Genes derribadores y derribadores

Gen Derribador
Esta técnica permite la reducción de la expresión de uno o más de un organismo. Esto puede ocurrir a través de la modificación genética o por el tratamiento con un agente como un oligonucleótido corto de ADN o ARN que tiene una secuencia complementaria a cualquiera de los genes o una transcripción de ARNm.
Si el cambio en la expresión génica es causado por un oligonucleótido que se une a un ARNm o se une temporalmente a un gen, esto conduce a un cambio temporal en la expresión génica que no modifica el ADN cromosómico,y el resultado se conoce como «caída transitoria».
En una caída transitoria, la unión de este oligonucleótido al activegeno o sus transcripciones causa una disminución de la expresión. La unión puede ocurrir a través del bloqueo de la transcripción, la degradación de la transcripción del ARNm(p. ej. Antisentido dependiente de ARNr o RNasa – H), o mediante el bloqueo de la traducción de ARNm, sitios de empalme previo al ARNm o sitios de escisión de nucleasas utilizados para la maduración de otros ARN funcionales, incluido el miRNA (e.g.by morpholino oligos).
El uso más directo de las caídas transitorias es para aprender sobre un gen que ha sido secuenciado, pero que tiene una función desconocida. Este enfoque experimental se conoce como genética inversa. Las caídas transitorias a menudo se utilizan en biología del desarrollo porque los oligosse pueden inyectar en cigotos unicelulares y estarán presentes en las células hijas de la célula inyectada.

La interferencia de ARN (ARNi)es un medio de silenciar genes a través de la degradación del ARNm. Este método se logra introduciendo pequeños ARNR interferentes de doble cadena (siRNA) en el citoplasma. Una vez introducidos en la célula, los ARNSEXÓGENOS son procesados por RISC. El siRNA es complementario al ARNM objetivo que se silenciará, y el RISC utiliza el ARNm como plantilla para localizar el ARNm objetivo. Después de que el RISC se localiza en el ARNm objetivo, el ARN es escindido por una ribonucleasa.
El ARNi se utiliza para el análisis funcional genético. El uso de ARNI puede ser útil para identificar posibles dianas terapéuticas, desarrollo de fármacos u otras aplicaciones.

Eliminación de genes
La eliminación de genes (KO) es una técnica genética en la que uno de los genes de un organismo se hace inoperante. Los organismos Knockout se utilizan para estudiar la función de los genes, generalmente investigando el efecto de la pérdida de genes. Kos heterocigoto y homocigoto: en el primero, solo un alelo es eliminado, en el segundo, ambos alelos son eliminados.

La creación dirigida de un KO comienza en el tubo de ensayo con un plásmido,un cromosoma artificial bacteriano u otra construcción de ADN, y se procesa para el cultivo celular. Las células se transfectan con el Dnaconstrucción. A menudo, el objetivo es crear un animal transgénico que tenga el gen alterado.
Si es así, las células madre embrionarias se transforman genéticamente y se insertan en embriones tempranos. Los animales resultantes con el cambio genético en sus células de la línea germinal a menudo pueden transmitir el gen a futuras generaciones.

El constructo está diseñado para recombinarse con el gen diana, lo que se hace incorporando secuencias del gen en sí al constructo.La recombinación se produce en la región de esa secuencia dentro del gen,lo que resulta en la inserción de una secuencia extraña para interrumpir el gen.
Un knockout condicional permite la deleción de genes de una manera específica para el tejido o el tiempo. Esto se hace introduciendo sitios de loxP alrededor del gen. Estas consecuencias se introducirán en la línea germinal a través del mismo mecanismo que un mecanismo de bloqueo. Esta línea germinal se puede cruzar a otra línea germinal que contiene Cre-recombinasa, que es una enzima viral que puede reconocer estas secuencias, recombinarlas y eliminar el gen flanqueado por estos sitios.
Debido a que la recombinación del ADN es un evento raro, la secuencia extraña elegida para la inserción generalmente incluye a un reportero. Esto permite una fácil selección de celdas o individuos en los que knockout tuvo éxito. A veces, el Dnaconstrucción se inserta en un cromosoma sin la combinación homóloga deseada con el gen diana.

