Purificación y caracterización de Asparaginasa de semillas de Phaseolus vulgaris

Resumen

La L-asparaginasa de bacterias se ha utilizado en el tratamiento de la leucemia linfoblástica aguda. El objetivo de este estudio fue purificar y caracterizar la L-asparaginasa a partir de semillas de Phaseolus vulgaris en lugar de fuentes microbianas. La L-asparaginasa se purificó hasta alcanzar una aparente homogeneidad. La enzima tiene una masa molecular de 79 kDa. La asparaginasa purificada tuvo una actividad muy baja hacia una serie de análogos de asparagina y glutamina. La L-asparaginasa estaba libre de actividad glutaminasa. Los parámetros cinéticos, Km y Vmax de la enzima purificada, fueron de 6,72 mm y 0,16 µM, respectivamente. La enzima tenía un pH óptimo de 8,0. La enzima mostró una alta estabilidad a pH alcalino (pH 7,5-9,0) cuando se incubó hasta 24 h. La L-asparaginasa tuvo la misma temperatura óptima y estabilidad térmica a 37°C. K+ fue capaz de mejorar en gran medida la actividad de la asparaginasa en un 150% en comparación con otros metales probados. En conclusión, la L-asparaginasa no mostró actividad glutaminasa y buena estabilidad en una amplia gama de condiciones fisiológicas, y por lo tanto podría usarse como candidato potencial para el tratamiento de la leucemia linfoblástica aguda.

1. Introducción

La L-asparaginasa (L-asparagina amidohidrolasa E. C. 3.5.1.1) se utiliza en el tratamiento de la leucemia linfoblástica aguda y el linfoma no Hodgkin . El uso de la L-asparaginasa en la terapia contra el cáncer se basa en su capacidad de escindir la L-asparagina, un aminoácido esencial para el crecimiento de los linfoblastos, en amoníaco y ácido L-aspártico en suero y líquido cefalorraquídeo, ya que los linfoblastos no pueden producir L-asparagina endógena, lo que conduce a la muerte de estas células . La mayoría de las células cancerosas dependen de una fuente exógena de este aminoácido para sobrevivir. Sin embargo, las células normales son capaces de sintetizar L-asparagina y, por lo tanto, se ven menos afectadas por su rápida depleción debido al tratamiento con esta enzima. La L-asparaginasa también se puede usar para reducir la formación de acrilamida en alimentos fritos y cocidos al horno, especialmente en papas fritas . La formación de acrilamida se atribuyó a la reacción de asparagina libre y azúcares reductores . El agotamiento de la asparagina por la asparaginasa impidió la formación de acrilamida .

La L-asparaginasa se distribuye ampliamente entre plantas, animales y microorganismos . En la planta, esta enzima se detectó por primera vez en las semillas en desarrollo de Lupinus albus . La asparaginasa también se ha purificado de los testa de semillas maduras de L. polyphyllus . Se han identificado dos formas de la enzima. Una forma independiente de K + se encuentra en L. arboreus y L. polyphyllus y una forma dependiente de K+se encuentra en Pisum sativum y varias otras especies de leguminosas, incluidas otras especies de Lupinus . El trabajo con anticuerpos contra la forma independiente de K+de L. polyphyllus no reveló reacción cruzada con asparaginasa de guisante o con una serie de variedades de Lupinus que contienen la enzima dependiente de K+, lo que sugiere que las dos formas de asparaginasa son inmunológicamente distintas .

Se ha informado muy poca información sobre el uso de asparaginasa vegetal en el tratamiento de la leucemia linfoblástica aguda . Por lo tanto, el objetivo principal de este estudio fue purificar y caracterizar la L-asparaginasa de semillas de Phaseolus vulgaris libres de L-glutaminasa en lugar de L-asparaginasa de fuentes microbianas que se usa como anticancerígeno y causa efectos secundarios debido a sus respuestas inmunológicas.

2. Material y métodos

2.1. Materiales vegetales

Semillas maduras de Phaseolus vulgaris cv. Giza 6 se obtuvieron del Centro de Investigación Agrícola de El Cairo (Egipto).

2.2. Purificación de Asparaginasa

2.2.1. Extracto crudo

El extracto crudo de asparaginasa se preparó mediante homogeneización de 50 g de semillas de Phaseolus vulgaris cv. Tampón Giza 6 en Tris-HCl de 20 mM, pH 8,0 que contiene 10% de glicerol, 50 mM KCl, 12,5 mM β-mercaptoetanol y 1 mm PMSF. El homogeneizado se centrifugó a 10.000 × g y el sobrenadante se designó como extracto crudo. El extracto crudo se concentró mediante diálisis contra sacarosa sólida.

