Mantenimiento y reservas de pez cebra: El pez cebra (Danio rerio) se levantó y se clasificó de acuerdo con los protocolos establecidos30.Líneas transgénicas utilizadas fueron Tg(kdr-l:ras-mCherry)s91631, Tg(fli1ep:Lifeact-EGFP)zf49532, Tg(fli1:myr-EGFP)ncv233, Tg(fli1:myr-mCherry)ncv134, Tg(fli1:Lifeact-mCherry)ncv733, Tg(fli1:GAL4FF)ubs37, Tg(UAS:EGFP-UCHD) ubs1835, TgBAC(pdgfrb:GFP)ncv2236 y Tg (kdrl:EGFP)s84337. Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Sucursal de RIKEN Kobe (IACUC).
Plásmidos y oligonucleótidos: El pez cebra marcksl1a, marcksl1b y fscn1a se clonaron mediante PCR a partir de ADNc de embriones de 1 dpf utilizando el kit de clonación NEB® PCR. Todos los constructos de expresión utilizados en este estudio se generaron a través de la clonación Gateway® y / o la clonación In-Fusion® utilizando plásmidos de Tol2Kit38. Se generaron plásmidos con Marcksl1a y Marcksl1b mutados utilizando el kit de mutagénesis dirigida al sitio Q5® (NEB). Los vectores que contienen shRNA se construyeron mediante la ligadura de la secuencia de shRNA entre los sitios EcoRI y PmeI aguas abajo del promotor U6 del vector pEGFP-U6 modificado39 (un regalo de Zuoshang Xu, plásmido de Addgeno #19799). La secuencia de blanco para MARCKSL1 humano es 5 ‘- GTGTGAACGGAACAGATGATG-3’. La secuencia de shRNA codificada 5′ – GAGTCATGGGTCAGTTATATG-3 ‘ fue diseñada como una secuencia no coincidente (subrayada) de shRNA MARCKSL1. Los vectores que contenían ratones Marcksl1, Marcksl1-S120A/T148A/T183A (Marcksl1-AAA) y Marcksl1-S120D/T148D/T183D (Marcksl1-DDD) subclonados en pEGFP-N1 (Clontech)10 fueron regalos de Eleanor T. Coffey (Universidad de Turku). Una información detallada sobre los plásmidos y los cebadores utilizados en este estudio se puede encontrar en las Tablas suplementarias 1 y 2, respectivamente.
Aislamiento de ARN y síntesis de ADNc: El ARN total se aisló utilizando el reactivo TRI (Epigenética) y el kit de MicroPrep de ARN Direct-zolTM (Zymo Research) y el ADNc se sintetizaron utilizando el sistema de síntesis de Primera hebra SuperScript III® (Invitrogen) de acuerdo con los protocolos del fabricante.
Expresión en mosaico de construcciones y líneas de peces cebra transgénicos: Se inyectaron constructos de expresión basados en Tol2 (5-10 pg) en embriones de pez cebra de una sola célula con 50 pg de ARNm transposasa de Tol2 transcritos del vector NotI-linealizado pCS-TP (un regalo de Koichi Kawakami, Instituto Nacional de Genética, Japón) utilizando el kit mMESSAGE mMACHINE SP6 (Invitrogen). Para la expresión en mosaico de transgenes, los embriones se analizaron a 1 ó 2 dpf después de las inyecciones. Para generar líneas rk25 de Tg(fli1ep:myl9b-EGFP)y rk26 de Tg(fli1ep:EGFP-PLC1δPH), los embriones inyectados se criaron a adultos y se examinaron en busca de fundadores.
