C. Poliacrilamida Incrustada con perlas fluorescentes
Como se describió en la sección anterior, los sustratos de silicio demostraron ser valiosos para medir las fuerzas ejercidas por los queratocitos de movimiento rápido. Sin embargo, estos mismos sustratos son mucho menos útiles para estudiar la mayoría de las células de mamíferos. Para que las tracciones se calculen con precisión, el sustrato debe ajustarse para que coincida con la motilidad y la generación de fuerza de un tipo de celda dado. Es difícil producir con precisión un sustrato de silicio de conformidad deseada para células de movimiento más lento capaces de ejercer fuerzas superiores. Para superar esta limitación, Dembo y Wang (1999) utilizaron un sustrato de poliacrilamida incrustado con tamaño submicrométrico de perlas fluorescentes. La conformidad de los sustratos de poliacrilamida se puede ajustar químicamente variando las concentraciones de monómero y reticulador (Pelham y Wang, 1997). La poliacrilamida ofrece varias ventajas adicionales sobre los sustratos de silicio. En una amplia gama de deformaciones, exhibe un comportamiento linealmente elástico. Además, la poliacrilamida no es típicamente susceptible de unirse a las células por sí sola, sin la conjugación de ligandos específicos de adhesión celular (Nelson et al., 2003). Por lo tanto, es un andamio perfecto para estudiar la adhesión y el comportamiento celular de una manera controlable y definida.
El método computacional por el cual se utilizan deformaciones en el sustrato para determinar las tracciones ejercidas por la célula es muy similar a los métodos utilizados en los sustratos de silicio estresados antes mencionados. Sin embargo, el uso de marcadores fluorescentes ha mejorado en gran medida el método de seguimiento y la capacidad de calcular un campo de deformación preciso.
Dembo y Wang publicaron varios estudios utilizando la técnica resultante, microscopía de fuerza de tracción, que dilucidan los mecanismos de migración de fibroblastos. Específicamente, han demostrado que los laminipodios de la célula proporcionan casi toda la fuerza requerida para la locomoción hacia adelante (Munevar et al., 2001a). Sus resultados indican que el lamelipodio es una entidad mecánica distinta del resto del cuerpo celular. Curiosamente, esta misma división mecánica dentro de la célula no parece existir en las células transformadas H-ras, tal vez explicando la diferencia en su comportamiento móvil. Además, Beningo et al. (2001) investigaron el papel de las adherencias focales en la regulación de la generación de tracción y encontraron que el tamaño de las adherencias focales está inversamente relacionado con la cantidad de fuerza generada. Además, la distribución de adherencias no se corresponde bien con la distribución de las fuerzas de tracción. Los autores concluyen que estos resultados pueden indicar que los complejos focales tempranos son responsables de fuertes fuerzas de propulsión, y la maduración de estos sitios de adhesión resulta en un cambio en sitios de anclaje pasivo, una conclusión que ha sido ampliamente discutida en la literatura. Además, Dembo y sus compañeros de trabajo investigaron los roles dinámicos que las adherencias delanteras versus traseras (Munevar et al., 2001b), myosina IIb (Lo et al., 2004), cinasa de adhesión focal (Wang et al., 2001), y los canales de Ca2+ activados por estiramiento juegan en la migración de fibroblastos (Munevar et al., 2004). Con el uso de microscopía de fuerza de tracción, Dembo y sus compañeros de trabajo han logrado avances significativos en la comprensión del papel de la generación de fuerza en la migración de fibroblastos.
