Discusión
La producción observada de altos niveles de actividad de la proteasa durante el cultivo continuo de K. sedentarius facilitó la purificación de dos proteasas, P1 y P2, que eran activas contra la azocaseína, la cadena β de la insulina, la queratina extraída del callo humano y el callo sin procesar. Las características generales de estas enzimas, incluido el rango de sustrato, la temperatura y el pH óptimos y la sensibilidad a los inhibidores de la proteasa, sugieren que son bioquímicamente similares y es probable que pertenezcan a la familia de las serinas proteasas alcalinas. Estas proteasas son producidas por una amplia variedad de microorganismos y actúan como endopeptidasas (Rao et al. 1998).
Si las enzimas también se pueden clasificar como queratinasas, sin embargo, sigue siendo un tema de debate. Las queratinasas, por definición, deben ser capaces de hidrolizar queratina nativa pura. La extracción de queratina, sin embargo, solo se puede lograr mediante un tratamiento previo con agentes desnaturalizantes para separarla de las proteínas no queratinas. Los tratamientos mecánicos como la molienda de bolas resultan en la escisión de enlaces disulfuro, que hacen que la proteína sea más susceptible a la digestión proteolítica por proteasas como tripsina y proteinasa K, que no están clasificadas como queratinasas (Noval y Nickerson 1959). Del mismo modo, el uso de sustratos esterilizados por calor en ensayos de queratinasa también ha sido criticado porque el calentamiento puede causar desnaturalización de queratina.
Aunque en el presente estudio se utilizó callo finamente molido como sustrato enzimático, el líquido sobrenadante de cultivo fue activo contra trozos de callo intactos. Por lo tanto, incluso si las dos proteasas no son estrictamente queratinasas, degradan el callo humano in vitro y hay alguna evidencia de que esto también ocurre in vivo (Nordstrom et al. 1987).
Las proteasas también se han clasificado como queratinasas como resultado de su actividad sobre queratina reducida, en cuyo caso se han añadido agentes reductores a la mezcla de ensayo enzimático o se han utilizado durante la extracción de queratina. Aunque la actividad queratinolítica de una serie de bacterias cutáneas se ha estudiado utilizando queratina «nativa» como sustrato, el agente reductor, ditiotreitol (TDT), se incluyó en la mezcla de ensayo. Por ejemplo, cuando se estudió la actividad aparente de la queratinasa de Staphylococcus epidermidis en ausencia de TDT, no se detectó actividad (Mikx y de Jong 1987). De manera similar, una serina proteasa de queratinas degradadas por Candida albicans que se habían extraído del estrato córneo de suelas humanas con urea l‐1 de 8 mol en Tris−HCl y β‐mercaptoetanol (Hattori et al. 1984). En el presente estudio, la queratina hidrolizada P1 y P2 que se había extraído de callos de pies humanos con urea y β-mercaptoetanol, pero que, lo que es más importante, también fue capaz de degradar callos no tratados.
El estrato córneo y el callo humano es una estructura compleja y estable de la que la queratina es un componente importante. Hay 30 genes humanos para la queratina, de los cuales 18 se expresan en la piel (Fuchs 1995). Un resumen de la base de datos de queratina ha demostrado que cada queratina tiene sitios de escisión potenciales para las proteasas y Asp‐Arg y Gly‐Arg son los más comunes. Si los filamentos de queratina se rompen inicialmente en estos lugares, es posible que la degradación gradual de estas unidades más pequeñas ocurra en sitios de escisión secundaria, produciendo un rango de tamaño de fragmentos de péptidos, como se muestra por el análisis del ataque de proteasa en queratinas extraídas de callos humanos. Los resultados presentados en la Fig. 3b indique dos valores de pH óptimos para la actividad degradante de callos de P2. Una posible explicación es que hay dos enzimas en la muestra. Esto parece poco probable porque la muestra enzimática utilizada fue altamente purificada, como se muestra en PAGE con tinción de plata (ver Fig. 1, carril 6). No se puede descartar la posibilidad de dos enzimas degradadoras de callos en la muestra P2 purificada con una movilidad muy similar en la PÁGINA. Sin embargo, la misma muestra se probó utilizando los mismos tampones con el ensayo de azocaseína y solo se detectó un pH óptimo a pH 10·2. Una explicación alternativa es que la compleja interacción sustrato/enzima del callo a diferentes PH es un equilibrio de la actividad enzimática y sutiles cambios conformacionales del sustrato, lo que conduce a un pH dual óptimo.