Generación de mutantes marcksl1a y marcksl1b de pez cebra: los mutantes marcksl1a se generaron mediante mutagénesis mediada por CRISPR / Cas9. Un ARN de una sola guía (sgRNA) dirigido al segundo exón (Suplemento Fig. 4a) se generó utilizando un protocolo independiente de clonación40. El complejo RNP Cas9 / sgRNA se ensambló justo antes de la inyección y después de 5 minutos de incubación a temperatura ambiente, se inyectaron conjuntamente 200 pg de proteína Cas9 (Invitrogen) y 100 pg de sgRNA en un estadio unicelular Tg(fli1ep:Lifeact-EGFP)zf495;Tg(kdr-l:ras-mCherry)s916 embrión. los mutantes marcksl1b fueron generados por mutagénesis mediada por TALEN. TALEN dirigido al primer exón de marcksl1b (Suplemento Fig. 4b) se diseñó utilizando el Targeter de nucleótidos efectores TAL 2.0 (https:// tale-nt.cac.cornell.edu/node/add/talen-old) y fueron ensamblados a través del método Golden Gate 41. Los di-residuos variables de repetición de TALEN (RVD) se clonaron en un vector RCIscript-GoldyTALEN (Addgeno) y los ARNm tapados para cada TALEN se transcribieron in vitro a partir de plásmidos de expresión SacI-linealizados utilizando el kit mMESSAGE mMACHINE T3 (Invitrogen). Etapa unicelular Tg (fli1ep:Lifeact-EGFP)zf495; Tg (kdr-l:ras-mCherry)los embriones s916 fueron microinyectados con 200 pg de ARN (100 pg de cada ARNm TALEN izquierdo y derecho). Los fundadores de F0 se identificaron cruzando peces inyectados con TALEN o CRISPR / Cas9 con peces de tipo silvestre y seleccionando a las crías en busca de mutaciones a 2 dpf utilizando el ensayo de endonucleasa I (NEB) T7 (para peces inyectados con TALEN) o la secuenciación de Sanger (para peces inyectados con CRISPR/Cas9). Brevemente, se aisló ADN genómico de grupos de cinco embriones utilizando el método hotshot42 y se amplificaron las regiones genómicas correspondientes. Las mutaciones se evaluaron mediante secuenciación directa de productos de PCR purificados. La progenie F1 de F0 positivo se elevó a la edad adulta y se identificaron portadores heterocigotos para mutaciones mediante un análisis de PCR de recorte de aletas y genotipado de rutina utilizando los mismos cebadores.
Durante el cribado se identificaron seis alelos mutantes en marcksl1a y cinco alelos mutantes en marcksl1b (Suplemento Fig. 13). El alelo rk23 contiene una deleción de 2 nt que conduce a un cambio de marco después del aminoácido 51 y un codón de parada prematura en el aminoácido 56 después de 5 aminoácidos sin sentido (Suplemento Fig. 4a, c). El alelo rk24 contiene una deleción de 5 nt que conduce a un cambio de marco después del aminoácido 13 y un codón de parada prematuro en el aminoácido 17 después de 4 aminoácidos sin sentido (Suplemento Fig. 4b, d). Por estas razones, consideramos que marcksl1ark23 y marcksl1brk24 son alelos nulos y centramos nuestras investigaciones en el análisis de estos mutantes.
Imágenes vivas: Los embriones fueron montados en un 0,8% de agarosa de baja fusión (Bio-Rad) en un medio E3 que contenía 0,16 mg/ml de tricaína y 0,003% de feniltiourea. Las pilas z confocales se adquirieron utilizando un microscopio confocal de disco giratorio Olympus IX83/Yokogawa CSU-W1 invertido equipado con una cámara Zyla 4.2 CMOS (Andor). Se obtuvieron imágenes de campo brillante con el microscopio Leica M205FA. Las imágenes se procesaron utilizando Fiji (NIH).Ablación con láser: Las ablaciones con láser se realizaron utilizando un láser de 405 nm (Andor) y un módulo FRAPPA (Andor) instalados en un microscopio confocal Olympus IX83/Yokogawa CSU-W1 invertido con un objetivo de inmersión en agua Olympus UPLSAPO 60x/NA 1.2. Se aplicaron tres ablaciones láser secuenciales con un tiempo de permanencia de 1000 µs cada una con una potencia láser del 51%.
Microangiografía: La microangiografía se realizó en embriones de tipo salvaje, marcksl1ark23, marcksl1brk24 y marcksl1ark23;marcksl1brk24. En total, se inyectaron 2 y 3 embriones dpf con dextrano tetrametil rodamina 1-2 nL o dextrano fluoresceína (MW = 2000 kDa, Invitrogen) a 10 mg/ml y se tomaron imágenes inmediatamente. Las pilas z confocales se adquirieron con un objetivo Olympus UPLSAPO 10×/NA 0.4. Para cubrir todo el embrión, se tomaron imágenes de varias regiones y se cosieron usando el complemento de cosido en Fiji43.
