Los usos biocatalíticos de las enzimas han crecido enormemente en los últimos años, ya que son ecológicamente correctos, tienen una alta especificidad, presentan quimio-regio-enantio-selectividad y presentan una amplia diversidad de reacciones. Además, las condiciones para obtener y optimizar la producción de enzimas en términos de nutrientes, pH, temperatura y aireación se controlan fácilmente en biorreactores. Los microorganismos también se pueden manipular genéticamente para mejorar las características deseables de un biocatalizador. Estas características han fomentado la búsqueda cada vez mayor de procesos biocatalíticos . El objetivo de nuestro estudio fue utilizar un proceso enzimático para obtener hidrolizados de queratina para productos para el cuidado del cabello. Actualmente, los hidrolizados de queratina comerciales se obtienen por hidrólisis química. El método propuesto es respetuoso con el medio ambiente y produce un hidrolizado transparente. En contraste, los hidrolizados comerciales tienen un color oscuro debido a la presencia de ácido. El color claro es una ventaja al incorporar hidrolizado de queratina en productos para cosméticos para el cabello o la piel. Las proteínas de suero de leche con una masa molecular inferior a 10 kDa se caracterizan por una menor alergenicidad. Por lo tanto, es deseable obtener fracciones con masas moleculares inferiores a 5 kDa en el proceso de hidrólisis . Además, Eremeev et al demostraron la actividad antioxidante de los hidrolizados de queratina. El primer paso en este trabajo consistió en transformar las plumas en péptidos y aminoácidos de queratina mediante peptidasas y queratinasas producidas por Bacillus subtilis. La Figura 3 muestra que las plumas fueron degradadas (90-95%) por el microorganismo después de cinco días de crecimiento en el medio. Las queratinasas y peptidasas pueden actuar sobre otros residuos de queratina, incluidos los polvos de lana y cuerno. Las queratinasas se están aplicando en las industrias de piensos, fertilizantes, detergentes, cuero y farmacéutica .
Control A: Bacillus subtilis en medio que contiene plumas (tiempo 0) y B Después de 5 días de crecimiento en medio de plumas.
Algunos informes han descrito la producción de queratinasas por especies de Bacilos como B. subtilis KD-N2 ; B. pumilus KS12 , B. megaterium SN1 . Sin embargo, estos trabajos describen el aislamiento de nuevas cepas, la producción de mutantes y la caracterización de queratinasas, sugiriendo sus posibles aplicaciones. En nuestro estudio, el enfoque se centró en el hidrolizado de queratina de plumas producido por B. subtilis, específicamente los péptidos, y el objetivo de nuestro trabajo fue analizar el efecto del hidrolizado en la fibra capilar. Diferentes metodologías para el análisis de queratinasas han sido utilizadas por otros autores y esta gran variabilidad dificulta la comparación de resultados. Sin embargo, la cepa nativa de Bacillus subtilis utilizada en el presente manuscrito mostró una excelente actividad proteolítica (gelatinasa) con una producción de 350 U/ml y 400 U/ml de queratinasas y proteasas, respectivamente.
Los péptidos de queratina formados por degradación enzimática se analizaron mediante espectrometría de masas de desorción /ionización por láser asistida por matriz (MALDI-TOF). En primer lugar, al comparar los dos espectros, podemos observar los perfiles distintos de los dos hidrolizados. Los múltiples picos correspondientes a los péptidos de bajo peso molecular, predominantemente en el rango de 800 a 1079 m/z, fueron producidos por Bacillus subtilis (Figura 4A). También podemos observar algunos iones con m / z en el rango de 1171,57 a 1758,96. Mientras que para la preparación comercial de hidrolizado de queratina KH1, los picos se concentraron en el rango de 900 a 1400 m/z, como se muestra en la Figura 4(B). Múltiples picos entre 1400 y 2100 también se pueden ver en la misma Figura. Por lo tanto, el hidrolizado producido por B. subtilis contiene péptidos con masas moleculares más bajas. Estos péptidos de bajo peso molecular pueden penetrar en la fibra capilar de manera más eficiente y esta característica es una diferencia positiva en comparación con los hidrolizados comerciales. Un trabajo previo de nuestro grupo utilizando cabello humano como sustrato demostró múltiples picos de 816 a 2080 m⁄z después de 4 días de cultivo . El análisis de masa molecular del sobrenadante de cultivo producido por el B.la cepa SLC de subtilis utilizando plumas como sustrato reveló que la mayoría de los péptidos, derivados de plumas de pollo, presentaban una masa molecular en el rango de 500-3000 Daltons . En un termófilo Meiothermus ruber H328, el análisis MALDI TOF de productos solubilizados después del crecimiento en medio de plumas detectó solo oligopéptidos con menos de 1,000 Daltons . Estos resultados confirman que las enzimas microbianas producen péptidos con menor masa molecular.
