Introducción
La biotecnología emplea microorganismos, así como células superiores y sus principios activos, con el objetivo de lograr conversiones deseables de diversos sustratos (Tripathi et al., 1997). El L-fenilacetil carbinol es el material de partida para la síntesis química de los compuestos farmacéuticos de hidrocloruro de L-efedrina y pseudoefedrina utilizados como descongestionantes y antiasmáticos (Shin y Rogers, 1995) y utilizados recientemente en el control de la obesidad (Astrup et al., 1992). El benzaldehído del sustrato aromático dará L-PAC por el método de biotransformación. Ciertas cepas de levadura poseen enzimas piruvato descaroxilasa (PDC) y alchol deshidrogenasa (ADH) que producen L-PAC y alcohol bencílico, un subproducto, respectivamente a partir de benzaldehído (Nikolova y Ward, 1991). Los potenciales de biotransformación de las células en crecimiento, las células recolectadas libres, las células inmovilizadas y las enzimas crudas aisladas, así como purificadas, se han estudiado ampliamente (Liew et al., 1995; Shin y Rogers, 1996a, b).
El papel de las cepas nuevas en la bioconversión es un aspecto importante. La producción de L-PAC se estudió con células libres e inmovilizadas de saccharomyces cerevisiae en diversas condiciones de crecimiento y biotransformación. Sin embargo, hemos estudiado la producción de L-PAC a partir de benzaldehído mediante el uso de varias cepas nuevas bajo diversas modalidades de crecimiento y biotransformación con el fin de monitorear las condiciones ideales que permiten el máximo rendimiento del producto a una concentración constante de sustrato y densidad celular. La producción de L-PAC se da en el Esquema 1.
| Esquema 1: | |
Materiales y Métodos
Producción de L-Fenilacetil Carbinol con Células Normales de Sccharomuces Cerevisiae (BY)
La producción de L-Pac (un intermediario clave para muchos medicamentos) a partir de benzaldehído por levaduras es la ruta potencial en la Industria de la Fermentación para la producción de Efedrina y otros medicamentos. El presente estudio fue realizado por el autor en la facultad de Farmacia Sultan-Ul-Uloom, ubicada en Hyderabad, India, en el año 2004.El cultivo madre de levadura de panadería se subcultivó recientemente (Ellaiah y Krishna, 1987) en inclinaciones de medio YEMA estéril fresco y se incubó a temperatura ambiente (aproximadamente 28°C) durante 36 h. Por lo tanto, el cultivo de 36 h se utilizó para la cosecha. El cultivo de levadura de panadería se cosechó agitando en 5 ml de agua estéril. La suspensión microbiana recolectada se transfirió al medio de inóculo-I. La composición del medio de inóculo es la siguiente:
El matraz se incubó a 28°C en un agitador giratorio (180 RPM) durante 24 h.
El recuento microbiano se realizó utilizando la cámara de recuento de Neubauer. La suspensión microbiana se diluyó de modo que cada ml de suspensión contuviera 200×106 células. Diez mililitros de inóculo de IM-I se transfirieron a 100 ml de medio de inoculación-II la composición de la oms se indica a continuación:
Los matraces se incubaron en un agitador giratorio (180 RPM) durante 16 h.
Se prepararon cien mililitros de medios de producción. En la mayor parte del estudio, el medio de melaza utilizado como medio de producción y para el estudio de comparación, el medio de jugo de caña de azúcar con urea se utilizó como medio de producción. Diez mililitros de inóculo de IM-II se transfirieron a medios de producción cuya composición es la misma que IM-II y se incubaron durante 9 h en un agitador giratorio. A las 9 h, se añadió un nutriente (20 mL de melaza al 50%) al medio de producción de melaza y un nutriente (20 ml de jugo de caña de azúcar al 50%) al medio de producción de caña de azúcar, respectivamente, y se incubó en un agitador rotatorio. A partir de las 10 h 0.el 6% de benzaldehído destilado se añadió en 6 dosis divididas de intervalos de media hora al medio de producción.