2.2.2. Columna de DEAE-Sefarosa

Se aplicó extracto crudo concentrado sobre una columna de DEAE-Sefarosa (15 × 1,6 cm d.i.) que se equilibró previamente con tampón Tris-HCl de 20 mM, pH 8,0. La enzima fue eluida por diferentes concentraciones de KCl preparadas en el mismo tampón a un caudal de 60 ml / h y se recogieron fracciones de 3 ml. Se eluyeron tres picos de proteína con la actividad de la asparaginasa de acuerdo con el orden de elución (asparaginasas I, II y III).

2.2.3. La asparaginasa I con mayor actividad de Sephacril S-200

se aplicó en una columna de Sephacril S-200 (90 × 0.6 cm de diámetro interior) que se equilibró previamente con el mismo tampón a un caudal de 30 ml / h y se recogieron fracciones de 3 ml.

2.3. Ensayo de asparaginasa

La actividad de la L-asparaginasa se midió mediante el método de muñeca modificado . La L-asparaginasa cataliza la L-asparagina a ácido L-aspártico y amoníaco, y este último reacciona con el reactivo de Nessler para producir un producto de color naranja. La mezcla de ensayo enzimático consistió en 900 µL de L-asparagina recién preparada (20 mm) en tampón Tris-HCl de 50 mM (pH 8,0), 50 mM KCl y 100 µL de extracto crudo de la enzima. La mezcla de reacción se incubó a 37°C durante 30 minutos y la reacción se detuvo añadiendo 100 µL de ácido tricloroacético al 15%. La mezcla de reacción se centrifugó a 10.000 ×g durante 5 minutos a 4°C para eliminar los precipitados. El amoníaco liberado en el sobrenadante se determinó mediante técnica colorimétrica añadiendo 100 µL de reactivo de Nessler a la muestra que contenía 100 µL de sobrenadante y 800 µL de agua destilada. Los contenidos de la muestra se vorticaron e incubaron a temperatura ambiente durante 10 min y se midió la DO a 425 nm. El amoníaco producido en la reacción se determinó a partir de la curva estándar obtenida con sulfato de amonio. Una unidad de actividad de L-asparaginasa se define como la cantidad de enzima que libera 1 µmol de amoníaco por minuto a 37°C.

2.4. Determinación de proteínas

La proteína se cuantificó por el método de Bradford con albúmina sérica bovina como estándar.

2.5. La Determinación del Peso Molecular

El peso molecular nativo fue determinado por Sephacryl S-200. La columna se calibró con citocromo C (12.400), anhidrasa carbónica (29.000), albúmina sérica bovina (67.000), alcohol deshidrogenasa (150.000) y β-amilasa (200.000). El azul dextrano (2.000.000) se utilizó para determinar el volumen del vacío (Vo). El peso molecular de las subunidades se estimó mediante electroforesis en gel de poliacrilamida y SDS . Para la curva de calibración se utilizaron fosforilasa b desnaturalizada SDS (94.000), albúmina sérica bovina (67.000), ovoalbúmina (43.000), anhidrasa carbónica (30.000), inhibidor de tripsina de soja (20.000) y α-lactoalbúmina (14.200).

2.6. Caracterización de Asparaginasa

2.6.1. Especificidad de sustrato

La actividad de la asparaginasa se determinó con algunos análogos de la L-asparagina. La actividad relativa se expresó como la relación porcentual de la actividad enzimática determinada contra diferentes análogos de la estructura de la L-asparagina a la actividad enzimática con L-asparagina.

2.6.2. Parámetros cinéticos

Los valores de las constantes de Michaelis (km) y la velocidad máxima (Vmax) se determinaron utilizando L-asparagina como sustrato en el rango de 2-20 mm. Los parámetros cinéticos se determinaron a partir de la gráfica de Lineeweaver-Burk.

2.6.3. Efecto del pH

El pH óptimo para la actividad de la asparaginasa se determinó mediante el análisis de la actividad a diferentes valores de pH. La estabilidad del pH se probó mediante incubación de la enzima a un pH de 5,0–9,0 durante 24 h a 4°C en ausencia de sustrato y se determinó la actividad residual en las condiciones de ensayo estándar.

2.6.4. Efecto de la temperatura

La temperatura óptima para la actividad de la asparaginasa se determinó mediante el ensayo de la enzima a diferentes temperaturas. La estabilidad térmica se midió incubando la enzima sola a diferentes temperaturas durante 1 h. Después del tratamiento térmico, se enfrió la solución enzimática y se evaluó la actividad residual después de agregar los sustratos.

