron muestras cada hora de cada pH, se platearon en agar MRS y se incubaron en condiciones anaeróbicas a 37 ° C para probar la viabilidad celular.
2.3. Tolerancia in Vitro a Condiciones Gastrointestinales
Las bacterias se cultivaron a 37 ° C durante la noche en 40 mL de caldo MRS, se lavaron en una solución salina y se inocularon en 20 ml de una solución de leche al 10%. Se permitió proceder a la fermentación de la leche hasta alcanzar un pH de 4,5, momento en el que se contaron las bacterias (UFC·mL−1) mediante dilución en serie y enchapado en agar MRS. Además, se realizó una dilución en serie en solución salina (pH 2,5) con pepsina (3 g/L), seguida de incubación a 37°C durante 1,5 h. Las bacterias se lavaron mediante dos ciclos de centrifugación (5000 × g / 10 min) y se resuspendieron en una solución salina, antes de resuspenderse en 20 mL de bilis porcina al 1% a pH 8,0 (Merck®, Alemania) y se incubaron a 37°C durante 45 minutos. Los recuentos bacterianos (UFC·mL-1) se determinaron mediante el recubrimiento de la solución bacteriana en agar MRS en condiciones anaeróbicas a 37°C durante 48 h después de cada fase de incubación.
2.4. Supervivencia durante el almacenamiento en frío en Leche acidificada
La cepa TCUESC01 de L. fermentum se cultivó en caldo MRS y luego se cosechó por centrifugación (5000 × g / 10 min). A continuación, las bacterias se lavaron mediante resuspensión en una solución salina y se peletizaron de nuevo mediante centrifugación. Los cultivos se inocularon en una solución estéril de leche descremada al 10% que había sido acidificada a pH 4,5 con ácido láctico (Synth®, Brasil). La solución láctica se refrigeró a 4°C y las unidades formadoras de colonias (UFC·mL-1) se contaron mediante dilución en serie y chapado en agar MRS a los 0, 7, 14, 21 y 28 días. La viabilidad de la cepa se determinó en relación con el punto de tiempo cero, que se consideró que tenía una supervivencia del 100%.
2.5. Análisis de Autoagregación
L. fermentum TCUESC01 se cultivó en 20 mL de caldo MRS durante la noche a 37 ° C. El pellet bacteriano se recolectó y resuspendió en solución salina a una DO de 0,3 a 600 nm (OD600 = 0,3). La capacidad de autoagregación de L. fermentum TCUESC01 se probó incubando la suspensión a 37 ° C y el DO se monitoreó cada hora durante 5 h. El porcentaje de agregación () se calculó de la siguiente manera: dónde está la densidad óptica inicial en el punto de tiempo cero y es la densidad óptica en el momento de la medición. Los resultados mostrados fueron los promedios más / menos las desviaciones estándar de tres experimentos.
2.6. Prueba de sensibilidad a antibióticos
L. fermentum TCUESC01 se cultivó durante 18 h en caldo MRS a 37 ° C y se diluyó a 0,5 en la escala de McFarland en una solución salina. Se colocaron discos de antibióticos en placas de agar Mueller-Hinton que luego se inocularon con 100 µL de suspensión de bacterias activas. Las placas se incubaron en condiciones anaeróbicas durante 24 h a 37°C. Se midieron las zonas de inhibición alrededor de los discos y las bacterias se clasificaron como resistentes (), moderadamente susceptibles (EM) o susceptibles () con base en los estándares descritos en la Tabla 1. Los discos de antibióticos utilizados en la prueba de susceptibilidad fueron amoxicilina (AMO, LABORCLIN®, Brasil, 10 µg), ciprofloxacina (CIP, LABORCLIN, Brasil, 5 µg), amikacina (AMI, CECON®, Brasil, 30 µg), azitromicina (AZI, CECON, Brasil, 15 µg), amoxicilina y ácido clavulánico (AMC, SENSIFAR®, Brasil, 30 µg), norfloxacina (NOR, LABORCLIN, Brasil, 10 µg), sulfonamida (SUL, NEWPROV®, Brasil, 300 µg), vancomicina (VAN, SENSIFAR, Brasil, 30 µg), estreptomicina (EST, LABORCLIN, Brasil, 10 µg), eritromicina (ERI, CECON, Brasil, 15 µg), tetraciclina (TET, SENSIFAR, Brasil, 30 µg), imipenem (IPM, CECON, Brasil, 10 µg), cefalotin (CFL, LABORCLIN, Brasil, 30 µg), gentamicina (GEN, CECON, Brasil, 10 µg), cefotaxima (CTX, SENSIFAR, Brasil, 30 µg), cotrimoxazol (trimetoprima y sulfametoxazol) (SUT, SENSIFAR, Brasil, 25 µg), cloranfenicol (formación de COÁGULOS sanguíneos, SENSIFAR, Brasil, 30 µg), clindamicina (CLI, CECON, Brasil, 2 µg), penicilina G (PEN10, CECON, Brasil, 10 µg), y cefoxitina (oficial principal de finanzas, LABORCLIN, Brasil, 30 µg).
