asparaginaasin puhdistamista ja luonnehtimista Phaseolus vulgaris-siemenistä

Abstrakti

l-asparaginaasia bakteereista on käytetty akuutin lymfoblastisen leukemian hoidossa. Tutkimuksen tavoitteena oli puhdistaa ja luonnehtia l-asparaginaasia Phaseolus vulgaris-siemenistä mikrobilähteiden sijaan. L-asparaginaasi puhdistettiin näennäiseen homogeenisuuteen. Entsyymin molekyylimassa on 79 kDa. Puhdistetulla asparaginaasilla oli hyvin vähäinen vaikutus useisiin asparagiini-ja glutamiinianalogeihin. L-asparaginaasi ei sisältänyt glutaminaasiaktiivisuutta. Puhdistetun entsyymin kineettisten parametrien Km ja Vmax todettiin olevan 6,72 mm ja 0,16 µM. Entsyymin optimaalinen pH oli 8,0. Entsyymi osoitti suurta stabiilisuutta emäksisessä pH: ssa (pH 7.5–9.0), kun sitä inkuboitiin 24 h: iin asti. L-asparaginaasilla oli sama optimaalinen lämpötila ja terminen stabiilisuus 37°C: ssa.K+ pystyi parantamaan huomattavasti asparaginaasin aktiivisuutta 150% verrattuna muihin testattuihin metalleihin. Yhteenvetona voidaan todeta, että L-asparaginaasi ei osoittanut glutaminaasiaktiivisuutta ja hyvää stabiilisuutta monissa fysiologisissa olosuhteissa, joten sitä voitaisiin käyttää potentiaalisena ehdokkaana akuutin lymfoblastisen leukemian hoidossa.

1. Johdanto

l-asparaginaasia (l-asparagiiniamidohydrolaasi E. C. 3.5.1.1) käytetään akuutin lymfoblastileukemian ja Non-Hodgkin-lymfooman hoidossa . L-asparaginaasin käyttö syöpähoidossa perustuu sen kykyyn pilkkoa l-asparagiini, lymfoblastien kasvulle välttämätön aminohappo, ammoniakiksi ja L-asparagiinihapoksi seerumissa ja aivo-selkäydinnesteessä, koska lymfoblastit eivät pysty tuottamaan endogeenista l-asparagiinia, joka johtaa näiden solujen kuolemaan . Useimmat syöpäsolut ovat riippuvaisia tämän aminohapon eksogeenisesta lähteestä selviytyäkseen. Normaalit solut kykenevät kuitenkin syntetisoimaan L-asparagiinia ja siten sen nopea ehtyminen tämän entsyymin käsittelyn vuoksi vaikuttaa niihin vähemmän. L-asparaginaasia voidaan käyttää myös vähentämään akryyliamidin muodostumista paistetuissa ja uuniruuissa erityisesti perunalastuissa . Akryyliamidin muodostumisen katsottiin johtuvan vapaan asparagiinin ja pelkistävien sokerien reaktiosta . Asparagiinin loppuminen asparaginaasin vaikutuksesta esti akryyliamidin muodostumisen .

l-asparaginaasi jakautuu laajalti kasveihin, eläimiin ja mikro-organismeihin . Kasvissa tämä entsyymi havaittiin ensimmäisen kerran Lupinus Albuksen kehittyvissä siemenissä . Asparaginaasia on puhdistettu myös L. polyphyllus-kasvin kypsyvien siementen testasta . Entsyymistä on tunnistettu kaksi muotoa. K+-riippumaton muoto on L. arboreuksella ja L. polyphylluksella ja K + – riippuvainen muoto on Pisum sativumilla ja useilla muilla palkokasvilajeilla, mukaan lukien muilla Lupinus-lajeilla . L. polyphyllus-bakteerin k+-riippumattoman muodon vasta-aineiden kanssa ei havaittu ristireaktiota herne-asparaginaasin tai K+ – riippuvaista entsyymiä sisältävien Lupinus-lajikkeiden kanssa, mikä viittaa siihen, että asparaginaasin kaksi muotoa ovat immunologisesti erillisiä .

kasvin asparaginaasin käytöstä akuutin lymfoblastisen leukemian hoidossa on raportoitu hyvin vähän tietoa . Siksi tämän tutkimuksen päätavoitteena oli puhdistaa ja luonnehtia l-asparaginaasia Phaseolus vulgaris-siemenistä, jotka eivät sisällä L-glutaminaasia, mikrobilähteistä peräisin olevan l-asparaginaasin sijaan, jota käytetään syöpälääkkeenä ja joka aiheutti sivuvaikutuksia immunologisten vasteidensa vuoksi.