2.6.5. Efecto de iones metálicos

Los efectos de varios iones metálicos sobre la actividad enzimática se determinaron preincubando la enzima sola con iones metálicos de 10 mm durante 15 minutos antes de agregar el sustrato. La actividad que se evaluó en ausencia de iones metálicos se tomó al 100%.

3. Resultados y Discusión

Los resultados de las etapas de purificación de la asparaginasa de P. vulgaris se resumen en la Tabla 1. El perfil de elución de la cromatografía en la columna de DEAE-Sefarosa (Figura 1) mostró tres picos de proteínas con actividad de asparaginasa. El pico con mayor actividad de asparaginasa se aplicó en una columna de Sephacril S-200 (Figura 2). La L-asparaginasa I se purificó 21,7 veces con una actividad específica de 846 unidades/mg de proteína. Se demostró que la asparaginasa I era pura después de la columna de Sephacril S-200, evaluada por SDS-PAGE (Figura 3). El peso molecular de la asparaginasa I por los procedimientos Sephacril S-200 y SDS-PAGE arrojó un valor de 79 kDa como subunidad monomérica. Este hallazgo concuerda con los pesos moleculares de las asparaginasas de Vigna unguiculata (70 kDa) y Lupinus polyphyllus (75 kDa) . Se detectó un peso molecular medio de 58 kDa para la asparaginasa de hojas de guisantes . Para las asparaginasas bacterianas, el peso molecular varió de 140 a 160 kDa con subunidades tetrámeras . Se detectó un peso molecular muy bajo de 11,2 kDa para Streptobacillus sp. Asparaginasa KK2S4 .

Figura 1

Un típico perfil de elución de la cromatografía de asparaginasa de P. vulgaris en DEAE-Sepharose columna (15 × 1,6 cm yo.d.) previamente equilibrado con tampón Tris-HCl de 20 mm, pH 8,0 a un caudal de 60 ml/h y fracciones de 3 ml.

Gráfico 2

Filtración en gel de asparaginasa I a partir de fracción DEAE-sefarosa en columna de sefacrilo S-200 (90 × 1,6 cm d.i.). La columna se equilibró con tampón Tris-HCl de 20 mm, pH 8,0 a un caudal de 30 ml/h y fracciones de 3 mL.

Figura 3

SDS-PAGE para la homogeneidad y la determinación del peso molecular de asparaginasa yo de Phaseolus vulgaris. (1) Marcadores de proteínas; (2) Asparaginasa I de Sephacril S-200.

La especificidad del sustrato de la asparaginasa I se ha examinado utilizando varios análogos de asparagina y glutamina (Tabla 2). La actividad con la L-asparagina se consideró 100% de actividad. La DL-asparagina exhibió un 30% de actividad enzimática, donde la DL-asparagina se compone de un 1 : 1 mezcla racémica. Los análogos de la D-asparagina, el ácido L-aspártico y el ácido L-glutámico tuvieron una actividad muy baja hacia la asparaginasa I. No se detectó actividad en presencia de L-glutamina. Por lo tanto, la asparaginasa I de P. vulgaris está libre de glutaminasa. La contaminación de la asparaginasa con la actividad de la glutaminasa causó efectos secundarios durante el curso de la terapia contra el cáncer . La asparaginasa L. arboreus hidrolizó solo L-asparagina y DL-aspartil hidroxamato . La asparaginasa V. unguiculata fue específica para la L-asparagina, no hidrolizó la D-asparagina y no fue específica para la L-glutamina .

Los parámetros cinéticos, Km y Vmax de la enzima purificada, fueron de 6,72 mm de asparagina y 0,16 µM de amoníaco/mL, respectivamente (Figura 4). Se determinaron valores similares de Km de 6,6 y 7,0 mm para las asparaginasas de L. arboreus y L. angustifolius, respectivamente . La asparaginasa de semillas de Lupinus tiene un Km alto de asparagina (12,2 mm) . Km bajo (1.2 mm) para la asparaginasa de V. unguiculata . Para las bacterias, los valores de Km para la L-asparaginasa de Escherichia coli y Erwinia carotovora fueron de 3,5 y 7,14 mm, respectivamente .

Figura 4

Lineweaver-Burk de la trama relativa de asparaginasa I de P. vulgaris velocidades a diferentes L-asparagina concentraciones.