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| Se muestran los rangos de zona de diámetros de inhibición exhibidos por bacterias consideradas susceptibles (), moderadamente susceptibles (MS) o resistentes () a cada antibiótico . | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
2.7. Análisis estadísticos
Los cálculos de medias y desviaciones estándar, los análisis de varianza, las Pruebas de Comparación Múltiple de Tukey y todos los análisis estadísticos se realizaron con el programa GraphPad ® Prism 5.0. Todos los gráficos también se produjeron utilizando el programa GraphPad Prism 5.0.
3. Resultados
3.1. Efecto del pH en el Crecimiento y Viabilidad de L. fermentum TCUESC01
L. fermentum TCUESC01 pudo crecer en medios a pH 5, pH 6 y pH 7 (Figura 1). Sin embargo, no se observó crecimiento fuera de este rango de pH (Figura 1).
(un)
(b)
(c)
d)
(en)
(f)
(en)
(h)
(y)
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(h)
(i)
3.2. Tolerancia de L. fermentum TCUESC01 a Condiciones Gastrointestinales In Vitro
La tolerancia de L. fermentum TCUESC01 al paso gastrointestinal se evaluó en condiciones diseñadas para imitar el tracto gastrointestinal humano (Figura 2). Se cultivó una solución bacteriana a una concentración de 8,7 × 108 UFC·mL-1 en una solución de leche al 10%. Después de someter las bacterias a una solución que contenía pepsina a pH 2,5 durante 1,5 h para simular el jugo gástrico, observamos una reducción estadísticamente significativa () de la concentración bacteriana a 1,23 × 108 UFC·mL-1. Después de ser lavadas con solución salina, las bacterias se sometieron a una solución de bilis porcina al 1% a pH 8,0 durante 45 minutos para simular el entorno intestinal. Después de este tratamiento, observamos una reducción de aproximadamente 1 logaritmo en el recuento bacteriano (3,6 × 107 UFC·mL−1). La reducción de los recuentos bacterianos durante la incubación en jugo intestinal simulado no fue estadísticamente insignificante.
3.3. Supervivencia de L. fermentum TCUESC01 en condiciones comerciales de almacenamiento
Para evaluar su supervivencia durante el almacenamiento, las bacterias L. fermentum se refrigeraron a 4°C durante 28 días en una leche sin grasa al 10%, de lo contrario estéril, acidificada a pH 4,5 con ácido láctico (Figura 3). La cepa bacteriana estaba inicialmente a una concentración de 3,6 × 109 UFC·mL-1, pero después de 7 días de almacenamiento observamos una reducción estadísticamente significativa de aproximadamente 1 logaritmo en el recuento bacteriano. Del día 7 al día 21, hubo un crecimiento inesperado de 4,3 × 108 UFC·mL−1 a 9,0 × 108 UFC·mL-1. Para el día 28, la concentración bacteriana había disminuido a 2,83 × 108 UFC·mL−1.
3.4. Autoagregación de L. fermentum TCUESC01
Las bacterias se agregaron cada vez más hasta la quinta hora de cultivo in vitro, momento en el que se observó una agregación máxima de 70,19 ± 1,78% (Figura 4). Sin embargo, los aumentos por hora en la agregación porcentual solo fueron estadísticamente significativos hasta la tercera hora del experimento ().
3.5. Sensibilidad de L. fermentum TCUESC01 a antibióticos
Esta cepa de L. fermentum showed susceptibility to the majority of antibiotics tested (Table 2). The few exceptions were the fluoroquinolones norfloxacin and ciprofloxacin, the nucleic acid synthesis inhibitors sulfonamide and cotrimoxazole (sulfamethoxazole and trimethoprim), the cell wall synthesis inhibiting glycopeptide antibiotic vancomycin, and the cell wall synthesis inhibiting β-lactam cefoxitin. L. fermentum TCUESC01 fue susceptible a amoxicilina, amoxicilina y ácido clavulánico, penicilina G, β-lactámicos cefotaxima y cefalotina, aminoglucósidos amikacina y gentamicina, lincosamida clindamicina, carbapenem imipenem, macrólidos azitromicina y eritromicina, fenicol cloranfenicol y tetraciclina. La cepa también fue moderadamente susceptible a la estreptomicina.