Trasplante celular:Se recolectaron grupos de 15-25 células donantes de marcksl1ark23;embriones mutantes marcksl1brk24 en el fondo Tg(kdr-l: ras-mCherry)s916 de una posición aleatoria en el blastodermo y se trasplantaron a la zona marginal lateral en el blastoderm44 de embriones receptores de tipo salvaje a 4,5–6 hpf. La extracción y el trasplante se realizaron utilizando un microinyector de aceite CellTram ® 4r (Eppendorf) con un capilar de vidrio de borosilicato GC100-15 (Harvard Apparatus Ltd) fabricado con un extractor de micropipetas horizontal P-87 (Sutter Instrument Co.) y un microforge MF-900 (Narishige) para obtener una punta lisa en forma de cuchara. Durante el trasplante, los embriones se mantienen en placas de petri recubiertas de agarosa con tampón E2 de 0,5 x . En 2 dpf, se seleccionaron embriones con VSI positivos para mCherry para microangiografía e imágenes. Se realizaron un total de ocho trasplantes independientes.
Tratamientos químicos: Latrunculina B (Milipora de Merck) se disolvió en DMSO a 1 mg/ml y se almacenó a -20 °C. CK666 (SIGMA) se disolvió en DMSO a 50 mM y se almacenó a 4 °C. Todos los compuestos se diluyeron a la concentración deseada en tampón E3.
Transfección, reducción de proteínas mediada por siRNA y experimento de esfuerzo cortante: Los HUVEC (Lonza, C-2519A) se cultivaron en medio EGM (Lonza) y se utilizaron hasta el paso 4. Para las transfecciones de plásmidos, las células se sembraron en medio Opti-MEM (Gibco) a 5,8 × 104 células/cm2 en cubreobjetos recubiertos de poli-l-lisina y gelatina y se transfirieron con 2 µg de plásmido utilizando Lipofectamina 3000 (ThermoFisher Scientific). Dos horas después de la transfección, el medio Opti-MEM se cambió a medio EGM sin antibióticos. Para la transfección de ARNip, HUVECs (7.9 × 104 células / cm2) se transfectaron con siRNA de 20 nM utilizando reactivo DharmaFECT1 (Dharmacon). La transfección se repitió después de 24 h. Las células se cultivaron durante 24 h adicionales antes de la extracción o fijación total del ARN. El siRNA-SMARTpool (Dharmacon) de MARCKSL1 humano ON-TARGETplus se utilizó para derribar MARCKSL1. El grupo no objetivo de ON-TARGETplus (Dharmacon) se utilizó como transfección de siRNA de control. Las células se fijaron con un 4% de PFA / PBS, se permeabilizaron con un 0,1% de Tritón X-100 y se teñieron con DAPI de 14 µM para el etiquetado de núcleos, Alexa 568-faloidina (1:1000, ThermoFisher Scientific) para visualizar la actina F y el anticuerpo anti-VE-cadherina (1:100, Señalización celular) seguido de un anticuerpo secundario anti-conejo Alexa 488 (1:1000, ThermoFisher Scientific) para marcar las uniones CE.
