Kluyveromyces marxianus desarrollo de tolerancia al etanol durante la evolución adaptativa con mejoras significativas de múltiples vías

Resistencia mejorada al etanol después de una evolución de 100 días
El análisis de ADN sugiere que K. marxianus no tiene cambio de ploidía o genes críticos durante la evolución adaptativa
Un recableado global inducido por la evolución de 100 días
KM-100d uso mejorado de etanol
KM-100d biosíntesis de lípidos de membrana mejorada, presión osmótica, estrés antioxidante y plegado de proteínas para resistir el estrés de etanol
Validación de consumo de etanol mejorado y resistencia a múltiples esfuerzos en KM-100d

Resistencia mejorada al etanol después de una evolución de 100 días

La cepa haploide de tipo salvaje K. marxianus se cultivó en medio con etanol al 6% (v/v) a 30 °C durante 100 días aproximadamente 450 generaciones (ver Métodos para más detalles). Hubo un aumento continuo de la biomasa (medida por OD600 diariamente) durante este período (Fig. 1a), lo que indica que la supervivencia celular bajo estrés por etanol puede mejorar. Al final, se obtuvo una población de K. marxianus con una resistencia al etanol muy mejorada (Fig. 1b). A lo largo, KM se refiere a la cepa cruda antes de la evolución, y KM-100d se refiere a la población de K. marxianus después de la evolución de 100 días. La resiliencia máxima de etanol para KM fue de 7% (v / v) y para KM-100d, de hasta 10% (Fig. 1b). Comparamos perfiles de crecimiento entre KM y KM-100d en medios de cultivo con diferentes niveles de etanol(0%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8% v / v, Fig. 1c). En ausencia de etanol, no hubo diferencia significativa entre las cepas. Su diferencia aumentó con el aumento del nivel de etanol y alcanzó el máximo con etanol del 6% (v/v) en medios de cultivo. En tal circunstancia, después de 48 h, la biomasa de KM-100d era casi dos veces mayor que la de Km. Ambas cepas mostraron un crecimiento retardado en medio con etanol al 7% y no crecieron en medio con etanol al 8%. Además, KM-100d también mostró una tasa de crecimiento máximo notablemente mayor que KM al 6% de etanol (Archivo adicional 1: Figura S1).

El análisis de ADN sugiere que K. marxianus no tiene cambio de ploidía o genes críticos durante la evolución adaptativa

Para dilucidar las alteraciones de ADN en KM-100d, realizamos análisis de ploidía de ADN e identificación de mutaciones de ADN. Durante la evolución adaptativa, el contenido de ADN de la población de K. marxianus tiene pocos cambios( archivo adicional 1: Figura S2); por lo tanto, no se produjo ningún cambio de ploidía. Mediante análisis de ADN-seq de KM y KM-100d, ambos mapeados al genoma de referencia de K. marxianus DMKU 3-1042, se obtuvieron los sitios SNP entre KM y KM-100d (archivo adicional 2). Entre los 57 SNP identificados, solo 4 sitios predominaron en la población KM-100d. Tres de ellos se encuentran en la región codificante de los genes SAN1, YAP1 y KHT2; el otro está a 445 bp aguas arriba de ERG26. El sitio 1324 de SAN1 fue mutado de C a T, y en consecuencia el aminoácido correspondiente fue transformado de arginina a cisteína. Sin embargo, según el análisis del Pfam 32.0, esta mutación no cae en ningún dominio proteico identificado. Tanto las mutaciones en YAP1 como en KHT2 son mutaciones sinónimos sin cambio de proteínas. Los hallazgos anteriores sugieren que los cambios en el contexto del ADN están lejos de ser suficientes para apoyar dicha mejora del fenotipo en KM-100d, y la reprogramación transcripcional debe contribuir a esto. Por lo tanto, llevamos a cabo análisis de ARN-seq.