(Ivana Venezia)

KNOCKDOWN
Es una técnica mediante la cual se reduce la expresión de un gen. Esta reducción puede ser el resultado de una modificación del ADN o de un oligonucleótido que se une al ARNm o al gen. En este caso, el cambio de expresión es temporal, por lo que wetalk habla sobre la caída transitoria.
Una de las técnicas que permiten el derribo transitorio de un gen consiste en el uso de oligómeros de Morfolino. Se han convertido en una herramienta de derribo estándar en los sistemas embrionarios de animales, por lo que los morfolinooligos se utilizan a menudo para investigar el papel de un transcripción de ARNm específico en un embrión. Su estructura molecular tiene bases de ADN unidas a una columna vertebral de anillos de metilenomorfolina unidos a través de grupos de fosforodiamidato. Los morfolinos bloquean el acceso de otras moléculas a pequeñas secuencias específicas (~25 bases) de las superficies de emparejamiento de bases del ácido ribonucleico (ARN). Debido a que sus espinas dorsales completamente antinaturales, los morfolinos no son reconocidos por las proteínas celulares. Las nucleasas no degradan los morfolinos, ni se degradan en el suero o en las células. No se han publicado informes de que los morfolinos activen receptores tipo toll o respuestas inmunitarias innatas, como la inducción de interferón o la respuesta inflamatoria mediada por NF-kB.No se sabe que los morfolinos modifiquen la metilación del ADN.
Los morfolinos no desencadenan la degradación de sus moléculas de ARN diana,a diferencia de muchos tipos estructurales antisentidos (por ejemplo, fosforotioatos, siRNA). En su lugar, la Morfolinosact mediante «bloqueo estérico», uniéndose a una secuencia objetivo dentro de un ARN,inhibiendo moléculas que de otro modo podrían interactuar con el ARN.
Los morfolinos también pueden modificar el empalme del pre-ARNm o inhibir la tematuración y la actividad del miARN.
Bloqueo de la traducción
Unido a la región de 5’sin traducir del ARN mensajero (ARNm), los morfolinos pueden interferir con la progresión del complejo de iniciación ribosomal desde la tapa de 5′ hasta el código de inicio. Esto evita la traducción de la región de codificación de la transcripción objetivo (llamada expresión genética «derribando»). Esto es útil experimentalmente cuando un investigador desea conocer la función de una proteína en particular; los morfolinos proporcionan un medio conveniente para derribar la expresión de la proteína y aprender cómo esa caída cambia las células u organismo.
La modificación del empalme de pre-ARNm
Las morfolinas pueden interferir con los pasos de procesamiento de pre-ARNm, ya sea evitando que pequeños complejos de ribonucleoproteínas nucleares (snRNP) que dirigen por duplicado se unan a sus objetivos en los bordes de los intrones en una hebra de pre-ARNm, o bloqueando la base nucleofílica de adenina e impidiendo que forme la estructura de lariat de empalme, o interfiriendo con la unión de proteínas reguladoras de empalme, como silenciadores de empalme y potenciadores de empalme. La prevención de la unión de snRNP U1 (en el sitio donante) o U2/U5 (en la fracción de polipirimidina y el sitio receptor) puede causar empalmes modificados, excluyendo comúnmente exones del ARNm de la naturaleza. Apuntar a algunos objetivos de empalme da como resultado inclusiones intron, mientras que la activación de sitios de empalme crípticos puede conducir a inclusiones o exclusiones parciales.Los objetivos de snRNPs U11 / U12 también se pueden bloquear. La modificación del empalme se puede ensayar de manera conveniente mediante la reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR)y se ve como un cambio de banda después de la electroforesis en gel de productos de RT-PCR.
KNOCKOUT
Una variación del gen knockout tradicional es el gen knockout condicional.
La eliminación condicional de genes es una técnica utilizada para eliminar un gen específico en un determinado tejido, como el hígado. Esta técnica es útil para estudiar el papel de los genes individuales en los organismos vivos. Se diferencia de la eliminación de genes tradicionales porque se dirige a genes específicos en momentos específicos antes de ser eliminado desde el comienzo de la vida. El uso de la técnica de eliminación de genes condicional elimina muchos de los efectos secundarios de la eliminación de genes tradicional. En el knockout tradicional de genes, la muerte embrionaria por una mutación genética puede ocurrir, y esto impide que los científicos estudien el gen de forma inadecuada. Algunos tejidos no se pueden estudiar adecuadamente de forma aislada, por lo que el gen debe estar inactivo en un determinado tejido mientras permanece activo en otros. Con esta tecnología, los científicos pueden eliminar genes en una etapa específica de desarrollo y estudiar cómo la eliminación de un gen en un tejido afecta al samegeno en otros tejidos.
La técnica más utilizada es el sistema de combinación Cre-lox. La enzima Cre recombinasa reconoce específicamente dos sitios (loci de recombinación) dentro del ADN y causa la recombinación entre ellos. Esta recombinación causará una deleción o inversión de los genes entre los dos sitios lox, dependiendo de su orientación. El gen anentire se puede eliminar o inactivar. Todo este sistema es inducible, por lo que se puede agregar un químico para eliminar genes en un momento específico. Dos de las sustancias químicas más utilizadas son la tetraciclina, que activa la transcripción del gen de la REC recombinasa, y el tamoxifeno, que activa el transporte de la proteína Crerecombinasa al núcleo. Solo unos pocos tipos de células expresan crerecombinasa y ninguna célula de mamíferos la expresa, por lo que no hay riesgo de activación accidental de los sitios lox cuando se usa la eliminación condicional de genes en mamíferos.
Un ratón que contiene el gen Cre y un ratón que contiene las secuencias loxP se crían para generar un nocaut condicional para un determinado gen de interés. Los ratones no expresan naturalmente la recombinasa Cre o los loxsites, pero han sido diseñados para expresar estos productos genéticos para crear la descendencia deseable. Hay que obtener un ratón en el que un exón importante está flotado (significa que tiene aLox-P aguas arriba y aguas abajo) y un ratón que tiene una secuencia Cre cuya expresión está regulada por un promotor específico de tipo celular o un promotor inducible. Luego cruzamos estos ratones y obtenemos un ratón en el que las células que no expresan Cre tendrán el gen con una función normal, mientras que las células que expresan Cre tendrán una función génica interrumpida en la porción entre Lox-P.
(Francesca Luca)

