La deleción de KDM6A, una Histona Desmetilasa que interactúa con MLL2, en tres Pacientes con Síndrome de Kabuki | Jumbuck

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El síndrome de Kabuki (KS; MIM 147920) fue descrito por primera vez en 1981 por Niikawa y Kuroki 1,2 y se han notificado más de 400 casos en la literatura. Las principales características clínicas son rasgos faciales distintivos, retraso en el desarrollo, discapacidad intelectual leve a moderada, retraso en el crecimiento postnatal y características adicionales que incluyen anomalías esqueléticas, hipodoncia y almohadillas fetales persistentes en la punta de los dedos. El análisis de microarrays de hibridación genómica comparativa (CGH) no detectó una anomalía recurrente en individuos de 72 KS.3-8 El uso de la estrategia de secuenciación del exoma condujo recientemente a la identificación de mutaciones en MLL2 (MIM 602113) como una de las principales causas del SK.9 En cinco series publicadas recientemente, se encontraron mutaciones en MLL2 en 56-76% de los pacientes con SK.9-13

Debido a que una proporción significativa de pacientes no tienen una mutación MLL2 detectable, postulamos la existencia de genes adicionales asociados con el SK. En la búsqueda de otra mutación genética que causa KS, se examinaron diez genes que interactúan con MLL2 en 15 individuos con KS con mutación MLL2 negativa, y no se identificaron mutaciones patógenas.11 Otro gen que codifica una proteína que interactúa con MLL2, KDM6A (anteriormente conocida como UTX; MIM 300128), se examinó en 22 individuos con SK con mutación MLL2 negativa y, de nuevo, no se detectaron mutaciones causales.13

Mediante el análisis de matriz CGH (plataforma Agilent 244K), identificamos microdeleciones Xp11.3 de novo en dos niñas belgas con SK con mutación MLL2 negativa (pacientes 1 y 2). Debido a que ambas eliminaciones fueron de novo, probablemente sean patógenas. Ambas eliminaciones incluyeron una parte o la totalidad de KDM6A, además, no hubo eliminaciones de KDM6A en una cohorte de 411 controles normales en un estudio previo.14 La deleción en el paciente 1 incluyó los exones 21-29 de KDM6A, que codifican la parte terminal del dominio catalítico de KDM6A, y CXorf36, un gen recientemente implicado en el autismo ligado al cromosoma X.15 En el paciente 2, se eliminaron completamente KDM6A, CXorf36, DUSP21 (MIM 300678) y FUNDC1 (Figura 1). Las funciones de DUSP21 y FUNDC1 siguen siendo desconocidas.

La Región Xp11.3 Muestra las eliminaciones de los Pacientes

La Región Xp11.3 muestra las eliminaciones extraídas del Navegador del Genoma de la UCSC (GRCh37/hg19) para los pacientes 1, 2 y 3. Las pistas completas negras representan la eliminación de cada paciente, y el número de cada paciente está por encima de su pista respectiva. La deleción en el paciente 1 abarca 283,5 kb desde la base 44.941.324 hasta la base 45.224.829, la deleción del paciente 2 abarca 815.7 kb de la base 44,377,858 a la base 45,193,629, y la deleción del paciente 3 abarca 45.4 kb de la base 44,866,302 a la base 44,912,718. Los genes en el área se anotan debajo de las pistas de deleción. Los CNV en la Base de Datos de Variantes Genómicas se muestran en las líneas de fondo. No hay informes previos de cambios en el número de copias de KDM6A.

A continuación, secuenciamos KDM6A mediante secuenciación Sanger y buscamos eliminaciones o duplicaciones intragénicas con una matriz agilente personalizada específica CGH en una cohorte de 22 individuos KS con mutación MLL2 negativa (8 mujeres, 14 hombres). De acuerdo con las normas éticas del comité de ética del Institut de Pathologie et de Génétique, se obtuvo el consentimiento de los padres para el análisis de ADN de todos los participantes en este estudio y para la publicación de fotografías. Los datos de microarrays CGH (datos complementarios, disponibles en línea) analizados en esta publicación se han depositado en el Omnibus de Expresión Génica (GEO) 16 del Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI)y se puede acceder a ellos en la sección de adhesión GSE32567 (véase la sección de Números de adhesión).

