Assessing the application of ka/Ks ratio test to alternatively spliced exons

Abstract

Summary: äskettäin on ehdotettu ja onnistuneesti käytetty eukaryoottien genomihuomautuksissa ka / Ks-suhdetestiä, jossa arvioidaan genomialueiden proteiinikoodausmahdollisuuksia niiden ei-synonyymien divergenssien perusteella. Suoritimme systemaattisesti ka / Ks-suhdetestin 925 transkriptiovahvisteisella, vaihtoehtoisesti yhdistetyllä eksonilla ihmisen genomiin, jota kuvaamme tässä käsikirjoituksessa. Havaitsimme, että 22,3% evolutionaarisesti säilötyistä vaihtoehtoisesti yhdistetyistä eksoneista ei läpäise ka/Ks-suhdetestiä, kun taas konstitutiivisilla eksoneilla vastaava luku oli 9,8%. Väärien negatiivien osuus oli korkein (85,7%) eksoneilla, joiden transkriptioiden sisällyttäminen oli vähäistä. Vaihtoehtoisesti yhdistettyjen eksonien analyysit, joita täydet mRNA-sekvenssit tukivat, tuottivat samanlaisia tuloksia, ja lähes puolet eksoneista, jotka osallistuivat esi-isien vaihtoehtoisiin liitostapahtumiin, eivät läpäisseet tätä testiä. Analyysimme viittaa tulevaisuuden suuntaan sisällyttää vertaileva genomiikka-pohjainen vaihtoehtoisia liitos ennusteita kanssa ka / Ks suhde testi korkeampi eukaryootit laaja RNA vaihtoehtoinen liitos.

Contact:[email protected]

1 Johdanto

vertaileva genomiikka on tarjonnut tehokkaita työkaluja eukaryoottisten genomien merkintöihin (Kellis et al., 2003). Uraauurtavassa tutkimuksessa Nekrutenko et al. (2002) ehdotti ”ka/Ks-suhdetestiä” ennustettujen eksonien proteiinia koodaavien potentiaalien arvioimiseksi. Tämä testi perustuu oletukseen, että suurin osa ihmisen perimän proteiinia koodaavista alueista on voimakkaan puhdistavan valinnan alla evoluution aikana. Tämän seurauksena niiden synonyymi ero (Ks) huomattavasti ylittää ei-synonyymi ero (Ka), jolloin ka/Ks suhde on paljon pienempi kuin yksi ihmisen ja hiiren ortologinen sekvenssivertailuissa. Näytteestä, jossa oli 1244 eksonia 153: sta proteiinia koodaavasta geenistä, Ka/Ks-suhdetesti antoi 8% väärän negatiivisen tuloksen ja <5% väärän positiivisen tuloksen sisäisille eksoneille, tarkkuus, joka oli parempi kuin useimmat geenin ennustusvälineet (Nekrutenko et al., 2002). Käyttöönoton jälkeen ka / Ks-suhdetestiä on käytetty laajalti ja menestyksekkäästi ihmisen ja muiden nisäkkäiden genomien merkintöjen parantamiseen (Miller et al., 2004; Nekrutenko, 2004; Nekrutenko et al., 2003b; Zhang ja Gerstein, 2004).

yksi esiin nouseva kysymys Ka/Ks-suhdetestistä liittyy vaihtoehtoisesti eukaryoottisten genomien eksoneihin. Viimeaikaiset tutkimukset ilmentyneiden sekvenssien ja mikroarray tiedot ovat osoittaneet, että vaihtoehtoinen liittäminen on laaja mekanismi geenin säätelyn korkeampi eukaryootit (Lareau et al., 2004; Modrek ja Lee, 2002). Jopa kolme neljäsosaa ihmisen koodausgeeneistä käy läpi vaihtoehtoisen liitoksen (Johnson et al., 2003). On runsaasti todisteita siitä, että vaihtoehtoiset liitokset liittyvät valintapaineen relaksaatioihin evoluution aikana (Boue et al., 2003). Esimerkiksi vaihtoehtoisen liitoksen on havaittu liittyvän eksonien syntymisen ja häviämisen nopeutuneeseen nopeuteen (Modrek ja Lee, 2003), uusien eksonien syntyyn Alu-alkuaineista (Sorek et al., 2002), tolerance of premature termination codons (Lewis et al., 2003; Xing ja Lee, 2004) ja niin edelleen. Iida and Akashi (2000) tutki 110: n ihmisen ja Drosophilan proteiinikoodausgeenien sekvenssierotuskuvioita ja havaitsi, että vaihtoehtoisesti näiden geenien yhdistetyillä alueilla oli korkeammat ka/Ks-arvot verrattuna konstitutiivisiin alueisiin. Myös muita esimerkkejä kohonneista Ka / Ks-arvoista vaihtoehtoisesti yhdistetyissä eksoneissa on raportoitu (Filip and Mundy, 2004; Hurst and Pal, 2001). Nämä havainnot herättävät kysymyksen siitä, poikkeaako ka/Ks-suhdetesti vaihtoehtoisesti yhdistettyjen eksonien välillä.