Mecanismo de interferencia de ARN

La interferencia de ARN (ARNi), una respuesta antiviral celular antigua, es un mecanismo natural para silenciar la expresión génica. Se puede explotar para permitir la inhibición específica de la función de cualquier gen objetivo. El ARNI está demostrando ser una herramienta de investigación invaluable, ya que ayuda a identificar nuevos genes implicados en procesos de enfermedad.

El ARNi no es el único mecanismo de control de la expresión génica (tabla 1).

Tabla 1: Comparación entre diferentes métodos para silenciar genes.

La interferencia de ARN (ARNI) ocurre en respuesta a la introducción de ARN de doble cadena (ARN-dsRNA)en una célula. La introducción del dsRNA desencadena la activación de la proteína quinasa-R dependiente del dsRNA (PKR). Fosforila PKR activado el factor de iniciación de la traducción EIF2: este efecto, en asociación con la activación de la Rnasa-L y la inducción de la producción de interferón, detiene la síntesis de proteínas y promueve la apoptosis. En general, se cree que esto representa un mecanismo de defensa antiviral. El RNI es un mecanismo altamente conservado en todas las especies taxonómicas . Además de tener una actividad antiviral, también se cree que el ARNi suprime la expresión de segmentos potencialmente dañinos del genoma, como los transposones, que pueden desestabilizar el genoma actuando como mutágenos insercionales.

Aunque sus mecanismos no están completamente dilucidados, el ARNI representa el resultado de un proceso de varios pasos(Figura 1). Al entrar en la célula, los ARNs largos son procesados por primera vez por el Dicer de la enzima RNasa III. Este dímero funcional contiene la celicasa, la unión dsRNA y los dominios PAZ (sus funciones no están completamente aclaradas). Dicer produce 21-23 fragmentos de nucleótidos dsRNA con voladizos de extremo de twonucleótido de 3′, es decir, ARNIS. El ARNi está mediado por el complejo de silenciación inducida por el ARN (RISC) que, guiado por el siRNA, reconoce el ARNm que contiene una consecuencia homóloga al siRNA y escinde el ARNm en un sitio ubicado aproximadamente en el centro de la región homóloga. Por lo tanto, la expresión génica se inactiva específicamente a nivel post-transcripcional.