Luego se incubaron matraces en el agitador giratorio durante 24 h. Los matraces que contenían 130 ml de caldo (es decir,medio de producción de 100 mL+inóculo de 10 mL+medio nutriente de 20 ml) se trataron con 130 ml de benceno (disolvente) y se agitaron durante l5 min en embudos de separación. Luego se separó la capa orgánica y se filtró a través de algodón absorbente. Finalmente, se destiló el benceno disolvente para obtener el producto L-PAC.
Producción de L-Fenilacetil Carbinol con Nuevas cepas de Levaduras:
Procedimientos para la Bioconversión:
En estudios comparativos se utilizaron los nuevos cultivos para estimar y comparar su potencial de biotransformación con la levadura de panadería. Los cultivos madre de Candida pseudointermedia MTCC No. 6225, Candida pseudountermedia MTCC No. 6352 e Issatchenkia orientalis MTCC No. 6351 fueron subculturados asépticamente en inclinaciones Estriles de YEMA con asa de transferencia esterilizada en el área estéril (flujo de aire laminar).
El procedimiento mencionado anteriormente (Ellaiah y Krishna, 1987) también se repitió para las cepas nuevas. En la mayor parte del estudio se utilizó un medio de melaza como medio de producción y para el estudio comparativo se utilizó un medio de jugo de caña de azúcar con urea (Kaur y Kocher, 2002) como medio de producción.
Resultados y discusión
El L-fenilacetil carbinol es un líquido de color amarillo. Su gravedad específica reportada es de 0,93 a temperatura ambiente. El L-PAC producido por cepas que incluían levaduras de panadería (S. cerevisia) mostró el mismo valor de gravedad específica. El valor de pH de L-PAC (relación 1: 1 de la muestra de L-PAC y el agua) se reporta como 3,84. En estos experimentos, el producto L-PAC obtenido a través de la biotransformación por cuatro levaduras diferentes como levadura de panadería, Candida pseudointermedia (6225), Candida pseudointermedia (6352) e Issatchenkia orientals (6351) mostró los mismos valores de pH. Se informó del valor de Rf de L-PAC (Groger y Erge, 1965) en cloroformo, ya que se utilizaron vapores de yodo de gel de sílice en fase móvil para la detección de manchas.
En el desarrollo de cromatogramas, se comparó el cloroformo como disolvente frontal con una mezcla de disolventes (acetato de etilo al 30% y hexano al 70%) como fase móvil. El frente de disolvente posterior mostró una mejor separación que el cloroformo. Así que usamos un 30% de acetato de etilo y un 70% de hexano como frente de solvente en todos nuestros experimentos.
El L-PAC es reactivo a la luz UV, los vapores de yodo y el carbonato de β-metoxinaftaleno también. El valor de Rf del L-PAC estándar es de alrededor de 0,33. El producto L-PAC de diferentes aislamientos mostró el mismo valor de Rf.
La metilcetona presente en el L-PAC sufre la reacción Idoform (Smith y Hendlin, 1954). Inicialmente sufre halogenación y escisión en presencia de álcali como NaOH para dar lugar a Idoform. Esta reacción es muy específica para L-PAC y no ocurre con subproductos. El L-PAC producido por diferentes aislamientos dio lugar a Idoform.
Mediante estimaciones polarimétricas y colorimétricas, se estimó el porcentaje de bioconversión en diferentes aislados de levaduras. Otros productos de fermentación (por ejemplo, alcohol bencílico, ácido benzoico y benzaldehído no convertido) se analizaron mediante Cromatografía líquida de Alto rendimiento (HPLC) y Cromatografía de Gases (GC). La estructura química del L-PAC se identificó y se conformó con datos espectrales de RMN de 1H y UV.
Varios trabajadores (Ellaiah y Krishna, 1987) realizaron fermentación en melaza como medio de producción, además del medio de melaza utilizado en la industria para la reacción de bioconversión en la producción de L-PAC.