Para experimentos de esfuerzo cortante, los HPAEC (Lonza) se cultivaron a 1000-1500 células/mm2 en un plato recubierto de gelatina al 1% en medio EGM-2 (Lonza) y se utilizaron antes del paso 9. Las células fueron expuestas a un esfuerzo cortante estático o laminar a 15 dyn / cm2 durante 0,5,1 o 6 h utilizando un aparato de tipo placa paralela45, 46. Un lado de la cámara de flujo consistía en una placa de vidrio recubierta de gelatina al 1% sobre la que descansaban los HPAEC cultivados, y el otro lado consistía en una placa de policarbonato. Sus superficies planas se mantuvieron separadas a 200 µm con una junta de teflón. La cámara estaba provista de una entrada y una salida para el fluido, y la entrada estaba conectada a un depósito superior con un tubo de silicona. La salida estaba abierta a un embalse inferior. El flujo era impulsado por una bomba de rodillos / tubos. El fluido (medio EGM-2) pasó del depósito superior a través de la cámara de flujo al depósito inferior. El caudal se monitorizó con un caudalímetro ultrasónico de tiempo de tránsito (HT107, Sistemas Transónicos) colocado en la entrada, y se controló cambiando la diferencia de altura entre el depósito superior y la salida de la cámara de flujo. La intensidad del esfuerzo cortante (τ, dinas/cm2) que actúa sobre la capa CE se calculó utilizando la fórmula τ = 6µQ/a2b, donde μ es la viscosidad del perfusado (equilibrio), Q es el volumen de flujo (ml/s), y a y b son las dimensiones de la sección transversal de la trayectoria de flujo (cm). Después de la exposición al esfuerzo cortante, se aisló el ARN total para qPCR.
PCR cuantitativa en tiempo real: qPCR se realizó utilizando 1 µL del ADNc, generado a partir de 150 ng (HPAEC) o 500 ng (HUVEC) de ARN total, en una mezcla de reacción de 10 µL que contenía 1X Luna Universal qPCR Master Mix (NEB) y cebadores de avance y retroceso de 400 nM. Las reacciones se ejecutaron en el instrumento ABI Prism 7900HT en cuadruplicado. Los datos se analizaron con el software RQ Manager (Applied Biosystems) y se calculó la expresión relativa del ARNm MARCKSL1 con el método 2−δδct47 utilizando GAPDH como gen de referencia.
Hibridación in situ de montura completa: La hibridación in situ de montura completa se llevó a cabo de acuerdo con el protocolo normal48. Los embriones se fijaron en AFP al 4% a 24, 48 y 72 hpf y se permeabilizaron con proteinasa K de 10 µg/ml.La hibridación se realizó en tampón que contenía sulfato de dextrano sódico al 5% (MW = 500 kDa) a 70 °C durante la noche. Después del lavado por stringency, las muestras se bloquearon con reactivo de bloqueo al 2% (Roche) en tampón de ácido maleico y se incubaron durante la noche con anticuerpo anti-digoxigenina (DIG), conjugado con fosfatasa alcalina (Roche, 1:5000) a 4 °C. Los embriones se teñieron con solución NBT/BCIP (Roche) en tampón de tinción . Los embriones se eliminaron en glicerol al 70% durante la noche y se tomaron imágenes con el microscopio Leica M205FA. Las ribosondas marcksl1a y marcksl1b de 1,2 kb de longitud etiquetadas con DIG se generaron a partir de plásmidos que codificaban los CDNAS de longitud completa utilizando kits MEGAscript SP6 o T7 (Invitrogen).Secuenciación de ARN unicelular
: Se aislaron CE de embriones transgénicos Tg (kdrl: EGFP)s843. La clasificación de células se llevó a cabo con el Clasificador de células FACSAriaII (BD Bioscience). La suspensión unicelular se cargó en el sistema Chromium de 10X y las bibliotecas de ADNc se construyeron utilizando el kit de GEMA, Biblioteca y Cuentas de gel v2 de Chromium Next GEM de una sola célula de 3′ (Genómica de 10X) de acuerdo con el protocolo del fabricante. La biblioteca se secuenció en el secuenciador Illumina HiSeq 1500 (Illumina, EE. UU.). Se utilizó Cell Ranger v2.1 para des-multiplexar archivos de llamadas base raw (BCL) generados por secuenciadores Illumina en archivos FASTQ, realizar la alineación, el conteo de códigos de barras y el conteo UMI. Las lecturas de secuenciación se asignaron al ensamblaje del genoma del pez cebra (GRCz11, Ensembl release 92). Se realizaron análisis adicionales utilizando el paquete Seurat49 en el software R (https://www.r-project.org). Las matrices de expresión se filtraron primero manteniendo genes que se expresan en un mínimo de 3 células y células que expresan un mínimo de 200 genes para el análisis posterior. Las células se filtraron aún más seleccionando células que expresaban bajo contenido mitocondrial (<7%). Los datos se normalizaron utilizando la función NormalizedData, que normaliza la expresión génica de cada célula por la expresión total.