2. Materiaali ja menetelmät

2.1. Kasviainekset

Phaseolus vulgaris cv: n kypsät siemenet. Giza 6 saatiin maatalouden tutkimuskeskuksesta Kairosta Egyptistä.

2.2. Asparaginaasin puhdistus

2.2.1. Raaka uute

asparaginaasiuute valmistettiin homogenoimalla 50 g: n siemeniä Phaseolus vulgaris cv: stä. Giza 6 20 mM: n Tris-HCl-puskurissa, pH 8,0, joka sisältää 10% glyserolia, 50 mM KCl, 12,5 mM β-merkaptoetanolia ja 1 mM PMSF: ää. Homogenaatti sentrifugoitiin kokoon 10 000 ×g, ja supernatantti nimettiin raakauutteeksi. Raakauute väkevöitiin dialyysillä kiinteää sakkaroosia vastaan.

2.2.2. Deae-Sefaroosikolonni

tiivistetty raakauute levitettiin DEAE-sefaroosikolonniin (15 × 1, 6 cm i.d.), joka oli aiemmin tasapainotettu 20 mM: n Tris-HCl-puskurilla, pH 8, 0. Entsyymi eluoitiin eri pitoisuuksilla samassa puskurissa valmistettua KCl: ää virtausnopeudella 60 mL/h ja 3 mL fraktioita kerättiin. Kolme proteiinipiikkiä eluoitiin asparaginaasiaktiivisuudella eluutiojärjestyksen (asparaginaasit I, II ja III) mukaisesti.

2.2.3. Sefakryyli S-200

asparaginaasi I, jolla oli suurin aktiivisuus, levitettiin sefakryyli S-200-sarakkeeseen (90 × 0.Kerättiin 6 cm i. d.), joka oli aiemmin tasapainotettu samalla puskurilla virtausnopeudella 30 mL/h ja 3 mL fraktioita.

2.3. Asparaginaasimääritys

L-asparaginaasin aktiivisuus mitattiin muunnetulla wriston-menetelmällä . L-asparaginaasi katalysoi L-asparagiinia L-asparagiinihapoksi ja ammoniakiksi ja jälkimmäinen reagoi nesslerin reagenssin kanssa muodostaen oranssinvärisen tuotteen. Entsyymimääritysseoksessa oli 900 µL vastavalmistettua l-asparagiinia (20 mM) 50 mM: n Tris-HCl-puskurissa (pH 8,0), 50 mM KCl: ää ja 100 µL entsyymin raakaa uutetta. Reaktioseosta inkuboitiin 37°C: ssa 30 minuutin ajan ja reaktio pysäytettiin lisäämällä 100 µL 15-prosenttista trikloorietikkahappoa. Reaktioseosta sentrifugoitiin 10 000 ×g: n lämpötilassa 5 minuutin ajan 4°C: n lämpötilassa saostumien poistamiseksi. Supernatanttiin vapautuva ammoniakki määritettiin kolorimetrisellä menetelmällä lisäämällä 100 µL Nesslerin reagenssia näytteeseen, joka sisälsi 100 µL supernatanttia ja 800 µL tislattua vettä. Näytteen sisältö pyörrettiin ja inkuboitiin huoneenlämmössä 10 minuutin ajan, ja OD mitattiin 425 nm: ssä. Reaktiossa syntyvä ammoniakki määritettiin ammoniumsulfaatilla saadun standardikäyrän perusteella. Yksi yksikkö l-asparaginaasiaktiivisuutta määritellään määräksi entsyymiä, joka vapauttaa 1 µmol ammoniakkia minuutissa 37°C: ssa.

2,4. Proteiinin määritys

proteiini määritettiin Bradfordin menetelmällä naudan seerumin albumiinilla standardina.

