1. Pruebas de mutación del exón 2 de KRAS (codones 12/13) y del exón 3 (codón 61): Prueba de Mutación Cobas® KRAS para uso Diagnóstico In Vitro (Roche).
La prueba de Mutación Cobas® KRAS es una prueba de PCR en tiempo real para la detección cualitativa de mutaciones somáticas en el exón 2 (codones 12/13) y el exón 3 (codón 61) del gen KRAS utilizando una entrada de ADN de 100 ng. La prueba puede detectar mutaciones de 19 KRAS. La presencia de mutaciones se detecta con una especificidad analítica de al menos 99% y un límite de detección de al menos 5% de nivel de mutantes en un fondo de ADN genómico de tipo salvaje.
La prueba de mutación Cobas® KRAS se basa en dos procesos principales: (1) preparación manual de muestras para obtener ADN genómico de una o dos secciones de 5 µm de tejido FFPE CRC que contienen al menos un 10% de células tumorales; (2) amplificación por PCR del ADN diana utilizando pares de cebadores complementarios y dos sondas de oligonucleótidos marcadas con tinte fluorescente. Los pares de cebadores utilizados definen una secuencia de 85 pares de bases para el exón 2 que contiene los codones 12 y 13 de KRAS, y una secuencia de 75 pares de bases para el exón 3 que contiene el codón 61 de KRAS en el ADN genómico humano. Una sonda está diseñada para detectar la secuencia del codón KRAS 12/13 en el exón 2, y la otra sonda está diseñada para detectar la secuencia del codón KRAS 61 en el exón 3 del gen KRAS. La detección de mutaciones se logra mediante el análisis de la curva de fusión con el analizador Cobas z 480 (1).
2. Prueba de Mutación de KRAS v2 (LSR)
La Prueba de Mutación de KRAS v2 (LSR) es una prueba de PCR en tiempo real específica para alelos para la detección e identificación cualitativas de mutaciones en los exones 2, 3 y 4 en el gen homólogo del oncogén viral del sarcoma de rata Kirsten V-Ki-ras2 (KRAS) a partir de tejido fijo con formalina e incrustado en parafina (FFPET). La prueba está diseñada para detectar 28 mutaciones únicas. La presencia de mutaciones se detecta con una especificidad analítica de al menos 99% y un límite de detección de al menos 1% de nivel de mutantes en un fondo de ADN genómico de tipo salvaje.
La prueba de Mutación KRAS v2 (LSR) se basa en dos procesos: (1) preparación manual de muestras para obtener ADN genómico a partir de FFPET; y (2) amplificación y detección de ADN diana mediante PCR mediante pares de cebadores complementarios y sondas de oligonucleótidos etiquetadas con colorantes fluorescentes.
La prueba de mutación KRAS v2 (LSR) utiliza cebadores que definen secuencias de pares de bases específicas para cada una de las mutaciones objetivo. La amplificación ocurre solo en las regiones del gen KRAS entre los cebadores; el gen completo no se amplifica. Las secuencias de KRAS objetivo van de 79 a 114 pares de bases. La detección de mutaciones se logra mediante análisis por PCR con el analizador Cobas z 480. (1)
3. Prueba de Mutación de BRAF/NRAS (LSR)
La Prueba de Mutación de BRAF/NRAS (LSR) es una prueba de PCR en tiempo real específica para alelos para la detección e identificación cualitativas de mutaciones en los exones 11 y 15 en el gen proto-oncogén B-Raf (BRAF) y mutaciones en los exones 2, 3 y 4 en el gen homólogo del oncogén viral RAS del neuroblastoma (NRAS) a partir de tejido fijo con formalina e incrustado en parafina (FFPET).
La prueba está diseñada para detectar 36 mutaciones únicas. La presencia de mutaciones se detecta con una especificidad analítica de al menos 99% y un límite de detección de al menos 5% de nivel de mutantes en un fondo de ADN genómico de tipo salvaje.
La prueba de Mutación BRAF/NRAS (LSR) se basa en dos procesos principales: (1) preparación manual de muestras para obtener ADN genómico a partir de FFPET; y (2) amplificación y detección de ADN diana mediante PCR mediante pares de cebadores complementarios y sondas de oligonucleótidos etiquetadas con colorantes fluorescentes.