La asparaginasa I mostró un pH óptimo de 8,0 (Figura 5). Entre pH 6,0 y 9,0, se retuvo más del 50% de su actividad. Aunque la actividad máxima a pH fisiológico es uno de los requisitos previos de la L-asparaginasa para la actividad antitumoral, la enzima purificada sería útil porque el 80% de la actividad enzimática se retuvo a pH 7,5. La enzima mostró estabilidad a pH alcalino (pH 7,5–9,0), ya que retuvo el 90% de su actividad original cuando se incubó hasta 24 h (Figura 6). Sin embargo, el pH óptimo de las L-asparaginasas de varias plantas osciló entre 8,0 y 8,5. La mayoría de las L–asparaginasas de bacterias mostraron un pH alcalino óptimo (8,0-10) .

Figura 5

el pH óptimo de asparaginasa I de P. vulgaris. La actividad enzimática se midió a varios pH utilizando el método de ensayo estándar descrito anteriormente.

Gráfico 6

Estabilidad del pH de la asparaginasa I de P. vulgaris a un pH diferente después de la incubación durante 24 h a 4 ° C.

Se encontró que la asparaginasa I tenía una temperatura óptima a 37 ° C (Figura 7). Se notificó una temperatura óptima similar de asparaginasa de V. unguiculata (40°C). Esta temperatura también fue similar a la reportada para Pseudomonas aeruginosa y Pectobacterium carotovorum . La actividad óptima de Streptobacillus sp. la asparaginasa se registró a 35°C. Por el contrario, se observó L-asparaginasa de Chrombacteriaceae y Proteus vulgaris a 20°C y 57°C, respectivamente . Se detectó una relación no lineal entre la asparaginasa I y la estabilidad de temperatura (Figura 8). La actividad enzimática fue estable hasta 37°C después de la incubación durante 1 h. Asparaginasa de V. unguiculata fue estable hasta 40°C después de la incubación durante 15 min . Las asparaginasas de P. carotovorum y C. annuum conservaron su actividad inicial después de la incubación a 40°C y 45°C durante 60 min, respectivamente .

Figura 7

la Temperatura óptima de asparaginasa I de P. vulgaris. La actividad enzimática se midió a varias temperaturas utilizando el método de ensayo estándar descrito anteriormente.

Figura 8

estabilidad Térmica de asparaginasa I de P. vulgaris. La mezcla de reacción se preincubó a varias temperaturas durante 60 minutos antes de la adición del sustrato, seguido de enfriamiento en un baño de hielo. La actividad enzimática se midió utilizando el método de ensayo estándar descrito anteriormente. La actividad en el tiempo cero se tomó como 100% de actividad.

Se examinó el efecto de diferentes iones metálicos sobre la asparaginasa I (Tabla 3). Los iones metálicos se utilizaron a una concentración de 10 mm. K+ fue capaz de aumentar en gran medida la actividad de la asparaginasa I en un 150%. En planta, se habían identificado asparaginasas K+independientes y K+dependientes . K + actuó también como potenciador de la asparaginasa P. carotovorum . Ca2 + aumentó ligeramente la actividad en un 110%, pero Cu2+ inhibió ligeramente la actividad de la asparaginasa I. Además, Pb2+ y Hg2+ causaron un efecto parcialmente inhibitorio sobre la asparaginasa I. Sin embargo, la asparaginasa V. unguiculata fue activada por Ni2+ y Co2+ y fue inhibida por Mn2+, Zn2+, Ba2+ y Hg2+ . El EDTA como agente quelante de metales causó un efecto parcialmente inhibitorio sobre la asparaginasa I. Sin embargo, el EDTA no tuvo ningún efecto sobre la asparaginasa P. carotovorum .

4. Conclusiones

La L-asparaginasa I de P. vulgaris se purificó en forma libre de glutaminasa, lo que puede reducir la posibilidad de efectos secundarios durante el curso de la terapia contra el cáncer. La enzima mostró buena estabilidad en una amplia gama de condiciones fisiológicas como el pH y la temperatura. En el siguiente paso de nuestro proyecto, la L-asparaginasa I de P. vulgaris se utilizará como candidato potencial para el tratamiento de la leucemia linfoblástica aguda.

Conflicto de intereses

Los autores no tienen ningún conflicto de intereses relevante para este artículo que revelar.

Reconocimientos

Este proyecto fue financiado por el Plan Nacional de Ciencia, Tecnología e Innovación (MAARIFAH), Ciudad Rey Abdulaziz para la Ciencia y la Tecnología, Arabia Saudita, premio no. (11-BIO-1516-03). Los autores también agradecen el apoyo técnico de la Unidad de Ciencia y Tecnología de la Universidad Rey Abdulaziz.