Cuantificación del diámetro de los vasos sanguíneos:Tg vivo(fli1ep: Lifeact-EGFP)zf495;Tg (kdr-l:ras-mCherry) s916 embriones transgénicos de tipo silvestre o mutantes marcksl1 fueron fotografiados a 50-52 hpf. Las pilas z confocales se adquirieron con un objetivo de inmersión en aceite de silicona Olympus UPLSAPO 40×/NA1.25. Para los cálculos de diámetro de DA y PCV, se tomaron 4-5 mediciones entre VSI a lo largo de la extensión vitelina (VSI no. 10-14). Para el diámetro del ISV, se realizó un promedio de 6 mediciones a lo largo de cada ISV (ISV no. 10-14) entre el DA y el DLAV. Las mediciones se realizaron utilizando Fiji (NIH).
Cuantificación del número CE y proliferación: Para el recuento del número CE, se fijaron 52 embriones de tipo salvaje hpf, marcksl1ark23, marcksl1brk24 o marcksl1ark23;marcksl1brk24 en fondo Tg(kdr-l:ras-mCherry)s916 en AFP al 4% y se teñieron con DAPI de 3 µM. Las pilas z confocales se adquirieron con un objetivo de inmersión en aceite de silicona Olympus UPLSAPO 40x/NA 1.25. Se contaron núcleos en cada VSI (VSI no. 9-22) entre el DA y el DLAV. Para cuantificar EC mitóticas en ISV, wildtype o marcksl1ark23; embriones marcksl1brk24 en Tg (fli1ep:Lifeact-EGFP)zf495; Tg (kdr-l:el fondo ras-mCherry)s916 se fijó en AFP al 4% a 30, 36 y 48 hpf, permeabilizado en Tritón X-100 al 1% DMSO/1% y teñido con anticuerpo antifosfo H3 (1:250, Merck Millipore) seguido de anticuerpo secundario Alexa 488 anti-conejo (1: 1000, ThermoFisher Scientific) y DAPI de 3 µM. Las pilas z confocales se adquirieron con un objetivo de inmersión en aceite de silicona Olympus UPLSAPO 40x/NA 1.25. Se contaron células mitóticas (células con pH3 positivo) en VSI a ambos lados del embrión (VSI no. 9-22). Los ISV se visualizaron mediante fluorescencia de mCherry. Solo se detectó una célula con pH3 positivo por VSI, independientemente de la posición del VSI. Durante el conteo, se consideró la CE en telofase como una célula única. Para contar el número de divisiones CE, se tomaron imágenes de embriones de tipo salvaje o marcksl1ark23;marcksl1brk24 en el fondo Tg(fli1ep:Lifeact-EGFP)zf495;Tg(kdr-l:ras-mCherry)s916 de 24 a 48 hpf a intervalos de 6 minutos utilizando un objetivo de inmersión en aceite de silicona Olympus UPLSAPO 30×/NA 1.05. Se cuantificó el número de divisiones celulares en cada VSI (VSI no. 11-15).
Cuantificación de los niveles de actomiosina en la corteza apical: Tg vivo(fli1:Lifeact-mCherry)ncv7; Se tomaron imágenes de embriones de pez cebra Tg(fli1ep:EGFP-PLCδ1PH)rk26 y Tg(fli1ep:myl9b-EGFP)rk25; Tg(kdr-l:ras-mCherry)s916 a 30-34 hpf utilizando un objetivo de inmersión en agua Olympus UPLSAPO 60×/NA 1.2. La intensidad de Lifeact o Myl9b a lo largo de la corteza apical y en el citoplasma se midió utilizando Fiji. Se calculó la relación entre la intensidad media cortical y citoplasmática.