2.5. Molekyylipainon määrittäminen

alkuperäinen molekyylipaino määritettiin sefakryyli S-200: lla. Kolonni kalibroitiin sytokromi C: llä (12 400), hiilihappoanhydraasilla (29 000), naudan seerumin albumiinilla (67 000), alkoholidehydrogenaasilla (150 000) ja β-amylaasilla (200 000). Dekstraanisinistä (2 000 000) käytettiin tyhjiön tilavuuden (Vo) määrittämiseen. Alayksikön molekyylipaino arvioitiin SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesilla . Kalibrointikäyrässä käytettiin SDS-denaturoitua fosforylaasi b: tä (94 000), naudan seerumin albumiinia (67 000), ovalbumiinia (43 000), hiilihappoanhydraasia (30 000), soijapavun trypsiinin estäjää (20 000) ja α-laktalbumiinia (14 200).

2.6. Asparaginaasin Luonnehdinta

2. 6.1. Substraattispesifisyys

Asparaginaasiaktiivisuus määritettiin joillakin l-asparagiinin analogeilla. Suhteellinen aktiivisuus ilmaistiin l-asparagiinin eri rakenteellisilla analogeilla määritetyn entsyymiaktiivisuuden prosenttisuhteena l-asparagiinin entsyymiaktiivisuuteen.

2.6.2. Kineettiset parametrit

Michaelis-vakioiden (Km) ja maksiminopeuden (Vmax) arvot määritettiin käyttämällä substraattina l-asparagiinia 2-20 mM: n alueella. kineettiset parametrit määritettiin Lineweaver-Burk-kuvaajasta.

2.6.3. Vaikutus pH

asparaginaasiaktiivisuuden optimaalinen pH määritettiin määrittämällä aktiivisuus eri pH-arvoilla. PH: n stabiilisuus testattiin inkuboimalla entsyymiä pH: ssa 5,0–9,0 24 tunnin ajan 4°C: ssa substraatin puuttuessa ja jäännösaktiivisuus määritettiin standardimääritysolosuhteissa.

2.6.4. Lämpötilan

vaikutus asparaginaasiaktiivisuuden optimaalinen lämpötila määritettiin määrittämällä entsyymi eri lämpötiloissa. Lämpöstabiilisuus mitattiin inkuboimalla yksin entsyymiä eri lämpötiloissa 1 tunnin ajan.lämpökäsittelyn jälkeen entsyymiliuosta jäähdytettiin ja jäännösaktiivisuus määritettiin substraattien lisäämisen jälkeen.

2.6.5. Metalli-Ioniefekti

eri metalli-ionien vaikutukset entsyymiaktiivisuuteen määritettiin preinkuboimalla entsyymiä yksin 10 mM Metalli-ioneilla 15 minuutin ajan ennen substraatin lisäämistä. Metalli-ionien puuttuessa määritetyn aktiivisuuden katsottiin olevan 100%.

3. Tulokset ja keskustelu

P. vulgaris-bakteerin asparaginaasin puhdistusvaiheiden tulokset on esitetty yhteenvetona taulukossa 1. DEAE-Sefaroosikolonnin kromatografian eluutioprofiili (Kuva 1) osoitti kolme asparaginaasiaktiivisia proteiineja. Sefakryyli s-200-sarakkeeseen levitettiin huippu, jossa asparaginaasiaktiivisuus oli suurin (kuva 2). L-asparaginaasi I puhdistettiin 21, 7-kertaisesti spesifisellä aktiivisuudella 846 yksikköä/mg proteiinia. Asparaginaasi I osoittautui puhtaaksi SEFAKRYYLI S-200-sarakkeen jälkeen, kuten SDS-PAGE arvioi (kuva 3). Asparaginaasi I: n molekyylipaino Sefakryyli S-200: lla ja SDS-PAGE-menetelmillä tuotti monomeerin alayksikkönä arvon 79 kDa. Tämä havainto on yhtäpitävä Vigna unguiculatan (70 kDa) ja Lupinus polyphylluksen (75 kDa) asparaginaasien molekyylipainojen kanssa . Herneen lehdistä saadun asparaginaasin keskimääräinen molekyylipaino oli 58 kDa . Bakteerien asparaginaasien molekyylipaino vaihteli välillä 140-160 kDa tetrameerin alayksiköillä . Streptobacillus sp: n molekyylipaino oli hyvin pieni, 11, 2 kDa. Kk2s4 asparaginaasi .