No se detectaron mutaciones puntuales, pero se identificó una deleción intragénica de novo (exones 5-9) en un individuo italiano con SK masculino (paciente 3). También secuenciamos UTY (MIM 400009), el paralog del cromosoma Y de KDM6A (ver más abajo), y buscamos deleciones o duplicaciones intragénicas como se indicó anteriormente, pero no detectamos ninguna mutación.

Los pacientes 1 y 3 tenían un fenotipo típico de SK, que incluía fisuras palpebrales largas, eversión lateral del párpado inferior y discapacidad intelectual de moderada a grave (Tabla 1 y Figura 2). Aunque los rasgos faciales de la paciente 2 no eran tan clásicos, mostró muchas características de este trastorno, incluyendo la falta de cejas laterales, pestañas largas, estrabismo, fisuras palpebrales largas, orejas grandes y prominentes, almohadillas fetales persistentes en la punta de los dedos, coartación aórtica, plenitud areolar en la infancia e hirsutismo. Presentó un retraso leve en el desarrollo y un cociente de inteligencia verbal (CI) normal, un coeficiente intelectual de bajo rendimiento y un comportamiento hiperactivo (Tabla 1 y Figura 2). Observamos que los pacientes 1 y 2 tenían alucinaciones largas (Figura 3).

Aspecto Facial en Individuos Afectados

(A) Paciente 1.

B) Paciente 2.

C) Paciente 3.

Observe las fisuras palpebrales largas en los pacientes 1 y 2 y las cejas arqueadas en los pacientes 1 (leves) y 3.

Aspecto de los Pies en Individuos Afectados

(A) Paciente 1.

B) Paciente 2.

Tenga en cuenta las largas alucinaciones en ambos pacientes.

Por lo tanto, las eliminaciones de KDM6A en estos tres pacientes se asocian con un amplio espectro fenotípico que va desde individuos con SK típicos (pacientes 1 y 3) hasta una presentación clínica más leve (paciente 2). Esta variabilidad clínica también es una característica de los pacientes con mutaciones en MLL2.Sin embargo, también se deben considerar los posibles efectos de la deleción de CXorf36 en el paciente 1 y de la deleción de CXorf36, DUSP21 y FUNDC1 en el paciente 2 en sus fenotipos respectivos.

KDM6A (29 exones) es uno de los genes cromosómicos X que escapa en gran medida de la inactivación X.17 Codifica una proteína de 1.401 residuos que contiene dos dominios funcionales. El dominio catalítico es una histona desmetilasa que cataliza específicamente la desmetilación de la lisina 27 mono, di y trimetilada en la histona H3 (H3K27).18,19 Esta desmetilación media la expresión específica del tejido de varios genes y está involucrada principalmente en los procesos de desarrollo y el ciclo celular.19-22 Curiosamente, KDM6A y MLL2 actúan juntos en el control epigenético de la cromatina transcripcionalmente activa contrarrestando las proteínas del grupo Policomb (PcG).22 El otro dominio funcional de KDM6A juega un papel en la remodelación de la cromatina al interactuar con el complejo de remodelación switch/sacarosa no fermentable (SWI/SNF) que contiene el activador de transcripción Brg1.23

Al igual que MLL2, KDM6A juega un papel en la embriogénesis y el desarrollo. Los mutantes de Drosophila dUTX homocigotos (ortólogo Drosophila KDM6A) manifiestan ojos ásperos, alas dismórficas y modificación de los peines sexuales.21 Este fenotipo se asemeja al fenotipo trithorax, apoyando aún más la noción de que KDM6A contrarresta la represión de PcG.21 Además, UTX-1 (C. elegans KDM6A ortholog) podría afectar las decisiones de destino en el desarrollo de las células precursoras vulvares de C. elegans a través de la regulación de la transcripción de genes que codifican el complejo proteico de retinoblastoma (RB), que se ha conservado de gusanos a humanos.20 Kdm6a1 también es importante en la expresión de genes HOX posteriores en peces Cebra.19 Además, KDM6A, junto con MLL2, juega un papel importante en la regulación de genes específicos de los músculos durante la embriogénesis.22,24 Finalmente, los miembros de otra importante familia de genes del desarrollo (los genes T-box, que actúan en el mesodermo en la formación del corazón y las vértebras) reclutan KDM6A para activar sus genes diana, enfatizando nuevamente el papel de KDM6A en los procesos de desarrollo.23 Curiosamente, la mayoría de las mutaciones patógenas para los genes de la caja T reportados en enfermedades humanas se encuentran en el dominio de la caja T que interactúa con KDM6A.23