Análisis MALDI-TOF MS de los hidrolizados de queratina enzimática de queratina de plumas por Bacillus subitilis (A) y un hidrolizado comercial (KH1) (B). Para más detalles, consulte Materiales y métodos.
Se realizó un análisis preliminar de los hidrolizados de queratina enzimática mediante cromatografía de capa delgada (HPTLC) y se observaron péptidos y aminoácidos con menor masa molecular, como se muestra en la Figura 5, carril 2, en comparación con el hidrolizado comercial (KH1) en el carril 3. El aminoácido glicina en el carril 1 se utilizó como estándar.
Análisis HPTLC de péptidos de queratina tras filtración por ultrafiltración en el sistema Amicon (Milipore, 1000 Daltons). 1 – Aminoácido glicina. Péptidos de queratina de 2 plumas obtenidos por hidrólisis enzimática. 3-Hidrolizado comercial (KH1).
Después de la fermentación, el hidrolizado enzimático tenía una concentración de proteínas de 3,5 mg / ml. Después de la filtración, el contenido de proteína fue de 1,5 mg / ml, lo que corresponde a un porcentaje de 42,8% con respecto a la proteína total. El hidrolizado enzimático se aplicó a los mechones del cabello a una concentración del 10% como se describe en Materiales y Métodos y en la Figura 2.
El hidrolizado se aplicó con un champú suave y un acondicionador de enjuague preparado de acuerdo con las Tablas 1 y 2. La Tabla 3 demuestra que hay un aumento de la hidratación para todo el cabello tratado con hidrolizados enzimáticos y con plancha a 180°C. Sin la aplicación de calor, el proceso no fue eficiente, lo que sugiere que el calentamiento es importante para incorporar los hidrolizados en el cabello.
Los hidrolizados de proteínas, en particular aquellos con una distribución de bajo peso molecular, es decir, < 1000 Daltons, son conocidos por proporcionar protección y cuidado eficientes al cabello. Se han utilizado varias fuentes de proteínas para producir hidrolizados. La proteína de trigo, la queratina de lana y los hidrolizados de colágeno son ejemplos que se han utilizado en productos para el cuidado de la piel y el cabello personal y se sabe que confieren una mejor compatibilidad, sensación, hidratación y ayudan a mantener la estructura natural . En los productos para el cuidado del cabello, los péptidos de menor peso molecular tienen dos efectos: 1) Son capaces de penetrar la corteza de la fibra capilar y 2) Pueden promover un recubrimiento superficial. La penetración parece ser más profunda con tratamientos más largos. Además, el cabello blanqueado muestra un mayor nivel de penetración de hidrolizados en comparación con el cabello control no dañado . Estas propiedades tienen efectos beneficiosos sobre la estructura del cabello reemplazando la queratina perdida y también tienen un efecto antienvejecimiento . Se investigó el efecto del péptido de queratina de lana sobre la piel en una formulación acuosa o en liposomas y se observó un aumento de la hidratación y la elasticidad como resultado de la aplicación del péptido de queratina.
El efecto de la aplicación del hidrolizado enzimático sobre la fibra capilar fue evaluado por SEM (Figuras 6, 7 y 8). Todas las figuras muestran micrografías de fibras capilares tratadas y no tratadas con hidrolizado enzimático. Se observó un aumento en el brillo y la suavidad mediante análisis sensorial (datos no mostrados). Sin embargo, en las micrografías, se observaron depósitos de hidrolizados de queratina de plumas en la unión de las cutículas de todos los tipos de cabello. Este depósito probablemente colabora con el sellado de las cutículas. También el calor es esencial para el sellado completo de las cutículas. La fibra coloreada fue beneficiada por los hidrolizados cuando se aplicó con calor (Figura 6C, D). Los hidrolizados se adhirieron más a las fibras capilares previamente coloreadas y alisadas (Figura 7C, D), lo que indica que la combinación de coloración y alisado favorece la acción de los péptidos de queratina. La Figura 8 (A, B) muestra que el tratamiento de blanqueo promovió un daño acentuado a la fibra capilar. La apariencia del borde de ataque de las escamas de la cutícula indica una ruptura de las escamas (B). La aplicación de los hidrolizados enzimáticos con calor colaboró para el sellado de las cutículas pero sus bordes permanecieron rotos (C, D).