En C. elegans, Dicer ha sido mostrado para interactuar con proteínas rde. Las proteínas rde se unen al dsRNA largo y se cree que presentan el dsRNA largo al Dicer para su procesamiento. Se ha informado que los mutantes que presentan un alto grado de resistencia al ARNi poseen mutaciones en los loci atrde-1 y rde-4.

Figura 1: Mecanismo de referencia de Rnainterferencia

La aparición de ARN doublestranded (ds) dentro de una célula (por ejemplo, como consecuencia de una infección viral)desencadena una respuesta compleja, que incluye, entre otros fenómenos (p.ej.producción de interferón y sus consecuencias) una cascada de eventos moleculares conocidos como ARNi. Durante el ARNi, el Dicer de la enzima celular se une al ARN-DSR y se divide en trozos cortos de ~ 20 pares de nucleótidos de longitud conocidos como ARN de interferencia pequeña (siRNA). Estos pares de ARN se unen a la enzima celular llamada complejo silenciador inducido por ARNr (RISC) que utiliza una hebra del ARNr para unirse a moléculas de ARN de cadena única (es decir, ARNm) de secuencia complementaria. La actividad nuclear del RISC degrada el ARNm, silenciando así la expresión del gen viral. De manera similar, se cree que la maquinaria genética de las células toutiliza el ARNi para controlar la expresión del ARNm endógeno, agregando así una nueva capa de regulación post-transcipcional. Los ARNI pueden ser explotados en entornos experimentales para derribar genes objetivo de interés con una tecnología de alta especificación y relativamente fácil (ver texto para más detalles).

Además de la genesilenciación, el ARNI podría estar involucrado en otros fenómenos de regulación génica.. Parece que el ARNi también puede funcionar metilando citosinas, así como las consecuencias de las GPC más clásicamente asociadas con la metilación. Si la secuencia objetivo comparte homología con un promotor, el silenciamiento transcripcional puede ocurrir por medio de la ametilación. Además, el ARN parece interactuar con los dominios de la cromatina, que en última instancia pueden dirigir la metilación del ADN. Los estudios de C. elegans han demostrado que el ARNI puede diseminarse entre las células a través de mecanismos que pueden no depender del ARNi.El locus sistémico deficiente en interferencia de ARN (sid), sid-1, codifica una proteína conservada con una secuencia de péptidos de señal y 11 dominios transmembranarios putativos,lo que sugiere que la proteína sid-1 puede actuar como un canal para un ARN-DSRN largo, un ARNi o una señal relacionada con el ARNi actualmente no descubierta. Los mutantes Sid – 1 retienen el ARNi autónomo de células, pero no muestran propagación del ARNi. Sigue sin aclararse si este ARNi sistémico ocurre en mamíferos, aunque se informa de una fuerte similitud entre el sid-1 y las proteínas humanas y de ratón predichas.

(Justine Floret)

Fuente : https://translational-medicine.biomedcentral.com/articles/10.1186/1479-5876-2-39#Sec3

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ZFN, TALEN, CRIPR / CAS9

Estas tres tecnologías moleculares permiten editar el genoma de una manera específica para cada sitio, cada técnica con un mecanismo diferente. Las nucleasas de dedo de zinc (ZFNs) y las nucleasas efectoras de tipo activador de transcripción (TALENs) son nucleasas quiméricas compuestas de módulos programables de unión de ADN de secuencia específica vinculados a un dominio de escisión de ADN no específico. ZFNs y TALENs permiten una amplia gama de modificaciones genéticas induciendo roturas de doble hebra de ADN que estimulan la unión de extremos no homólogos propensa a errores o la reparación dirigida por homología en ubicaciones genómicas específicas.

Imagen tomada de http://gentaur-italy.com/prodotti/talen-un-sistema-semplice-e-veloce-per-gene-knockout/

La versatilidad de ZFNs y TALENs surge de la capacidad de personalizar el dominio de unión al ADN para reconocer prácticamente cualquier secuencia. Estos módulos de unión al ADN se pueden combinar con numerosos dominios efectores para afectar la estructura y función genómica, incluidas nucleasas, activadores y represores transcripcionales, recombinasas, transposasas, histonas metiltransferasas de ADN e histonas acetiltransferasas. Por lo tanto, la capacidad de ejecutar con éxito las alteraciones genéticas depende en gran medida de la especificidad de unión al ADN y la afinidad de las proteínas diseñadas con dedos de zinc y TALE.

