El ARN total se extrajo utilizando Reactivo de aislamiento Tripure (Roche).
Las muestras de ARN se trataron con DNaseI libre de RNasa y se purificaron utilizando el Mini kit RNeasy (QIAGEN). El ARN resultante se agotó de ARN ribosómico mediante el uso de un Kit de Eliminación de ARNr Ribo-Cero (Humano / Ratón / Rata) (Epicentro). El ARN agotado por ARNr se utilizó para sintetizar el cADN de la primera hebra utilizando el Sistema de Síntesis de Primera Hebra SuperScript® III (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Posteriormente, la segunda cadena se generó mediante el uso de E. coli DNA ligasa (Invitrogen), E. polimerasa de ADN coli (Invitrogen), y conjunto dUTP, dCTP, dATP y dGTP (10 µmol cada uno, Promega), en el Tampón de Segunda Hebra (Invitrogen). Luego, los ADNc se cortaron con Covaris a aproximadamente 300 libras. Después de la fragmentación, las muestras se purificaron con columnas minelutas (Qiagen). Y los extremos sobresalientes de 3′ y 5′ de los fragmentos se repararon utilizando Polimerasa de ADN T4 (NEB) y Polinucleótido quinasa de ADN T4 (NEB) en tampón de ADN ligasa T4 (NEB). A continuación, los extremos dA se generaron empleando el fragmento Klenow (3′->5′ exo -, NEB), en el Búfer 2 (NEB). Las reacciones de ligadura de adaptadores se configuraron utilizando adaptadores indexados y Ligasa rápida (NEB). Los productos se utilizaron como plantilla para el tratamiento de UNG (Fermentas) y la amplificación de PCR utilizando la polimerasa de ADN de Alta Fidelidad de Phusión (NEB). Las bibliotecas se visualizaron en Geles de Agarosa de Uso General E-Gel® al 2% (Invitrogen). Las bibliotecas con códigos de barras se secuenciaron en un solo carril de un HiSeq2500 (Illumina).