Un recableado global inducido por la evolución de 100 días

Para comprender a fondo la tolerancia al etanol, realizamos un análisis de ARN-seq para comparar las expresiones génicas de las levaduras KM y KM-100d que crecieron en medios con etanol al 4% y al 6% (v/v). Basado en los perfiles de crecimiento (Fig. 1c), se observó que la capacidad de crecimiento entre KM-100d y KM tenía la diferencia máxima a las 48 h; por lo tanto, se recolectaron muestras a las 48 h para el análisis de ARN-seq. Ajuste / log2ratio / ≥ 1 y valor de p < 0.05 como criterio para definir los (DE) genes significativos Expresados Diferencialmente, se realizó la identificación de genes de en siete grupos (Fig. 2, denotado como 1, 2, 3, 4, 5, 6, y 7, respectivamente). En cada grupo se realizó el análisis de acuerdo con la flecha que apuntaba al control. El archivo adicional 3 proporciona valores de expresión y estadísticas de expresión diferencial de todos los genes. Hay una diferencia de expresión global entre KM y KM-100d cuando ambos crecieron en un medio libre de etanol (Fig. Grupo 2①). Las levaduras KM – 100d tienen 1342 genes con una expresión más alta que la de la levadura KM, mientras que solo 188 genes tienen una expresión más baja. En medios con etanol al 4% y 6% (v/v), el número de genes regulados al alza en KM-100d se reduce considerablemente a 415 (Grupo②) y 453 (Grupo③), respectivamente. Sin embargo, el número de genes regulados al alza sigue siendo mucho mayor que el de aquellos con menor expresión (104 y 182 genes, respectivamente). Esos resultados sugieren que las levaduras KM-100d se reconectan transcripcionalmente activando un gran número de genes. La sugerencia fue apoyada además por los cambios de expresión inducidos por el etanol dentro de las levaduras KM y KM-100d. Bajo inducción de etanol al 4% y al 6% (v/v), las levaduras KM tienen 1452 y 1465 genes con regulación ascendente (Grupos ⑥ y⑦), mientras que las levaduras KM-100d tienen solo 631 y 596 genes con regulación ascendente (Grupos ④ y⑤), respectivamente. Además, aplicamos mapa de calor.2 software en paquete R para agrupar genes y grupos basados en valores de log2ratio (Archivo adicional 1: Figura S3) y encontró que el perfil de expresión diferencial génica en el Grupo ① es cercano al del Grupo⑦. En conjunto, las levaduras KM-100d mantuvieron muchas características de expresión inducidas por etanol, incluso si crecieron en un medio libre de etanol. Las características hacen que la célula evolucionada sea más adaptable a la próxima estimulación con etanol, es decir, la levadura KM-100d no necesita activar tantos genes como KM lo hace.

Posteriormente, en cada grupo, se realizó un análisis de enriquecimiento por ontología génica (GO) para genes DE (Archivo adicional 1: Figura S4), y encontró que los términos GO enriquecidos cubrían una amplia gama de procesos fisiológicos básicos celulares, incluida la biogénesis de ribosomas, la biosíntesis de aminoácidos, la reparación del ADN, el procesamiento del ARN, etc., pero no directamente relevante para la resistencia al etanol. Por lo tanto, a continuación, nos enfocamos particularmente en las vías fuertemente asociadas con el metabolismo y la tolerancia del etanol, analizando los genes DE asociados (archivo adicional 4).

KM-100d uso mejorado de etanol

Para facilitar la ilustración gráfica, los valores log2ratio de los genes DE implicados (archivo adicional 4) se subdividieron en cinco intervalos: 1 ~ 2, 2 ~ 3, 3 ~ 4, 4 ~ 5, 5 ~ 6 (y arriba), como se muestra en la Fig. 3.

Se investigó la diferencia entre KM y KM-100d en el consumo de etanol. Como se ilustra en la Fig. 3, pueden existir dos rutas para el consumo directo de etanol, y ambas estaban reguladas en KM y KM-100d cuando se enfrentaban al etanol (Grupos④, Groups, ⑥ y⑦). Una forma es a través de ADH6 citoplásmico, que cataliza etanol a acetaldehído, facilitado por NADP+. El otro es por ATF1 mitocondrial, que promueve la esterificación de etanol con la ayuda de acetil-CoA. Especialmente, en KM-100d bajo estrés de etanol (Grupos ④ y⑤), YGL039W fue regulado para generar más NADP+, y por lo tanto puede suministrar más coenzimas para convertir etanol en acetaldehído para reducir la toxicidad del etanol. En las mitocondrias, para KM expuestos a estrés por etanol (Grupos ⑥ y⑦), solo C2E1P301 y ADH4 se regularon al alza. Mientras que en KM-100d, durante el proceso de etanol a aldehído y acetato, C2E1P301, ALD4, ADH3, ADH4 y ALD6 se regularon al alza (Grupo①). Los cambios mencionados indican que el KM-100d podría adquirir una nueva capacidad para aliviar la toxicidad del etanol al aumentar el consumo de etanol. La teoría explica que KM-100d se realizó sobre KM en medio con etanol.