Análisis de forma celular in vivo: El etiquetado unicelular de ECs en ISV se logró mediante expresión en mosaico de fli1ep:plásmido lynEGFP en tipo salvaje, marcksl1brk24 o marcksl1ark23; embriones mutantes marcksl1brk24 o fli1ep:plásmido marcksl1b-EGFP en embriones de tipo salvaje. A 2 dpf, se realizó una microangiografía y se tomaron imágenes de los vasos con un objetivo de inmersión en agua Olympus UPLSAPO 60×/NA 1.2 con un intervalo de planos Z ópticos de 0.25 µm. El análisis de la forma de celda de ECs de ISV se realizó de manera semiautomática utilizando un script ImageJ escrito a medida desarrollado en Python, extendiendo el método descrito en ref. 50. Las imágenes se recortaron primero crudamente para reducir los requisitos de memoria aguas abajo y se rellenaron metadatos adicionales (tipo de vaso e identificador de embrión). Luego se ejecutó un script separado para proyectar y desenvolver celdas de alrededor de un recipiente en una superficie 2D. Brevemente, las imágenes recortadas se giraron primero en función del tipo de recipiente para alinear crudamente el eje del recipiente con la dirección Z en una pila de imágenes, y se seleccionó el canal de la etiqueta de celda de mosaico fluorescente para la proyección. Para superar los problemas con la segmentación automatizada de vasos en el canal de fluorescencia de la piscina de sangre causados por estructuras de fondo fluorescentes variables y perfusión de dextran-rodamina fuera del vaso, se identificó el eje del vaso definiendo manualmente la posición del vaso aproximadamente cada 10 µm a través de la pila de imágenes y luego realizando un ajuste e interpolación de ranura Catmull-Rom. Los datos se transformaron para enderezar el eje del recipiente en tres dimensiones. A continuación, se identificó la posición de intensidad máxima en el canal de proyección a lo largo de los rayos a intervalos de 1° alrededor del eje del vaso. Esta información se utilizó para proyectar la intensidad de fluorescencia en un plano donde los ejes están situados a lo largo del eje del recipiente y la posición angular, y para trazar la distancia desde el eje del recipiente en cada posición del plano proyectado. La celda se identificó a partir de la imagen proyectada utilizando el método integrado Intermodes de ImageJ. A continuación se calcularon las longitudes de arco representadas por los lados de cada píxel asociado a la celda (\(l = \frac{{2 \ pi rd^2}}{{360}}\), donde r es la distancia entre el píxel asociado a la celda y el eje del recipiente y d es el lado de un píxel) y se usa para generar medidas del área de superficie de la celda y la relación de aspecto.
Análisis in vitro de la forma celular: Se tomaron imágenes de HUVEC fijos con un objetivo de inmersión en aceite de silicona Olympus UPLSAPO 40×/NA 1.25. En total, de 10 a 20 imágenes de cada hoja de cubierta se tomaron para su cuantificación y se analizaron de forma semiautomática utilizando un script ImageJ escrito a medida. Las pilas z multicanal se proyectaron al máximo y el canal que mostraba un marcador GFP se identificó a partir de los metadatos del instrumento. El método de umbral Otsu incorporado de ImageJ se utilizó para separar las celdas de interés del fondo; las imágenes binarias resultantes se limpiaron eliminando regiones menores de 105 µm2 y regiones en contacto con el límite del campo de visión. Un paso de intervención manual posterior permitió al usuario modificar opcionalmente las regiones de celda de interés en función de esta imagen binaria para separar celdas combinadas erróneamente o incluir celdas que no se vieron en la operación de umbral. A continuación, el script calculó las áreas y los perímetros para el ROI de cada celda. Además, se calculó un «índice de puntiagudos» para cada celda basado en la relación entre el perímetro de la celda y el perímetro del casco convexo correspondiente, y se calculó un valor para la relación de aspecto de la celda como la relación de los ejes mayor y menor de una elipse ajustada al ROI de la celda.
Análisis de blebbing de membrana: Las gráficas relacionadas con el blebbing de membrana se generaron de manera semiautomática utilizando un script ImageJ escrito a medida. Para cada membrana fotografiada, se calculó la relación entre la longitud del contorno de un borde de membrana y la distancia euclidiana entre los extremos del borde en cada punto de tiempo. A partir de la serie temporal resultante, las densidades espectrales de potencia se calcularon mediante el método de Welch51. La densidad espectral de potencia se promedió sobre una ventana de interés, definida empíricamente como el tiempo característico durante el cual se formaron las burbujas (0,04–0,06 Hz); estos valores promediados se compararon entre condiciones experimentales (sobreexpresión de Marksl1b) y de control.
