Ensayo de cinasa
Preparado por Swathi Arur
Proteína Quinasa (soluciones madre de 1-10 mg/ml de quinasas puras): para estos ensayos, utilizo quinasa ERK2 purificada (NEB). Para cada enzima, es importante determinar el tampón óptimo, la fuerza iónica y el pH para la actividad. Si no se han establecido estas condiciones, el protocolo que se indica a continuación puede utilizarse como punto de partida.Substrato
(solución madre de 10 mm): Los substratos normalmente contienen una Serina /Treonina en un motivo de sitio de fosforilación. Como control utilizo la Proteína Básica de Mielina (obtenida de Sigma), que fue utilizada por NEB para caliberar la quinasa ERK2.
Además, los sustratos deben tener una carga neta positiva para facilitar la unión a los filtros de fosfocelulosa utilizados en el ensayo. Para la unión cuantitativa al papel de fosfocelulosa, se recomienda tener al menos 2 residuos básicos y un amino terminal libre. Si no se conoce un motivo de sitio de fosforilación, se puede usar un sustrato de tirosina cinasa general. Por ejemplo, «la Proteína Básica de Mielina» (es un sustrato para muchos MAPKs). Para las reacciones iniciales, se debe utilizar una concentración de sustrato de 0,7-1,5 mm. Para determinar los parámetros cinéticos para la fosforilación del péptido sintético, se requiere un rango de concentraciones de péptidos
10X Tampón de quinasa: contiene 5 mg/ml de ASC (para evitar la adsorción de quinasa al tubo de ensayo), 150 mm Tris-Cl (pH 7,5).
ATP / MgCl2 (comprado en Upstate Biotech-Magnesium/ATP Cocktail # 20-113): una solución madre de 1-5 mm es conveniente. Tenga en cuenta que la mayoría de los MAPK tienen valores de KM para ATP en el rango de 10-150 uM, por lo que para los experimentos cinéticos es importante usar concentraciones saturantes de ATP para llegar a los valores de Km y Vmax para los péptidos.
ATP-10 mCi / mL.
Ensayos de cinasa ERK2
a) ENSAYO DE AUTORRADIOGRAFÍA:
- Se realiza un ensayo estándar de quinasa en un volumen de 25 ul:
- 2,5 ul de 10X tampón de quinasa
- 5 ul de 1,0 mM MgCl2 / ATP (concentración final de 0,2 mM)
- ATP (100-500 cpm/pmol)
- 3 ul de sustrato de 10 mM (1.Concentración final de 2 mm)
- 1 U de la quinasa ERK2
- H2O a 25 ul
1. Antes de los experimentos, prepare un cóctel que contenga suficiente tampón, ATP y ATP para completar los ensayos. Para ensayos a diferentes concentraciones de sustrato, el sustrato debe diluirse y añadirse por separado a cada tubo. Después de dispensar el cóctel en tubos de microcentrífuga de 1,5 ml, coloque los tubos en un baño de agua a 30 grados C durante 30 minutos. Las reacciones se deben iniciar mediante la adición de quinasa y permitir que continúen a 30 grados C.
2. Después del tiempo deseado, termine las reacciones agregando 2 X tampón de muestra SDS y déjese de gel.
3. Seque el gel en un papel Whatman 3.0, exponga el gel seco a un autorradiograma y mantenga el casete a-70C durante 2 horas. (para exposiciones más largas, asegúrese de que la película esté seca de nuevo antes de colocarle un nuevo autorradiograma).
b) ANÁLISIS CINÉTICO:
1. Realice el ensayo de cinasa como se indica anteriormente, esta vez use diferentes concentraciones de los sustratos a partir de 50 nm a 1 mm. Detenga la reacción después de 30 minutos agregando 45 ul de ácido tricloroacético (TCA) frío como hielo al 10% a cada reacción. Vórtice las reacciones.
3. Girar durante 2 minutos en microcentrífuga (10K rpm).
4. Coloque 35 ul de los sobrenadantes en círculos de filtro de fosfato de celulosa Whatman P81 de 2,1 cm de diámetro.
6. Lave los círculos de filtro P81 tres veces con 500 ml de ácido fosfórico frío al 0,5% (5-10 minutos por lavado). El progreso de los pasos de lavado se puede seguir quitando el círculo del filtro P81 para una reacción en blanco y comprobándolo con un contador Geiger.
7. Lavar una vez con 200 ml de acetona a temperatura ambiente durante 5 minutos.
8. Deje que los círculos del filtro se sequen a temperatura ambiente.
9. Coloque círculos de filtro en viales de centelleo y mida la incorporación de 32P contando las almohadillas secas en un contador de centelleo. La actividad específica del ATP en una reacción de quinasa (por ejemplo, en cpm/pmol) se puede determinar detectando una pequeña muestra (2-5 ul) de la reacción en un círculo de filtro P81 y contando directamente (sin lavado). Los recuentos por minuto obtenidos en la reacción de la quinasa (menos el espacio en blanco) se dividen por la actividad específica para determinar los moles de fosfato transferidos en la reacción.
Cinética de la Fosforilación del sustrato
Los parámetros cinéticos para la fosforilación de un sustrato mediante un MAPK pueden determinarse utilizando una variación del protocolo anterior.
1. Realice una reacción a una alta concentración de sustrato para establecer que la proteína es un sustrato.
2. Varíe la concentración de enzimas en el ensayo. La tasa de fosforilación del sustrato debe ser proporcional a la concentración enzimática en las condiciones del ensayo. Este experimento también se utiliza para determinar la cantidad de enzima necesaria para los estudios cinéticos.
Para determinar las tasas, se debe llevar a cabo un curso de tiempo de fosforilación del sustrato. En este caso, prepare una reacción enzimática más grande (usamos 150 ul). En los puntos de tiempo deseados, extraiga 25 alícuotas de ul y transfiéralas a tubos de microcentrífuga que contengan 45 ul de TCA helada al 10%, y analice las reacciones como se describió anteriormente. La fosforilación del sustrato debe ser lineal con el tiempo, y para la medición de constantes cinéticas se deben usar las tasas iniciales de reacción (5%).
3. Varíe la concentración de sustrato en el ensayo. Utilice una gráfica de velocidad vs. concentración de péptidos para obtener una estimación inicial del valor de Km. En esta medición inicial se debe utilizar una amplia gama de concentraciones de sustrato (por ejemplo, de 20 uM a 2 mm).
4. Para determinar Km (sustrato) y Vmax , varíe la concentración del sustrato y mida la velocidad de transferencia de fosfato. Un buen rango de concentraciones de sustrato son los siguientes múltiplos de Km: 0.125 x Km, 0.25 x Km, 0,5 x Km, 1.0 x Km, 2.0 x Km, 4.0 x Km, 8.0 x Km. Las reacciones deben llevarse a cabo por triplicado para obtener los mejores resultados.
5. Las constantes cinéticas se determinan por mínimos cuadrados ponderados no lineales que se ajustan a la velocidad hiperbólica vs. gráficas que utilizan programas iterativos como NFIT (Island Products, Galveston, TX).
CÁLCULO de RAR:
RAR: Relación Aceptor relativa = Vmáx / Km definida como una medida general de la capacidad de una proteína para funcionar como sustrato.
Normalizo el RAR de un sustrato dado con la Proteína Básica de Mielina, es decir, calculo el valor de RAR para cada sustrato y luego lo divido por el valor de RAR de la Proteína Básica de Mielina (estableciendo así MBP en 1,0).