KM-100d biosíntesis de lípidos de membrana mejorada, presión osmótica, estrés antioxidante y plegado de proteínas para resistir el estrés de etanol

Además de ser consumido, el etanol acumulado influye directamente en la integridad de la membrana celular, altera la presión osmótica interna y externa , perturba la conformación de proteínas e induce la generación de especies reactivas de oxígeno (ROS), causando graves daños a la célula de levadura . A continuación, analizamos los genes de estas vías para detectar daños causados por el antietanol en K. marxianus (Fig. 4).

Después de la evolución impulsada por el etanol, se activó la vía de respuesta al estrés del alcohol en KM-100d. ASR1 , que se trasloca del citoplasma al núcleo al exponerse al etanol, y ETP1 , que actúa como una proteína de retención citoplasmática con un papel en la activación transcripcional dependiente del etanol de genes de proteínas de choque térmico, fueron ambos regulados al alza en KM-100d (Grupo①), y parcialmente regulados al alza en etanol enfrentado a KM (Grupos ⑥ y⑦), lo que sugiere que incluso en un medio libre de etanol, KM-100d puede preparar vías de respuesta para el desafío de etanol, al igual que la respuesta de KM al etanol.

La formación de lípidos de membrana juega un papel importante en mantener la integridad de la membrana celular bajo estrés de etanol . Los ácidos grasos insaturados, los componentes clave en la estructura de la membrana celular, están estrechamente relacionados con la tolerancia al etanol . Ilustrado en la Fig. 4, desde la biosíntesis de acetil-CoA hasta la incorporación de ácidos grasos insaturados en fosfolípidos, los genes involucrados PPT2, FAD2 y TAZ1 se regularon al alza en KM-100d (Grupo①), lo que sugiere que después de la evolución, KM-100d ya puede mejorar la biosíntesis de ácidos grasos insaturados para suministrar más materias primas para la biogénesis de la membrana celular. Y la regulación a la baja de los genes ACC1, TSC13, FAS1 en KM expuestos en etanol (Grupos ⑥ y⑦), está de acuerdo con el informe anterior, que puede explicar la débil tolerancia al etanol de K. marxianus antes de la evolución adaptativa.

Un gran número de genes asociados con la biogénesis lipídica de la membrana celular, incluidos el fosfoglicérido, el esfingolípido y el esterol, se expresaron de manera diferencial bajo estrés por etanol (Fig. 4). Especialmente, los genes involucrados en la biosíntesis de fosfoglicéridos fueron generalmente regulados en KM-100d (Grupo①) y en etanol con cara KM (Grupos ⑥ y⑦), lo que indica que el fosfoglicérido puede ser el componente principal en la membrana celular para la resistencia al etanol. Para la biosíntesis de esteroles, muchos de los genes (por ejemplo, ERG9 y ERG7) se regula en los Grupos de ④ y⑥, y de varios genes fueron reguladas en el Grupo ⑤ (por ejemplo, ERG25) y el Grupo ⑦ (por ejemplo, ERG26), lo que sugiere que los esteroles de la biogénesis puede ser importante para pararse a alta etanol, pero no para bajas de etanol. Además, los genes CKI1, ERG2 y ERG25, involucrados en la biosíntesis de fosfoglicéridos y esteroles, solo se regularon al alza en el Grupo ERS; esta puede ser una de las pistas para el mejor rendimiento del KM-100d que el KM en etanol alto.

La alta concentración de etanol en un medio impone estrés osmótico en las células de levadura . Como se muestra en la Fig. 4, los sensores osmóticos de membrana plasmática (SLN1, OPY2 y SHO1) y los genes (HOG1, SSK1 y SSK2) involucrados en la vía de respuesta aguas abajo se regularon al alza en KM expuestos en etanol bajo (Grupo⑥), e individualmente regulados al alza en KM-100d (Grupo①), en etanol enfrentado a KM-100d (Grupos ④ y⑤), y en etanol enfrentado a KM alto (Grupo⑦). La producción de glicerol es una forma importante de resistencia a la presión osmótica de S. cerevisiae . Cuando KM y KM-100d se enfrentaron al etanol, la mayoría de los genes relacionados con la biogénesis del glicerol se regularon a la baja. Los hallazgos anteriores sugieren que antes y después de la evolución, K. marxiano siempre mejora las vías de detección y transducción de señales de estrés osmótico; sin embargo, su estrategia para resistir el estrés osmótico puede no depender de la ruta de producción de glicerol, debe haber otras formas.