KDM6A escapa a la inactivación X17, pero se ha sugerido que en ratones, la expresión de Kdm6a del cromosoma X inactivo es significativamente menor que la del cromosoma X activo.La expresión de 25 Kdm6a es más alta en el cerebro adulto, el hígado adulto y regiones cerebrales en desarrollo específicas en las mujeres que en los hombres.25 UTY es el paralog de KDM6A en el cromosoma Y.17 UTY tiene una similitud de secuencia de aminoácidos del 84% con KDM6A y podría compensar el aumento de la expresión de KDM6A en las hembras, a pesar del hecho de que la actividad de la desmetilasa aún no se ha demostrado para este paralog de KDM6A.14,25

No es sorprendente encontrar otro gen asociado con el SK en el cromosoma X, ya que se han notificado casos de pacientes similares al SK con cromosomas X (r) de anillo pequeño.26-34 Además, existe un claro solapamiento entre los defectos cardíacos congénitos prevalentes en pacientes varones con SK (coartación aórtica y otras obstrucciones del lado izquierdo) y los encontrados en pacientes con cromosomas X y r(X) de monosomía.28,35 Cromosomas pequeños r(X) típicamente conducen al síndrome de Turner a través de la inactivación completa del r(X). Sin embargo, no está claro por qué algunas personas desarrollan un fenotipo similar al SK. La inactivación incompleta del cromosoma X y la posterior expresión de genes generalmente reprimidos se ha sugerido como una explicación para el fenotipo KS en algunos pacientes r(X).32-34 KDM6A se eliminó en los tres pacientes que tenían un fenotipo similar al KS y un r(X) en los que se habían mapeado los puntos de corte; este hallazgo es consistente con la hipótesis de que la deleción de KDM6A juega un papel importante en el fenotipo similar al KS observado en algunos pacientes con un r(X).30,32,34 No pudimos demostrar la haploinsuficiencia de KDM6A en los pacientes 1 y 2 porque la expresión de KDM6A era muy baja en los linfocitos de sangre periférica (datos no mostrados). Sin embargo,los estudios han demostrado que dos copias de Kdm6a son necesarias para la expresión normal en embriones de ratón hembra y ratones adultos25, lo que sugiere que la haploinsuficiencia podría ser el mecanismo patógeno. Sin embargo,esta explicación no explicaría el hecho de que los pacientes 45, X y otros pacientes r(X) con deleción de KDM6A no todos desarrollan el fenotipo Kabuki.

En los pacientes 1 y 2, las relaciones de inactivación molecular X están fuertemente sesgadas y son de 89:11 y 97:3, respectivamente. El perfil de inactivación X se determinó mediante amplificación por PCR de la repetición de CAG en el exón 1 del gen receptor de andrógenos antes y después de la digestión del ADN con HpaII y CfoI. Para determinar si la copia eliminada de KDM6A se encontraba en el cromosoma X activo o inactivo, realizamos un análisis de hibridación fluorescente in situ (FISH) con una sonda KDM6A en los cromosomas X que habían sido etiquetados diferencialmente mediante la incorporación de 5-bromo-2′-desoxiuridina (5-BrdU). Los resultados mostraron que la copia eliminada de KDM6A estaba localizada en el cromosoma X inactivo en todas las 70 mitosis analizadas en ambos pacientes (Figura 4). El hecho de que KDM6A escape de la inactivación X17 sugiere que los linfocitos estimulados por fitohemaglutinina (PHA) que tienen una copia eliminada de KDM6A en el cromosoma X inactivo tienen una ventaja de supervivencia sobre las líneas celulares que tienen una copia eliminada de KDM6A en el cromosoma X activo. Esta sugerencia está en línea con la hipótesis de que, aunque KDM6A escapa a la inactivación X, su expresión es menor en el cromosoma X inactivo que en el cromosoma X activo.25

Imagen de un estudio FISH en Cromosomas X Etiquetados diferencialmente con 5-BrdU