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| los Diámetros son de muestra. De acuerdo con los estándares mostrados en la Tabla 1, L. fermentum TCUES01 se caracteriza como susceptible (), moderadamente susceptible (MS) o resistente () a cada antibiótico analizado. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
4. Discusión
Las directrices establecidas por la FAO y la OMS afirman la necesidad de analizar las propiedades funcionales y la seguridad de las bacterias antes de proponer su uso en una matriz alimentaria . Inicialmente evaluamos la capacidad de esta especie de Lactobacilo para crecer y sobrevivir a diferentes pH, y aunque mostró crecimiento solo en el rango de pH 5 a pH 7, permaneció viable durante incubaciones de 10 h en todos los niveles de pH evaluados, con la excepción de pH 2. Los estudios han demostrado una amplia variabilidad en el pH gástrico cuando el estómago está vacío, con valores promedio inferiores a pH 4 . El ambiente intestinal es más estable y varía entre pH 6 y pH 8, dependiendo de la región intestinal evaluada . Por lo tanto, a pesar de que esta bacteria láctica no ha demostrado la capacidad de multiplicarse o sobrevivir por debajo de pH 2,5, sigue siendo viable en el rango de pH intestinal y, por lo tanto, puede ser capaz de funcionar en ese entorno. De acuerdo con nuestros datos, Lactobacillus plantarum (ST194BZ, ST414BZ y ST664BZ), Lactobacillus rhamnosus (ST461BZ, ST462BZ) y Lactobacillus paracasei (ST242BZ, ST284BZ) aislados de una bebida fermentada de consumo común (Boza) de la Península Balcánica mostraron buenas tasas de crecimiento durante 10 h de incubación entre pH 5 y pH 7 . L plantarum 423 aislado de bebida de sorgo, L. plantarum 241 aislado deleumeon de cerdo, L. curvatus DF38 aislado de salami y Lactococcus lactis ssp. lactis HV219 aislado de secreciones vaginales humanas también mostró crecimiento entre pH 5 y pH 6,5 en experimentos similares . En general, nuestros resultados demuestran que L. fermentum TCUESC01 tiene resistencia al crecimiento y al pH similar a otras posibles bacterias probióticas extraintestinales. Además, la sensibilidad de la cepa a niveles de pH inferiores a 2,5 puede superarse mediante el uso de métodos que protegen a las bacterias, como la microencapsulación . Nuestros resultados respaldan la posible aplicación de esta cepa como aditivo probiótico en alimentos con características claramente ácidas, por ejemplo, quesos, jugos y leche fermentada.
El ambiente gastrointestinal puede ser hostil para muchas bacterias; una variedad de factores estresantes como la acidez, las enzimas digestivas y las sales biliares pueden influir negativamente en su supervivencia durante el tránsito al intestino . El lactobacilo en este estudio mostró una reducción cuantitativa discreta, pero se mantuvo viable en condiciones gástricas e intestinales y resistió una concentración de bilis tres veces superior a la encontrada en el intestino humano (0,3%) . Similar a nuestros datos, Kaushik et al. observó que Lactobacillus plantarum Lp9 disminución de 0,5 registro de su concentración inicial cuando se expone a condiciones que imitan el estómago (pH 2) y 1 de registro cuando se expone a condiciones que imitan el intestino. En otro estudio, L. rhamnosus VT1 / 1 aislado de queso mostró una reducción de aproximadamente 2 log de concentración en condiciones de pH bajo (pH 3) y una reducción de 1 log de concentración cuando se incubó a pH 7 en presencia de sales biliares al 2%. Nuestros resultados sugieren que L. fermentum podría moverse a través del sistema gastrointestinal y sobrevivir en concentraciones superiores a 107 UFC·g−1 (o UFC·mL−1), lo que estudios previos sugieren que sería suficiente para interactuar y/o interferir con el entorno del huésped .
La matriz alimentaria también es un factor que influye en la viabilidad de los microorganismos durante su almacenamiento . Al probar la supervivencia a largo plazo de L. fermentum TCUESC01 en leche acidificada, observamos una reducción inicial de los recuentos bacterianos seguida de un ligero aumento del día 7 al día 21. Este crecimiento se puede explicar por el metabolismo bacteriano continuo en la solución láctica, aunque a un ritmo reducido debido a la baja temperatura. Donkor et al. también se observó variación cuantitativa en bacterias probióticas durante el almacenamiento a 4 ° C, especialmente Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus Lb1466 que exhibió un crecimiento de 1 tronco desde el día 7 hasta el día 14 de almacenamiento en frío. En otro estudio, L. plantarum almacenado en leche fermentada redujo significativamente su concentración celular en 1 logaritmo durante aproximadamente 28 días de almacenamiento a 4°C. Aunque L. fermentum había mostrado una disminución de 1 log de su concentración inicial para el último día de almacenamiento, su concentración estaba por encima de la media en la fecha de caducidad de la solución láctica . Del mismo modo, sobre la base de las recomendaciones de la Agencia Nacional de Vigilancia Sanitaria (ANVISA), L. fermentum TCUESC01 podría introducirse en matrices alimentarias similares a la leche fermentada y sobrevivir en concentraciones adecuadas hasta la fecha de caducidad del producto .