Análisis de microscopía electrónica de barrido (SEM) de cabello teñido A, B –Control; C, D – Después del tratamiento con hidrolizados enzimáticos y plancha a 180°; E, F – Después del tratamiento con hidrolizados enzimáticos sin calor. Las flechas indican depósitos de hidrolizado enzimático de plumas.
Análisis de micrografía SEM de cabello teñido y alisado después del tratamiento con hidrolizado enzimático. Cabello tratado A, B-Control; C, D – Después del tratamiento con hidrolizados enzimáticos y plancha a 180°; E, F – Después del tratamiento con hidrolizados enzimáticos sin calor, Observe el depósito de los hidrolizados enzimáticos en las escamas (flecha).
Imágenes de microscopio electrónico de barrido obtenidas de un cabello blanqueado sin tratar (A, B) y tratado con hidrolizados enzimáticos con calor (C,D) o sin calor (E,F). La flecha negra indica el depósito de péptidos de los hidrolizados enzimáticos y la flecha blanca muestra los bordes rotos de la cutícula.
Cuando se modifica la química del cabello, algunas de las propiedades naturales del cabello se ven comprometidas. Hay varios mecanismos que pueden dañar la fibra capilar. Por ejemplo, el estrés ambiental y la radiación UV foto-oxida las proteínas. La fotooxidación de proteínas conduce a la escisión de los enlaces de disulfuro que enlazan las proteínas, y a la ruptura de los enlaces de tioéster, lo que resulta en la liberación de lípidos de superficie unidos y la pérdida de la estructura del cabello. Estas reacciones conducen a un deterioro de las propiedades del cabello, notorio para los consumidores en forma de mala manejabilidad, sequedad y fragilidad, pérdida de brillo y, en casos extremos, disminución de la fuerza . Se sabe que algunos tratamientos cosméticos como el rizado permanente, la coloración permanente, el blanqueamiento y el alisado/relajante alteran las propiedades del cabello . Incluso el manejo cosmético, como el peinado y el cepillado diarios, puede dañar el cabello . Recientemente, Cao et al utilizaron diferentes concentraciones del caldo de fermentación (plumas de pollo) obtenido de Stenotrophomonas maltophilia, en el cabello. El sobrenadante se incubó durante 30 min. Se encontró que el caldo era protector para el cabello, como lo demuestra la flexibilidad y fuerza mejoradas tanto para el cabello normal como para el dañado.
Sionkowska, et al, utilizando espectroscopia UV-Vis, transformada de Fourier, espectroscopia infrarroja (FTIR) y espectroscopia de fluorescencia, evaluaron la influencia de la irradiación UV en los hidrolizados de queratina. Se formaron nuevos fotoproductos durante la irradiación UV de hidrolizados de queratina y también se observó un ligero aumento de las especies de azufre oxidado. Los autores propusieron que la fotodegradación de hidrolizados de queratina podría ser un método útil para la preparación de hidrolizados con menor peso molecular. En el presente trabajo se observó un aumento en la hidratación, brillo y suavidad en los diferentes tipos de cabello después del tratamiento con un 10% de péptidos de queratina obtenidos por el proceso de hidrólisis enzimática. El uso de plumas, un residuo industrial generado por las aves de corral como fuente de biomasa para el proceso, es muy interesante porque esta materia prima es barata y se transforma bio en un nuevo producto con un valor agregado. Actualmente, los hidrolizados de queratina generalmente se preparan a partir de partes de animales que contienen queratina, como plumas, cuernos, pezuñas, cabello y lana. Los aminoácidos aromáticos (triptófano, tirosina y fenilalanina) y la cistina (aminoácido que contiene azufre) desempeñan un papel fundamental en la fotoquímica de la queratina . Algunas industrias han desarrollado productos que utilizan un complejo de 18 aminoácidos libres derivados de proteínas de trigo, maíz y soja para imitar la composición natural de la queratina. El alto contenido de aminoácidos de azufre de la soja es similar al del cabello y la lana humanos . Sin embargo, la queratina es una proteína insustituible en cuanto a sus propiedades mecánicas y protectoras.
El método enzimático descrito en el presente trabajo puede utilizarse para desechos/residuos industriales en general para producir productos de valor añadido. Estudios previos en la literatura han descrito el uso de queratinasas / peptidasas para reciclar queratina de plumas desechada por la industria avícola . El presente trabajo informa por primera vez sobre el uso de péptidos de queratina en la industria cosmética, especialmente enfocados en el segmento del cuidado del cabello. Teniendo en cuenta todos estos factores, el método enzimático para la producción de péptidos de queratina para productos para el cuidado del cabello es un método atractivo y ecológico con un gran potencial dentro de la industria cosmética.