Esta investigación ha demostrado que K. sedentarius produce dos proteasas extracelulares que tienen actividad degradante de callos. Se ha determinado información básica sobre sus tamaños moleculares relativos, sus iPs. Sin embargo, los estudios cinéticos enzimáticos convencionales no pudieron abordarse porque el sustrato natural utilizado en estos experimentos in vitro era una mezcla compleja de polímeros, insoluble en agua. El aumento de la actividad enzimática de P2 en presencia de sal de 800 mmol 1-1 puede ser relevante para la supervivencia del microorganismo en la piel humana, que tiene una concentración de sal cambiante dependiendo de la actividad de la glándula ecrina determinada por la velocidad de ejercicio de la persona y las temperaturas ambientales. No se ha abordado el mecanismo o mecanismos implicados en el efecto del cloruro de sodio. Se sugiere provisionalmente que el cloruro de sodio puede afectar a la estructura terciaria de la enzima y el sustrato, o a ambos, para mejorar el acceso del sitio activo de las enzimas a los sitios específicos de escisión del sustrato.
La explicación más simple de los resultados observados es que en un sobrenadante de cultivo de K. sedentarius hay dos enzimas degradadoras de callos, serina proteasas, que también solubilizan la queratina humana presente en el callo. Es posible que K. sedentarius produce una proteasa, codificada por un gen, y esa actividad autocatalítica u otra proteasa produce dos enzimas de diferentes pesos moleculares. Alternativamente, hay dos genes que codifican dos enzimas independientes y estrechamente relacionadas. Esta última hipótesis está respaldada por un estudio previo (Holland et al. 1992). Las muestras de cultivo continuo de K. sedentarius en estado estacionario a diferentes velocidades de dilución analizadas en PAGE, y superpuestas con caseína, mostraron dos enzimas, una constitutiva y la otra detectada a altas concentraciones a bajas velocidades de dilución. Es importante destacar que a velocidades de dilución cercanas a µmax no se detectó. La determinación de la secuencia de aminoácidos N‐terminales de polipéptidos P1 (21 residuos) y P2 (15 residuos) mostró que eran totalmente diferentes. Este resultado, junto con la información del experimento de cultivo continuo, sugeriría que las enzimas están codificadas de forma independiente.
Los resultados de esta investigación han fortalecido la hipótesis de que las proteasas específicas de K. sedentarius pueden explicar la degradación de callos característicos de la queratólisis sin hueso. La evidencia hasta la fecha también sugiere que dos proteasas están involucradas y que son activas en el pH del sitio de la piel, el pH 6·3-6·9 (Marshall et al. 1988). La interpretación de los resultados obtenidos de los experimentos in vitro al medio ambiente in vivo puede cuestionarse, a pesar de que se utilizó callo humano como sustrato. Idealmente, se deben tomar biopsias de piel humana que incluyan áreas de piel normal y con hueso. La presencia y la ubicación o ausencia de las proteasas se pueden determinar mediante técnicas histológicas utilizando anticuerpos monoclonales como sondas para las proteasas y K. sedentarius. Sin embargo, no se daría aprobación ética para las biopsias del lugar requerido, el sitio de soporte de carga del pie, de un número representativo de personas. La participación de K. sedentarius en la queratosis sin hueso por un mecanismo de producción de proteasas que degradan la queratina no ha sido probada formalmente. Sin embargo, no hay evidencia que refute las hipótesis y su credibilidad se ha visto reforzada por los resultados presentados aquí. Se han presentado pruebas in vitro sólidas que implican a K. sedentarius y sus enzimas extracelulares que degradan los callos en la queratólisis sin hueso. Con pH normales de la piel e hidratación de la superficie, la producción y actividad de estas enzimas será baja, siendo la P1 la más activa. En condiciones ambientales de oclusión y en una higienización deficiente, el pH de la piel se mueve hacia y ligeramente por encima de la neutralidad. Estas condiciones favorecen a P2. Ambas enzimas son probablemente enzimas carroñeras, lo que permite a K. sedentarius obtener fuentes de carbono y nitrógeno, pequeños péptidos, encerrados en el polímero complejo residente e insoluble, la queratina. En la actualidad se desconoce la regulación de la producción de estas enzimas, al igual que sus contribuciones relativas a la degradación del callo in vivo. Además de las implicaciones clínicas, las proteasas queratinolíticas tienen un valor considerable para el sector comercial, ya que son útiles en una serie de procesos industriales, incluida la degradación de los desechos de queratina de las industrias avícola y del cuero (Shih 1993; Onifade et al. 1998). La alta actividad queratinolítica de la K. las proteasas sedentarius a temperaturas y pH relativamente bajos, en comparación con muchas otras proteasas, presentan una aplicación potencial de estas enzimas en la industria biotecnológica.