En la presente investigación probamos el jugo de caña de azúcar como medio de producción en la producción de L-PAC. Se utilizó jugo de caña de azúcar con 0,25% de urea como medio de producción que produjo más producto de L-PAC que melaza. Además de ese producto, la extracción del medio de jugo de caña de azúcar era muy conveniente que del medio de melaza. El % de bioconversión obtenido con diferentes cepas de levadura se muestra en la Tabla 1.
Se estudió el potencial de biotransformación de células libres de levadura de panadería (S. cerevisiae) tanto en melaza como en zumo de caña de azúcar como medio de producción. En el medio de melaza se observó una bioconversión del 25%, mientras que en el medio de jugo de caña de azúcar se observó una bioconversión del 28%.
| Cuadro 1: | Conversión de melaza y jugo de caña de azúcar como medios de producción en la producción de L-PAC |
Se estudió el potencial de biotransformación de células libres de Candida pseudointermedia MTCC No. 6225 en melaza y jugo de caña de azúcar como medio de producción. En la melaza se observó una bioconversión del 23,43%, mientras que en el medio de jugo de caña de azúcar se observó una bioconversión del 23,75%.
Potencial de biotransformación de células libres de Candida pseudointermedia No MTCC. 6352 se estudió tanto en melaza como en jugo de caña de azúcar como medio de producción. En la melaza se observó una bioconversión del 33,47%, mientras que en el medio de jugo de caña de azúcar se observó una bioconversión del 48,76%.
Se estudió el potencial de biotransformación de células libres de Issatchenkia orientalis MTCC No. 6351 tanto en melaza como en jugo de caña de azúcar como medio de producción. En la melaza se observó una bioconversión del 37,16%, mientras que en el medio de jugo de caña de azúcar se observó una bioconversión del 60,61%.
Conclusión
En conclusión, se investigó el presente procedimiento para el uso de cepas nuevas de levaduras de fuentes naturales para estudios de biotransformación y se utilizó para la bioconversión de benzaldehído a L-PAC. Se aislaron tres cepas de diferentes fuentes naturales, como uvas negras, dátiles y jugo de caña de azúcar, y se identificaron en el Instituto de Tecnología Microbiana de Chandigarh. Estas tres cepas fueron designadas como Candida pseudointermedia MTCC No. 6225 (BGY), Issatchenkia orientals MTCC No.6351 (DY), Candida pseudointermedia MTCC No. 6352 (SCY).Que será una adición importante a los procedimientos actuales. Los hallazgos más significativos de la presente investigación son el uso de 3 nuevas cepas de levaduras para la producción de L-PAC y el uso de jugo de caña de azúcar como medio de producción para la producción de L-PAC. Tenemos éxito en ambos intentos y hay un aumento considerable en el porcentaje de rendimiento de L-L-PAC cuando se usó jugo de caña de azúcar como medio de producción. Aunque el jugo de caña de azúcar es caro en comparación con la melaza, el procedimiento de extracción resultó ser mucho más fácil con el jugo de caña de azúcar en comparación con la melaza. Otras modalidades de investigación como diferentes factores, estudios de inmovilización, estudios de mutación, etc., podría ayudar a establecer métodos rentables para la producción de L-PAC mediante el uso de jugo de caña de azúcar como medio de producción. Este es el primer informe sobre el uso de Candida pseudointermedia e Issatchenkia orientalis para estudios de bioconversión de benzaldehído a L-PAC. El uso de jugo de caña de azúcar como medio de producción en estudios de biotransformación de benzaldehído a L-PAC es también el primer informe de este tipo. Además, el jugo de caña de azúcar mostró un mayor potencial de bioconversión que el medio de melaza. Las nuevas cepas que podemos explorar para las diferentes reacciones químicas. Se están realizando otros estudios en este sentido.
Agradecimientos
Los autores agradecen a IMTECH, Chandigarh por identificar las cepas nuevas y asignar los números MTCC.