La pared celular proporciona suficiente resistencia mecánica para que la célula pueda soportar la presión osmótica , y la vía secretora no solo transporta las proteínas de la pared celular hacia el exterior, sino que también transfiere lípidos a la membrana plasmática para fortalecer la estructura de la membrana; por lo tanto, estos dos procesos pueden ser responsables del estrés anti-osmótico. Se analizaron los genes de la vía secretora y la biogénesis de la pared celular (Archivo adicional 1: Figura S5). Los genes involucrados en la vía secretora y la biogénesis de la pared celular fueron generalmente regulados al alza en KM-100d (Grupo①), y algunos de ellos también fueron regulados al alza en KM expuestos en etanol (Grupos ⑥ y⑦). Implica que KM-100d no solo mantuvo la regulación ascendente en la vía secretora para KM resistente al estrés de etanol, sino que también amplió ampliamente el alcance de activación de la vía secretora para prepararse para el ataque de etanol; por lo tanto, la mejora de la vía secretora y la formación de paredes celulares puede ser la nueva estrategia KM-100d desarrollada para soportar el estrés osmótico causado por etanol. Por otro lado, para KM y KM-100d expuestos en etanol bajo (Grupos ④ y⑥), muchos genes en la vía secretora fueron regulados a la baja, lo que sugiere que la activación de la vía secretora puede no ser la forma necesaria para que K. marxianus responda al etanol bajo.

Para contra el estrés oxidativo provocado por el etanol (Fig. 4), HYR1 , que funciona como sensor y transductor de estrés hidroperóxido, se reguló al alza en KM y KM-100d, ambos expuestos en alto etanol (Grupos ⑤ y⑦). Los factores de transcripción sensibles al estrés oxidativo SKN7 y STB5 se regularon al alza en KM-100d (Grupo①) y en KM con alto contenido de etanol (Grupo⑦). Para el estrés antioxidante, los genes involucrados en el sistema de superóxido dismutasa (por ejemplo, MTM1 y PRX1) generalmente se regularon al alza en KM-100d, ya sea expuestos en etanol o no (Grupos①, ④ y⑤). Para el sistema de tiorredoxina, los genes (p. ej., MXR1 y TRR1) se regularon al alza en KM y KM-100d, ambos con etanol. También se informó de que la tiorredoxina y su reductasa aumentaban la tolerancia de K. marxianus a múltiples inhibidores derivados de la lignocelulosa . Para el sistema de glutaredoxina, los genes GRX2 y GLR1 solo se regularon en KM-100d expuestos en etanol alto (Grupo ERS). Para la biogénesis del peroxisoma, genes como PEX6 y PEX7 se regularon hacia arriba en KM-100d (Grupo①), y algunos otros genes (por ejemplo, PEX3 e INP2) se regularon hacia abajo en KM y KM-100d cuando se enfrentaron a un bajo nivel de etanol (Grupos ④ y⑥). Lo anterior implica que KM-100d puede fortalecer globalmente la capacidad antioxidante.

Para asegurar el plegado adecuado de proteínas bajo estrés de etanol (Fig. 4), el choque térmico factor de transcripción HSF1 fue reglamentado en KM y KM-100d enfrentan bajas de etanol (Grupos ④ y⑥), un número de acompañante de genes relacionados (por ejemplo, PFD1 y CPR7) fueron reguladas en el KM enfrentan etanol (Grupos ⑥ y⑦), también se mantiene la regulación de la KM-media móvil de 100 días (Grupo①). Algunos genes (por ejemplo, CPR4) regulados a la baja en etanol con cara KM no estaban regulados a la baja en KM-100d. Por lo tanto, KM-100d generalmente puede mejorar el plegado de proteínas para proporcionar un entorno celular más estable.