Kuva 1

tyypillinen eluutioprofiili P. vulgariksen asparaginaasin kromatografiassa deae-sefaroosipylväässä (15 × 1, 6 cm i.d.) aiemmin tasapainotettu 20 mM: n Tris-HCl-puskurilla, pH 8,0 virtausnopeudella 60 mL/h ja 3 mL fraktioita.

kuva 2

asparaginaasi I: n geelisuodatus DEAE-Sefaroosifraktiosta sefakryyli s-200-kolonnissa (90 × 1, 6 cm i.d.). Kolonni tasapainotettiin 20 mM: n Tris-HCl-puskurilla, pH 8, 0 virtausnopeudella 30 mL/h ja 3 mL fraktioita.

kuva 3

SDS-PAGE for homogeneity and molecular weight determination of asparaginase I from Phaseolus vulgaris. (1) Proteiinimarkkerit; (2) Sefakryyli S-200 asparaginaasi I.

asparaginaasi I: n substraattispesifisyyttä on tutkittu käyttämällä useita asparagiini-ja glutamiinianalogeja (Taulukko 2). Toimintaa L-asparagiinin kanssa pidettiin 100-prosenttisena aktiivisuutena. DL-asparagiinilla oli 30% entsyymin aktiivisuudesta, jossa DL-asparagiini koostuu 1 : 1 raseeminen seos. D-asparagiinin, L-asparagiinihapon ja L-glutamiinihapon analogeilla oli hyvin alhainen aktiivisuus asparaginaasi I: tä kohtaan.L-glutamiinin läsnä ollessa ei havaittu aktiivisuutta. Siksi P. vulgarisin asparaginaasi I ei sisällä glutaminaasia. Asparaginaasin kontaminaatio glutaminaasiaktiivisuuden kanssa aiheutti haittavaikutuksia syöpähoidon aikana . L. arboreus asparaginaasi hydrolysoi vain L-asparagiinin ja DL-aspartyylihydroksamaatin . V. unguiculata asparaginaasi oli spesifinen L-asparagiinille, ei hydrolysoinut D-asparagiinia eikä ollut spesifinen L-glutamiinille .

puhdistetun entsyymin kineettisten parametrien Km ja Vmax todettiin olevan 6, 72 mM asparagiinia ja 0, 16 µM ammoniakkia/mL (Kuva 4). L. arboreuksen asparaginaaseille määritettiin vastaavat Km-arvot 6,6 ja L. angustifoliuksen Asparaginaaseille 7,0 mM . Lupinuksen siementen asparaginaasilla on korkea Km asparagiinille (12,2 mM) . Matala Km (1.2 mM) määritettiin V. unguiculata-bakteerin asparaginaasille . Bakteerien osalta Escherichia coli-bakteerin l-asparaginaasin Km-arvot olivat 3,5 ja Erwinia carotovora-bakteerin 7,14 mM .

Kuva 4

Lineweaver-Burk-käyrä, joka liittyy asparaginaasi I: n P. vulgaris-nopeuksiin eri l-asparagiinipitoisuuksiin.

asparaginaasi I: n pH-arvo oli optimaalinen 8,0 (kuva 5). PH 6,0 – 9,0: n välillä sen aktiivisuudesta säilyi yli 50%. Vaikka maksimiaktiivisuus fysiologisessa pH: ssa on yksi L-asparaginaasin edellytyksistä antitumorille, puhdistettu entsyymi olisi hyödyllinen, koska 80% entsyymin aktiivisuudesta säilyi pH: ssa 7,5. Entsyymi oli stabiili emäksisessä pH: ssa (pH 7,5–9,0), sillä se säilytti 90% alkuperäisestä aktiivisuudestaan, kun sitä inkuboitiin 24 tuntiin asti (kuva 6). Useiden kasvien L-asparaginaasien pH-optimi vaihteli kuitenkin välillä 8,0-8,5 . Suurimmalla osalla bakteerien L–asparaginaaseista oli emäksinen pH optima (8,0-10) .

kuva 5

P. vulgariksen asparaginaasi I: n ph-optimi. Entsyymin aktiivisuus mitattiin eri pH: ssa aiemmin kuvatulla standardimääritysmenetelmällä.