Proteínas de dedo de zinc Cys2-His2

El dominio de dedo de zinc Cys2-His2 es uno de los tipos más comunes de motivos de unión al ADN que se encuentran en los eucariotas y representa el segundo dominio de proteína codificada con mayor frecuencia en el genoma humano. Un dedo de zinc individual consta de aproximadamente 30 aminoácidos en una configuración ββα conservada. Varios aminoácidos en la superficie de la hélice α normalmente entran en contacto con tres pares de bases en el surco principal del ADN, con diferentes niveles de selectividad. La estructura modular de las proteínas de dedo de zinc las ha convertido en un marco atractivo para el diseño de proteínas personalizadas de unión al ADN. La clave para la aplicación de proteínas de dedos de zinc para el reconocimiento específico del ADN fue el desarrollo de matrices antinaturales que contienen más de tres dominios de dedos de zinc. Este avance fue facilitado por el descubrimiento basado en la estructura de una secuencia de enlazador altamente conservada que permitió la construcción de proteínas sintéticas de dedos de zinc que reconocían secuencias de ADN de 9 a 18 bps de longitud. Debido a que los 18 bps de la secuencia de ADN pueden conferir especificidad dentro de los 68 mil millones de bp de ADN, este método permitió que las secuencias específicas se apuntaran en el genoma humano por primera vez.

Efectores similares a activadores de transcripción

Los tales son proteínas de origen natural del género de bacterias fitopatógenas Xanthomonas, y contienen dominios de unión al ADN compuestos de una serie de 33-35 dominios de repetición de aminoácidos que cada uno reconoce una sola presión arterial. La especificidad de TALE está determinada por dos aminoácidos hipervariables que se conocen como diresiduos de variable repetida (RVDs) . Al igual que los dedos de zinc, las repeticiones de CUENTOS modulares están unidas para reconocer secuencias de ADN contiguas. Sin embargo, a diferencia de las proteínas de dedo de zinc, no hubo una reingeniería de la vinculación entre repeticiones necesaria para construir largas series de cuentos con la capacidad de abordar teóricamente sitios individuales en el genoma. Además de su papel para facilitar la recombinación directa homóloga, las nucleasas de sitios específicos también permiten la generación rápida de líneas celulares y organismos con fenotipos nulos; La reparación mediada por NHEJ de un DSB inducido por nucleasa conduce a la introducción de pequeñas inserciones o eliminaciones en el sitio objetivo, lo que resulta en la eliminación de la función génica a través de mutaciones de cambio de marco.

Imagen tomada de http://www.anim.med.kyoto-u.ac.jp/gma/nucleases.aspx

A diferencia de las nucleasas específicas del sitio descritas anteriormente, el sistema CRISPR (Repeticiones Palindrómicas Cortas Interespaciadas Reguladoras Agrupadas)/asociado a CRISPR (Cas) ha surgido recientemente como una alternativa potencialmente fácil y eficiente a ZFNs y TALENs para inducir alteraciones genéticas dirigidas. En las bacterias, el sistema CRISPR proporciona inmunidad adquirida contra el ADN extraño invasor a través de la escisión del ADN guiada por ARN. En el sistema CRISPR/Cas Tipo II, segmentos cortos de ADN extraño, denominados «espaciadores», se integran dentro de los loci genómicos de CRISPR y se transcriben y procesan en ARN CRISPR corto (ARN CRR). Estos ARNRR se recocieron a ARNRR transactivadores (ARNRTR) y a la escisión y silenciamiento directo del ADN patógeno por proteínas Cas. Trabajos recientes han demostrado que el reconocimiento del objetivo por parte de la proteína Cas9 requiere una secuencia de «semilla» dentro del ARNcr y una secuencia de motivo adyacente de protospacer (PAM) que contiene dinucleótidos conservada aguas arriba de la región de unión al ARNcr. De este modo, el sistema CRISPR/Cas se puede reorientar para escindir prácticamente cualquier secuencia de ADN rediseñando el ARNcr. Significativamente, se ha demostrado que el sistema CRISPR/Cas es directamente portátil a las células humanas mediante la entrega conjunta de plásmidos que expresan la endonucleasa Cas9 y los componentes necesarios del ARNcr.

Imagen tomada de https://www.computescotland.com/crisprcas9-genome-editing-8111.php