Análisis de la dinámica de actina y miosina II en blebs: Las gráficas relacionadas con la dinámica de actina o miosina en células blebbing se generaron de forma semiautomática utilizando un script ImageJ escrito a medida. Las pilas z multicanal de lapso de tiempo se proyectaron al máximo a lo largo de la dimensión z. A continuación, el software identificó automáticamente el borde de un bleb entre dos puntos de anclaje definidos por el usuario en todos los puntos de tiempo utilizando el método de umbral Otsu integrado de ImageJ que se ejecuta en el canal Marksl1b-EGFP como sustituto para el etiquetado de membrana. Después de un paso de control de calidad del usuario para garantizar la identificación precisa del borde de la burbuja, se extrajo el perfil de intensidad del canal de actina/miosina a lo largo del borde en cada punto de tiempo y se trazó contra el tiempo en un quimógrafo. En cada momento, se extrajeron estadísticas de intensidad de punto junto con el área de la burbuja, definida aquí como el área proyectada en z encerrada por el borde y la línea que une los puntos a cada lado de la burbuja más alejados de la punta de la burbuja a lo largo de un eje perpendicular a la línea que une los puntos de anclaje definidos por el usuario, y se trazaron la intensidad media del canal de actina/miosina y el área de la burbuja contra el tiempo.
Cuantificación de la densidad de actina cortical y el ancho del haz: Se obtuvieron imágenes de actina de alta resolución en HUVECs utilizando una lente de objetivo de aceite Plan-APOCROMAT 63x montada en un microscopio confocal Zeiss LSM880 equipado con un detector Airyscan y GaAsP. Se seleccionaron aleatoriamente regiones cuadradas de aproximadamente 3 µm dentro de cada observación y se recortaron típicamente 8 secciones ópticas que cubrían la malla cortical de esas regiones. Las imágenes proyectadas a lo largo del eje Z de las pilas recortadas se generaron mediante proyección de intensidad máxima y se sometieron al siguiente procedimiento. Dado que los filamentos de actina dentro de la imagen eran ambiguos y era imposible evaluar toda la red, cuantificamos el número de filamentos de actina dentro de las regiones limitadas como la densidad de la malla de actina. Esto se realizó estableciendo líneas de escaneo a lo largo de los ejes X e Y a cada 4 píxeles, y los valores de píxeles a lo largo de cada línea de escaneo se sometieron al filtro Savitzky – Golay52 para calcular las derivadas de primer orden. Los filamentos de actina se identificaron encontrando puntos de cruce cero, que son los picos de intensidad de la línea de escaneo. Los recuentos de picos se dividieron por los recuentos de píxeles de la línea de escaneo (ancho o alto de la imagen) y la densidad de los filamentos sobre la imagen se calculó tomando el promedio de estos valores.
Para cuantificar el ancho del haz de actina, las líneas céntricas de los haces de actina se generaron encontrando puntos de cruce cero de derivadas de primer orden calculadas por el filtro Savitzky-Golay y seguidas aplicando el algoritmo de adelgazamiento de Hilditch. Para eliminar la posibilidad de que los puntos de ramificación o cruce de los filamentos de actina afecten las mediciones, se eliminaron y segmentaron los puntos de ramificación encontrados dentro de la línea esqueletada. El eje ortogonal al segmento total se determinó mediante la obtención del vector propio, y se muestrearon intensidades fluorescentes a lo largo del eje ortogonal que recorre el centro de gravedad del segmento con el método de interpolación Lanczos-5. Luego, el diámetro de un filamento se determinó por el ancho de la región que mostraba una intensidad de pico mayor o igual a la mitad dentro de la línea muestreada a lo largo del eje ortogonal al segmento total.
Estadística: El análisis estadístico se realizó utilizando Prism 8 (GraphPad Software, Inc.). Los tamaños de muestra no estaban predeterminados, los experimentos no fueron aleatorizados y los investigadores no estuvieron ciegos a la asignación durante los experimentos y la evaluación de resultados.
Resumen de informes
Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de Informes de Investigación de la Naturaleza vinculado a este artículo.