Uno de los avances técnicos más significativos que utiliza el gel de poliacrilamida es la capacidad de controlar de manera confiable el cumplimiento del sustrato celular sin cambiar la densidad de ECM. El ajuste de la conformidad del sustrato fue un punto de inflexión crítico en el desarrollo de la microscopía de fuerza de tracción, ya que permitió la investigación de casi cualquier tipo de célula y la comprensión del comportamiento celular en función del entorno mecánico. Antes del estudio de Pelham y Wang (1997), la mayoría de los estudios que investigaban la migración y adhesión celular se centraban en la migración celular en respuesta a su entorno químico soluble (quimiotaxis) o en respuesta al ligando conjugado con el sustrato (haptotaxis). Además, los estudios relacionados con el entorno mecánico de la célula se centraron en la respuesta debida a fuerzas impuestas, como el esfuerzo cortante del fluido y el estiramiento mecánico. Sin embargo, al cambiar la rigidez del sustrato, Pelham y Wang (1997) crearon un cambio significativo en la forma en que los investigadores abordan la respuesta celular y la mecanotransducción. Utilizando sustratos de poliacrilamida, Pelham y Wang mantuvieron constante la densidad de ECM en el sustrato al tiempo que alteraban el cumplimiento mecánico. Demostraron que los fibroblastos son capaces de responder activamente a la conformidad mecánica de su sustrato. Las células en geles más rígidos se diseminan más y migran más lentamente que las células en geles más compatibles. Además, la capacidad de las células para detectar la conformidad mecánica de su sustrato se refleja en su capacidad para cambiar el estado de fosforilación de numerosas proteínas contenidas dentro de la estructura de adhesión focal. Las adherencias focales en sustratos rígidos son más grandes, más alargadas y más estables, mientras que las adherencias focales en sustratos más compatibles contienen menos pp125FAK y paxilina fosforilados y aparecen mucho más irregularmente. Estos resultados fueron los primeros en sugerir que las señales mecánicas de ECM pueden ser tan importantes como las señales químicas en la regulación de la adhesión celular.
Desde el artículo seminal de Pelham y Wang (1997), varios estudios han investigado los efectos del cumplimiento en el comportamiento celular. Lo et al. (2000) utilizaron química de poliacrilamida para crear un sustrato que contiene un paso en la rigidez, una región central del sustrato donde se encuentran dos sustratos de diferentes conformidades. Demostraron un comportamiento llamado durotaxis, por el cual las células fueron capaces de detectar activamente y responder a los cambios en el cumplimiento del sustrato. Las células que migraban sobre el sustrato blando, al golpear el límite de la transición rígido–blando, cruzaban sobre el sustrato rígido, mientras que las células en sustratos rígidos exhibían tracciones más altas y un área más extendida, y se retraían o cambiaban de dirección en respuesta al límite rígido–blando. Más tarde, Wong et al. (2003) investigaron la capacidad de los fibroblastos para migrar en hidrogeles de poliacrilamida que contienen gradientes de cumplimiento, en lugar de un paso, como lo hicieron lo y sus compañeros de trabajo. Encontraron que las células de músculo liso vascular tienden a migrar más rápido en sustratos más blandos que en sustratos más rígidos (15 kPa vs 25 kPa), y que las células tienden a acumularse en sustratos más rígidos. Además, el patrón de migración en geles compatibles con gradiente parecía estar dirigido hacia las regiones de gel más rígidas en lugar de exhibir el patrón de caminata aleatorio típico de la migración celular. Engler et al. (2004) investigaron más a fondo la respuesta celular a los geles compatibles y mostraron que la respuesta está en gran parte mediada por el ensamblaje del citoesqueleto de actina. Al probar cambios en el citoesqueleto, Engler y sus compañeros de trabajo pudieron demostrar que una ligera sobreexpresión de actina en la célula puede compensar la pérdida de propagación observada en las respuestas de gel blando. Además, Yeung et al. (2005) mostraron que el umbral de sensibilidad para la detección de cumplimiento es específico del tipo celular y que los contactos célula–célula también pueden ayudar a rescatar los cambios morfológicos observados en los sustratos blandos para parecerse más a la morfología de las células en sustratos más rígidos (Yeung et al., 2005). En general, el estudio de la durotaxis es todavía relativamente joven, y queda mucho por aprender sobre cómo una célula detecta mecánicamente y responde a las propiedades materiales de su sustrato y entorno.