La prueba de Mutación BRAF/NRAS (LSR) utiliza cebadores que definen secuencias de pares de bases específicas para cada una de las mutaciones objetivo. La amplificación ocurre solo en las regiones de los genes BRAF o NRAS entre los cebadores; el gen completo no se amplifica. Las secuencias BRAF van de 101 a 120 pares de bases. Las secuencias de NRAS varían de 94 a 121 pares de bases. La detección de mutaciones se logra mediante análisis por PCR con el analizador Cobas z 480. (2)
Implicación clínica
KRAS y NRAS son miembros de la familia de oncogenes RAS estrechamente relacionados, y las mutaciones en ambos genes en los codones 12, 13 (exón 2), codón 61 (exón 3) y codón 146 (exón 4) dan lugar a un aumento de los niveles de proteínas RAS unidas a trifosfato de guanosina. La señalización RAS hiperactiva promueve la oncogénesis. En el carcinoma colorrectal (CCR), las mutaciones de KRAS y NRAS en estos codones se encuentran en hasta 50% de los casos y predicen una falta de respuesta a la terapia anti-EGFR. La mayoría de las mutaciones RAS son mutaciones puntuales que ocurren en el exón 2 de KRAS (codones 12 o 13; aproximadamente el 40%). Otras mutaciones del RAS son menos frecuentes y las mutaciones más comunes se producen en los exones 3 y 4 del KRAS y en los exones 2 y 3 del NRAS (3).
Aproximadamente el 50% de los melanomas albergan mutaciones activadoras en BRAF. Más del 90% de las mutaciones en BRAF dan lugar a un cambio en el nucleótido 1799 T>que conduce a una sustitución de valina a ácido glutámico en la posición 600 (V600E). La mutación BRAF V600E causa una señalización incontrolada de la vía MAPK que conduce al crecimiento y proliferación celular excesivos. Los fármacos dirigidos a BRAF mutante activado (inhibidores de BRAF) han demostrado ser eficaces en pacientes con melanoma metastásico que alberga esta mutación (1-3).
Además de su valor predictivo en melanoma, la mutación BRAF V600E también tiene valor pronóstico en cáncer colorrectal y cáncer de pulmón (CPCNP) (4,5,7). La mutación BRAF V600E se encuentra en aproximadamente 10% de los carcinomas colorrectales metastásicos y se ha relacionado con la presencia de inestabilidad de microsatélites (6). En general, los pacientes con CCR mutante de BRAF tienen tasas de respuesta bajas a las terapias convencionales y un pronóstico adverso. Si bien los melanomas con mutación BRAF V600 son sensibles a los inhibidores de BRAF, es posible que los CCR con mutación BRAF V600 no sean tan sensibles. La activación del EGFR en el cáncer colorrectal podría explicar por qué los cánceres colorrectales generalmente tienen una respuesta más baja a los inhibidores de BRAF. Por lo tanto, se aconseja iniciar el tratamiento combinado con inhibidores de EGFR y BRAF.
La mutación BRAF V600E también se encuentra en el 3-5% de todos los cánceres de pulmón (7). Si bien los inhibidores de BRAF han demostrado ser exitosos en pacientes de CPCNP con mutación V600E positiva, la FDA aprobó el uso de la terapia combinada con inhibidores de BRAF y MEK para pacientes de CPCNP con mutación V600E basada en los resultados de un ensayo internacional, multicéntrico, de tres cohortes, no aleatorizado, no comparativo, abierto, en pacientes de CPCNP metastásico con mutación V600E confirmada localmente.
Requisitos de la muestra
Las muestras aceptables para el ensayo son muestras de tejido de carcinoma colorrectal incrustadas en parafina y fijadas con formalina con un tiempo de fijación de 6 a 48 horas.
Volumen
1 se prefiere un bloque de parafina representativo. Alternativamente, para las muestras de resección se requiere un mínimo de 5 secciones de tejido sin teñir (5 µm de espesor) (prueba RAS completa).
Instrucciones de almacenamiento y envío
Mantener y enviar muestras a temperatura ambiente.
Limitaciones
Es posible que el contenido tumoral insuficiente no permita la detección de mutaciones en KRAS/NRAS/BRAF: se requiere el 10% de las células tumorales. El contenido del tumor se evalúa antes del análisis y se realiza una macrodisección. Los fijadores distintos de la formalina o el tiempo de fijación prolongado pueden dar lugar a resultados inadecuados.
Requisitos especiales
Ninguno.
Tiempo de entrega
de 5 a 7 días hábiles para portaobjetos y bloques de parafina respectivamente.
- Li et al. Ensayo Altamente Verificado para la Detección de Mutaciones de KRAS en Tejidos y Plasma de Cáncer de Pulmón, Colorrectal y Páncreas. Arch Pathol Lab Med. 2019 Feb;143:183-9
- Patten et al. Una prueba sensible y precisa para la detección simultánea de 36 mutaciones en BRAF y NRAS. Revista de Oncología Clínica 2018 36:15
- Douillard JY et al. Tratamiento con Panitumumab-FOLFOX4 y mutaciones RAS en el cáncer colorrectal. N Engl J Med. 2013 Sep 12; 369 (11): 1023-34.
Actualizado el 03 de diciembre de 2019