Los microorganismos con capacidad de autoagregarse permanecen en los intestinos durante más tiempo y, por lo tanto, tienen mejores interacciones con las células epiteliales y el sistema inmunitario del huésped . La cepa L. fermentum TCUESC01 demostró una elevada capacidad de autoagregación en nuestro ensayo de 5 horas. Este resultado es mayor que el reportado por Beganović et al. , que demostraron que L. fermentum A8 tenía 60,9 ± 3.91% de autoagregación después de 5 h de incubación, o la reportada por Bao et al. , que demostró una autoagregación de menos del 28% para 10 cepas de L. fermentum después de una incubación de 20 horas. En base a nuestros resultados, los agregados de L. fermentum bien y si se ingieren probablemente podrían persistir en el ambiente intestinal humano durante largos períodos de tiempo.
Finalmente, se evaluó la susceptibilidad de TCUESC01 a una variedad de antibióticos. El conocimiento de la susceptibilidad a los antibióticos es extremadamente importante cuando consideramos tres factores importantes: la rara posibilidad de infección por Lactobacilos, el riesgo de transferencia horizontal de genes de resistencia a microbios nativos y la asociación entre bacterias probióticas y tratamiento antibiótico. L. fermentum TCUESC01 mostró susceptibilidad a la mayoría de los antibióticos, con la excepción de los inhibidores de síntesis de ácidos nucleicos (norfloxacina, ciprofloxacina, sulfonamida y cotrimoxazol) y dos inhibidores de síntesis de pared celular (vancomicina y cefoxina). Estos resultados corroboran los datos publicados por Kirtzalidou et al. en 74 cepas de Lactobacillus ssp. aislado de heces humanas, de las cuales 94.el 5% de las cepas eran resistentes a la amikacina, todas resistentes a la kanamicina y ciprofloxacino, el 84,7% de las cepas eran resistentes a la vancomicina, el 1,6% de las cepas eran resistentes a la cefalotina y el 8,5% de las cepas eran resistentes a la bacitracina. En general, los lactobacilos muestran resistencia intrínseca a las quinolonas, trimetoprima, sulfonamidas, vancomicina y la mayoría de los inhibidores de ácidos nucleicos, mientras que muestran susceptibilidad a los inhibidores de la síntesis de proteínas, con la excepción de los aminoglucósidos . Vale la pena señalar que la resistencia a los antibióticos observada aquí es intrínseca al género, como se evidencia en estudios publicados, y por lo tanto, la transferencia horizontal de genes es poco común. En resumen, el perfil de resistencia de L. fermentum TCUESC01 apoya la posibilidad de uso junto con antibióticos que actúan inhibiendo la síntesis de ácidos nucleicos.
5. Conclusiones
A pesar de ser una cepa extraintestinal aislada durante la fermentación del cacao, L. fermentum TCUESC01 muestra un fuerte potencial como probiótico para su aplicación en productos alimenticios. Sigue siendo viable en un amplio espectro de pH y, por lo tanto, es adecuado para su inclusión en diferentes tipos de alimentos. Cuando se almacena en un producto lácteo refrigerado, mantiene la viabilidad por encima de los niveles recomendados por organizaciones nacionales e internacionales reconocidas hasta la fecha de caducidad del producto. En condiciones que imitan el tránsito gastrointestinal, también sobrevive en cantidades suficientes para el mantenimiento del potencial probiótico. En términos de sus comportamientos predichos dentro de los intestinos, L. fermentum TCUESC01 muestra una fuerte tendencia a la autoagregación. Por último, esta cepa presenta perfiles de susceptibilidad y resistencia a los antibióticos que permitirán su uso junto con terapias farmacológicas. En conjunto, estas características sugieren que L. fermentum TCUESC01 tiene un gran potencial como aditivo alimentario probiótico seguro.
Conflictos de intereses
Los autores declaran no tener conflictos de intereses.
Agradecimientos
Esta investigación fue apoyada por una beca de la Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado da Bahia (FAPESB). El Consejo de Desarrollo Científico y Tecnológico (CNPq) y la coordinación de perfeccionamiento de personal de nivel Superior (CAPES) proporcionaron productividad y becas de posgrado para algunos autores.