kuva 6

P. vulgaris-bakteerin asparaginaasi I: n ph-stabiilisuus eri pH: ssa 24 tunnin inkubaation jälkeen 4°C: ssa.

asparaginaasi I: n lämpötila todettiin optimaaliseksi 37°C: ssa (Kuva 7). V. unguiculata-bakteerin asparaginaasin optimilämpötilan ilmoitettiin olevan samanlainen (40°C). Lämpötila oli myös samankaltainen kuin Pseudomonas aeruginosa-ja Pectobacterium carotovorum-bakteereilla. Streptobacillus sp: n optimaalinen aktiivisuus. asparaginaasi mitattiin 35°C: ssa . Päinvastoin, l-asparaginaasi chrombacteriaceae ja Proteus vulgaris havaittiin 20°C ja 57°C, vastaavasti . Asparaginaasi I: n ja lämpötilastabiilisuuden välillä havaittiin epälineaarinen suhde (kuva 8). Entsyymin aktiivisuus säilyi stabiilina 37°C: seen asti 1 tunnin inkubaation jälkeen. asparaginaasi V: stä. unguiculata oli stabiili 40°C: seen asti 15 minuutin inkuboinnin jälkeen . P. carotovorumin ja C. annuumin asparaginaasit säilyttivät alkuperäisen aktiivisuutensa inkuboinnin jälkeen 40°C: ssa ja 45°C: ssa 60 minuutin ajan .

Kuva 7

lämpötila optimaalinen asparaginaasi I P. vulgaris. Entsyymin aktiivisuus mitattiin eri lämpötiloissa aiemmin kuvatulla standardimääritysmenetelmällä.

Kuva 8

asparaginaasi I: n lämpöstabiilisuus P. vulgaris-organismista. Reaktioseosta esiinkuboitiin eri lämpötiloissa 60 minuutin ajan ennen substraatin lisäämistä, minkä jälkeen se jäähdytettiin jääkylvyssä. Entsyymin aktiivisuus mitattiin aiemmin kuvatulla standardimääritysmenetelmällä. Aktiivisuus nollahetkellä otettiin 100-prosenttiseksi aktiivisuudeksi.

eri metalli-ionien vaikutusta asparaginaasi I: een tutkittiin (Taulukko 3). Metalli-ioneja käytettiin 10 mM: n konsentraatiossa. K+ pystyi parantamaan huomattavasti asparaginaasi I: n aktiivisuutta 150%: lla. Kasveissa oli tunnistettu K+-riippumattomia ja K + – riippuvaisia asparaginaaseja . K+ toimi myös P. carotovorum asparaginaasin tehostajana . Ca2 + paransi hieman aktiivisuutta 110%: lla, mutta Cu2+ esti hieman asparaginaasi I: n aktiivisuutta .lisäksi Pb2+ ja Hg2+ aiheuttivat osittain estävän vaikutuksen asparaginaasi I: een. kuitenkin V. unguiculata asparaginaasi aktivoitui ni2+: lla ja Co2+: lla ja MN2+: lla, Zn2+: lla, Ba2+: lla ja Hg2+: lla. EDTA metallikelataattorina esti osittain asparaginaasi i: tä .EDTA ei kuitenkaan vaikuttanut P. carotovorum asparaginaasiin.

4. Päätelmät

P. vulgarisin l-asparaginaasi I puhdistettiin glutaminaasittomassa muodossa, mikä voi vähentää haittavaikutusten mahdollisuutta syöpähoidon aikana. Entsyymi osoitti hyvää stabiilisuutta erilaisissa fysiologisissa olosuhteissa kuten pH: ssa ja lämpötilassa. Seuraavassa vaiheessa projektimme, l-asparaginaasi I P. vulgaris käytetään mahdollisena ehdokas hoitoon akuutti lymfoblastinen leukemia.

eturistiriidat

kirjoittajilla ei ole tämän paperin kannalta merkityksellisiä eturistiriitoja julkistettavana.

kiitokset

tätä hanketta rahoitti National Plan for Science, Technology and Innovation (MAARIFAH), King Abdulaziz City for Science and Technology, Saudi Arabia, award no. (11-BIO-1516-03). Kirjoittajat myös kiittää tieteen ja teknologian yksikkö, kuningas Abdulaziz yliopisto, teknisestä tuesta.