Se informó que en S. cerevisiae, la acumulación de trealosa era importante para la tolerancia al etanol, debido a que la trealosa funciona como soluto compatible para evitar la entrada de exceso de sales en las células de levadura ; mientras tanto, los genes involucrados en la degradación de la trealosa también fueron inducidos por el etanol, para ajustarlo a la concentración óptima . Para K. marxianus (Fig. 4), encontramos que los genes que participan en la biosíntesis y degradación de la trehalosa (p. ej., NTH1 y TSL1) se regularon comúnmente cuando se trataron con etanol bajo (Grupos ④ y⑥), pero no se regularon gen en el metabolismo de trehalosa cuando se expusieron en etanol alto (Grupos ⑤ y⑦). Esto sugiere que en K. marxianus, la acumulación de trealosa puede ser una estrategia especial para hacer frente a un etanol bajo, pero no para un etanol alto.

Las expresiones diferenciales de 15 genes involucrados en las vías tolerantes al etanol anteriores se validaron con el análisis RT-qPCR (Fig. 5). Expresiones de genes en el Grupo ① (Fig. 5a) eran generalmente reguladas. Por otro lado, la regulación ascendente de los genes en el Grupo ④ (Fig. 5d) y el Grupo Group (Fig. 5e) no era tan alto como en el Grupo ⑥ (Fig. 5b) y el Grupo Group (Fig. 5c). Nuestro análisis confirmó que los genes que contribuyen a la tolerancia al etanol se activan continuamente en KM-100d incluso después de la retirada del estrés de etanol. La expresión génica continua podría ser útil para estabilizar el entorno intracelular y beneficiar el crecimiento de las células en el próximo estrés.

Validación de consumo de etanol mejorado y resistencia a múltiples esfuerzos en KM-100d

Se comprobó el crecimiento de levaduras KM y KM-100d en medio YNB con diferentes fuentes de carbono (Fig. 6a). Tanto las levaduras KM como KM-100d tienen la misma capacidad de utilizar glucosa como única fuente de carbono. Sin embargo, en presencia de etanol al 1% y al 2% (v/v) como única fuente de carbono, las levaduras KM-100d crecieron mejor que las levaduras Km. El resultado apoya nuestra hipótesis de que las levaduras KM-100d utilizaron etanol de manera más eficiente que las levaduras Km.

Por otro lado, basado en la Fig. 4, KM-100d puede desarrollar resistencia a múltiples tensiones causadas por etanol simultáneamente, incluido el estrés osmótico, el estrés oxidativo y el estrés térmico (para proteínas de choque térmico tomadas como chaperonas para el plegado de proteínas). Para evaluar las tolerancias de las levaduras a múltiples esfuerzos, realizamos el ensayo de viabilidad celular para varias temperaturas, oxidación y presiones osmóticas, respectivamente (Fig. 6b a d). En la circunstancia básica (es decir, 30 ° C, 0% de H2O2 y 0 M de NaCl), falta una diferencia de viabilidad entre las levaduras KM y KM-100d. Sin embargo, en presencia de las diferentes tensiones, las levaduras KM-100d exhiben una viabilidad significativamente mejor que la de las levaduras Km. Además, las ventajas son más significativas mientras que las tensiones se vuelven más graves (Fig. 6b a d). Esperábamos que las tolerancias a múltiples tensiones pudieran introducir nuevas características a las levaduras en la producción de etanol.

Investigamos más a fondo la productividad del etanol entre las levaduras KM y KM-100d bajo múltiples tensiones. En circunstancias básicas (30 ° C y etanol al 0%, Fig. 6e), las levaduras KM y KM-100d son casi iguales tanto en el consumo de glucosa como en la producción de etanol. Sin embargo, las levaduras KM-100d mostraron ventajas significativas en presencia de altas temperaturas (45 °C, Fig. 6f) o más etanol (6% u 8%, Fig. 6g, h); el ambiente común generalmente ocurrió en la última etapa de la fermentación. Se realizó un análisis RT-qPCR para levaduras KM y KM-100d fermentadas en medios con etanol al 6% a 48 h, 72 h y 120 h (Fig. 7). La mayoría de estos genes tolerantes al etanol se regularon al alza en KM-100d en comparación con KM, especialmente en la etapa más temprana (48 h) para el ajuste inicial al etanol (Fig. 7). En resumen, al regular las expresiones de genes tolerantes al etanol, las levaduras KM-100d superaron a las levaduras KM en entornos estresantes con un mayor rendimiento de etanol.