2.3.4.1 La estructura
El homodímero apo-sCTLA – 4 se expresó como una proteína de fusión Fc separable de trombina en células CHO en presencia de kifunensina.23 Después de la desglicosilación, el homodímero produjo cristales difractados a espaciamientos Bragg de 1,8 Å, con dimensiones unitarias de celda de a = 43,86 Å, b = 51,46 Å y c = 102,85 Å, y el grupo espacial P212121 (Ref. 130). La estructura se resolvió mediante reemplazo molecular. La unidad asimétrica comprendía un homodímero unido a disulfuro que permitía comparaciones con los complejos sCTLA-4/sB7-1 y sCTLA-4/sB7-2, y con sCTLA-4 unido a una lipocalina de ingeniería.131
Los dos monómeros de la unidad asimétrica estaban compuestos de dominios β-sándwich con topología AGFCC’ y ABED, según lo previsto por Metzler et al.132 Un corto «tallo» de ocho residuos unido a disulfuro en Cys122 enlazó los dominios IgSF con la membrana. Inesperadamente, las dos mitades del homodímero apo-CTLA-4 eran menos similares entre sí que con sus contrapartes complejas, enfatizando que la unión no está acompañada de reordenamientos estructurales a gran escala (Fig. 2.2 H). Las comparaciones de estructuras automatizadas identificaron CD28 y PD-1 como las estructuras más similares a CTLA-4. Diferencias importantes entre CTLA-4 y CD28 fueron: (i) la presencia de una torcedura en la hebra β G de CD28, (ii) cambios en el tamaño del bucle, incluidos los bucles AB, BC y CC’ extendidos en CTLA-4 y un bucle C»D truncado, y (iii) Unión en H de las hebras C’ y C» β resultantes del reposicionamiento del bucle C’C» en CD28. De importancia clave fue la conformación en gran parte idéntica de la secuencia de bucle FG 99MYPPY104 que forma el núcleo de sus superficies de unión a ligandos. Solo se pudo encontrar una molécula de agua en la superficie de unión a ligandos inusualmente seca de apo-CTLA-4, mientras que se detectaron 228 aguas en otros lugares.
Después de CD28 y PD-1, las siguientes estructuras más similares al dominio CTLA-4 V-set fueron 215 dominios V de anticuerpos o TCR, que difieren principalmente en longitudes de bucle solamente. La diferencia r.m.s. para la superposición de CTLA-4 con el dominio TCR Va más similar fue de 2,09 Å para 102 residuos, en contraste con 2,89 Å para 86 residuos para la superposición con d1 de CD2. Importantes características compartidas con el dominio Va incluían el bucle CC ‘largo y protuberancias β conservadas en las hebras β C’ y G que imponían un giro pronunciado en la hoja β de AGFCC’. Especialmente notable fue el alto grado de conservación de secuencias y conformación Ca cerca del bulbo β de la hebra G, es decir, GNGTQIYV (CTLA-4) y GDGTQLVV (Va). En CD2 y CTLA-4, los bucles eran similares, y los dominios diferían en la medida en que: (i) en CD2 no hubo unión en H de las hebras ßA y ßB, (ii) no hubo torsión de la lámina β A’GFCC’ en CD2 debido al reposicionamiento de las protuberancias β, (iii) la posición de la hebra β C» en CD2, pero no CTLA-4, permitió la unión canónica en H y la extensión de la lámina β AGFCC’C», y (iv) CTLA-4 carecía de la torsión en el bucle FG presente en CD2 (y también, por ejemplo, B7-1). El análisis de cincuenta y dos dominios IgSF de V-set utilizando un programa de alineación secuencial de estructuras133 indicó que la familia CD28/CTLA-4 comprende un subgrupo de dominios de V-set distintos de los grupos de CD8, receptores de antígenos y moléculas de «adhesión», por ejemplo, B7-1 y CD2. En general, hubo mayor similitud del subgrupo CD28 / CTLA – 4 con la familia de receptores de antígenos, en comparación con el conjunto de adhesión. El análisis sugirió que las proteínas de la familia CD28/CTLA-4 y los receptores de antígenos compartían un ancestro común posiblemente similar al PD-1, con las dos familias divergiendo temprano.
Apo-CTLA – 4 comprendía un homodímero con sus subunidades adoptando una disposición que favorecía las interacciones bivalentes ortogonales con ligandos posicionados en superficies celulares aposentantes. Las comparaciones con los pares de monómeros CTLA-4 en los complejos B7-1 y B7-2106,107 y el monómero en el complejo de lipocalina131 revelaron una flexibilidad rotacional muy limitada en la interfaz del homodímero y muy pocos, si es que hay alguno, cambios atribuibles a la unión del ligando. Las únicas diferencias fueron evidentes en el complejo B7-2, con un ligero reposicionamiento de los bucles BC y CC’, y de la hebra β de C» y los bucles vecinos, y diferencias conformacionales en la hebra β de G en su terminal C. Estas variaciones locales estaban distantes del sitio de unión al ligando de CTLA-4 y en ningún caso los monómeros apo se diferenciaron sistemáticamente de los cinco monómeros CTLA-4 complejados. Las posiciones de los átomos de la cadena principal de la secuencia 99MYPPY104 eran esencialmente idénticas.
Las estructuras de los complejos formados por CTLA-4 con B7-1 y B7-2, que no se habían comparado previamente, eran bastante diferentes.La sustitución de 130 en B7-2, de Val28 vs Arg29 en B7-1, formó un bolsillo de unión en B7-2 que solo fue llenado en parte por CTLA-4. Esto aseguró que el complejo B7-1/CTLA-4 exhibiera una mejor complementariedad de formas que el complejo B7-2/CTLA-4. Compensando ligeramente esto, la superficie enterrada en B7-2 por CTLA-4 era algo mayor que la de B7-1. En general, B7-1 enlazó el CTLA-4 de una manera aún más rígida que el CTLA-4 acoplado al B7-1. La unión de B7-2 por CTLA-4 era, sin embargo, más compleja y llevaba el sello distintivo de «ajuste inducido».»En CTLA – 4 bound-vs apo-B7-2, hubo un desplazamiento de 2.3–3.5 Å del bucle FG B7-2 hacia CTLA-4, que se inició por una rotación de ~ 120 grados de Phe31 de B7-2 (Ref. 130). Esto produjo una interacción de apilamiento de Phe31 con Pro102 de la secuencia 99MYPPY104 de CTLA-4.