Una imagen de un estudio FISH muestra cromosomas X etiquetados diferencialmente por la incorporación de 5-BrdU. El cromosoma X inactivo (en el círculo blanco) parece más brillante que el cromosoma X activo. Las sondas subteloméricas Xqter hibridan a ambos cromosomas X (flechas azules). La señal KDM6A (flecha blanca) está ausente del cromosoma X inactivo y está presente en el cromosoma X activo. Para este experimento, se estimularon linfocitos de sangre periférica de los pacientes 1 y 2 con fitohemaglutinina y se cultivaron durante 72 horas. Para identificar el cromosoma X inactivo de replicación tardía, se trataron las células con 5-BrdU (30 µg/ml) 5 horas antes de la cosecha. A continuación, se añadió Colcemid a una concentración de 0,2 µg/ml, y 1 hora después, se produjeron preparaciones metafásicas mediante procedimientos estándar que involucraron hinchazón en KCl de 75 mM y fijación en metanol / ácido acético 3:1. Realizamos análisis FISH utilizando simultáneamente una sonda Xqter subtelomérica etiquetada con Espectrómetro (Vysis) para indicar los cromosomas X (flecha azul) y RP11-435K1 etiquetada con espectrómetro (AmpliTech) para distinguir entre los cromosomas X eliminados y los no eliminados (flecha blanca). Para facilitar la detección de la 5-BrdU incorporada, desnaturalizamos el ADN celular en 2N HCl durante 30 min a 37 ° C. A continuación, la 5-BrdU se etiquetó con un anticuerpo monoclonal específico de 5-BrdU conjugado con fluoresceína (Roche) (1 µg/ml). Finalmente, contra-teñimos el ADN aplicando una solución antifaz que contenía 0.1 µg/ml de DAPI.

El papel de UTY es en gran parte desconocido, y no tiene actividad desmetilasa in vitro. El hallazgo de un individuo masculino con SK (paciente 3) con una deleción intragénica de KDM6A y con una gravedad clínica similar a la del paciente 1 sugiere que la UTY podría compensar parcialmente la pérdida de KDM6A en individuos masculinos, como se sugirió anteriormente en la literatura.25

En cuanto a MLL2, se han identificado mutaciones somáticas homocigotas y hemígogas en KDM6A en varios tipos de cáncer (mieloma múltiple, carcinoma de células escamosas de esófago, carcinoma de células renales, leucemia mieloide, cáncer de mama, cáncer colorrectal y glioblastoma), lo que indica que el KDM6A es un gen supresor de tumores.14 Sin embargo, el cáncer no es una característica clave del SK,dado que esta complicación solo se notificó en siete pacientes con SK36, 37 (una vez se notificó leucemia linfoblástica aguda, linfoma de Burkitt, sarcoma fibromixoide, sarcoma sinovial y hepatoblastoma, y se notificó neuroblastoma en dos individuos con SK).35,36 Si la pérdida de ambos alelos es suficiente para causar cáncer, uno esperaría que el cáncer se presente con más frecuencia en el SK, como en el retinoblastoma (MIM 180200) o el tumor de Wilms (MIM 194070). Esto indica que la pérdida del segundo alelo en MLL2, KDM6A o UTY es necesaria pero no suficiente para el desarrollo del cáncer o que esta complicación no se reconoce suficientemente, lo que demuestra la importancia de los estudios de historia natural en síndromes poco frecuentes.37

Las siguientes histonas metilasas y histonas desmetilasas han sido implicadas en otros síndromes de anomalías múltiples: EHMT1 (MIM 607001; síndrome de Kleefstra), SETBP1 (MIM 611060; síndrome de Schinzel-Giedion), JARID1C (MIM 314690; Síndrome de retraso mental ligado al cromosoma X tipo Claes-Jensen ), PHF8 (MIM 300560; Síndrome de retraso mental ligado al cromosoma X de tipo Siderius) y MLL2 en el SK. La identificación de mutaciones patógenas de KDM6A en pacientes con SK amplía el papel de los factores de modificación de histonas en la discapacidad intelectual y las malformaciones congénitas.

En conclusión, reportamos mutaciones en KDM6A como causa de SK en un varón y dos mujeres. Nuestros hallazgos confirman tanto la heterogeneidad genética del SK como un locus en el cromosoma X, como se ha sugerido anteriormente. Debido a que algunos pacientes con SK fueron negativos para la secuenciación de MLL2, KDM6A y UTY y no mostraron eliminaciones o duplicaciones durante los exámenes de detección, es probable que queden por descubrir otros genes relacionados con el SK.