2 METHODS

we identified alternatively spliced exons by aligning human expressed sequences to the human genome (Modrek et al., 2001). Kvantifioidaksemme vaihtoehtoisen liittämisen asteen jokaiselle vaihtoehtoisesti yhdistetylle eksonille, käytimme vaihtoehtoisen liittämisen standardimittaria-eksonin sisällyttämistasoa, joka määritellään niiden Estien lukumääränä, jotka sisälsivät eksonin jaettuna niiden Estien kokonaismäärällä, jotka joko sisälsivät tämän eksonin tai jättivät sen väliin. Jaoimme vaihtoehtoisesti yhdistetyt eksonit kolmeen luokkaan niiden inkluusiotasojen perusteella: duuri-muoto (>2/3), keskimuoto (1/3-2/3) ja minor-muoto (<1/3).

tunnistimme ortologisen eksonijakson jokaiselle ihmisen eksonille hiiren ortologien genomijaksossa, kuten aiemmin on kuvattu (Modrek and Lee, 2003). Jokaiselle ihmisen ja hiiren ortologiselle eksonisarjaparille suoritimme ka / Ks-suhdetestin Nekrutenkon et al-protokollan mukaisesti. (2003a). Lyhyesti, ortologinen eksoni sekvenssejä ihmisen ja hiiren käännettiin ja sitten linjassa käyttäen CLUSTALW Thompson et al., 1994 oletuksena parametrit. Tällä proteiinin kohdistuksella kylvettiin vastaavien nukleotidisekvenssien kohdistus, ja aukot kohdistuksessa lohkottiin. Arvioimme synonyymien ja ei-synonyymien/sivustojen määrän käyttäen yang-Nielsen-arvioita PAML-paketin yn00-ohjelmasta (PAML 3.14) (Yang, 1997). Rakensimme 2 × 2 varautumistaulukon käyttäen muuttuneiden ja muuttumattomien synonyymisten/ei-synonyymisten sivustojen numeroita ja testasimme, oliko Ka/Ks-suhde merkittävästi <1 käyttäen Fisherin tarkkaa testiä. Määrittelimme eksonin läpäisevän ka / Ks-suhdetestin, jos sen ka / Ks oli merkitsevästi <1 tasolla p < 0,05.

3 RESULTS AND DISCUSSION

kokosimme listan 925 ihmisen vaihtoehtoisesti yhdistetystä eksonista, jotka säilyivät ihmisen ja hiiren genomien välillä, perustuen ihmisen ilmentymien sekvenssien analyyseihin (Modrek et al., 2001). Kokosimme myös listan 10 996 ihmisen konstitutiivisesta eksonista kontrollina. Kaikki nämä eksonit olivat intronien reunustamia sisäisiä eksoneja molemmissa päissä. Suoritimme Ka / Ks – suhdetestit näillä eksoneilla (Nekrutenko et al., 2003a) (KS.menetelmiä koskeva jakso). Konstitutiivisista eksoneista 9.8% ei läpäissyt Ka / Ks-suhdetestiä, joka on samanlainen kuin alkuperäisessä tutkimuksessa (8%) (Nekrutenko et al., 2002) (Taulukko 1). Sen sijaan 22, 3% testattavista vaihtoehtoisesti yhdistetyistä eksoneista ei läpäissyt ka/Ks-suhdetestiä, mikä on yli 2-kertainen verrattuna konstitutiivisiin eksoneihin. Koska vaihtoehtoisesti yhdistettiin eksoneita, joilla on eri eksonien sisällyttämistasot (KS. määritelmät Methods-osiossa), esiintyi erilaisia evoluutioerojen malleja (Modrek and Lee, 2003; Pan et al., 2004, jaoimme 925: n vaihtoehtoisesti yhdistetyt eksonit kolmeen luokkaan niiden eksonien sisällyttämistasojen perusteella (KS.menetelmät-osio). Kokeen reputtaneiden eksonien osuus oli 16, 0% duurimuotoisilla eksoneilla ja nousi 85, 7%: iin toissijaisilla vaihtoehtoisilla eksoneilla (mukaan lukien <1 / 3 transkripteissä). Koska vaihtoehtoisesti yhdistetyt eksonit olivat keskimäärin lyhyempiä, jaoimme eksonit myös niiden koon perusteella (Kuva. 1). Sekä konstitutiivisissa että vaihtoehtoisesti yhdistetyissä eksoneissa testin epäonnistuneet Murtoluvut olivat suurempia lyhyemmille eksoneille, jotka ovat yhdenmukaisia alkuperäisen tutkimuksen Nekrutenko et al., 2002. Fraktio oli kuitenkin johdonmukaisesti suurempi vaihtoehtoisesti yhdistetyissä eksoneissa sen jälkeen, kun eksonikoot oli kontrolloitu (esim.5, 4% konstitutiivisilla eksoneilla ja 16, 6% vaihtoehtoisesti yhdistetyillä eksoneilla välillä 101-150 nt; Fig. 1). Hiiren ja ihmisen välisessä vertailussa vaihtoehtoisesti yhdistettyjen eksonien analyysit tuottivat samanlaisia tuloksia (tietoja ei näy).

tuloksemme osoittaa, että merkittävästi suurempi osa vaihtoehtoisesti splikoituneista eksoneista ihmisen genomissa ei läpäise ka / Ks-suhdetestiä. Tämä ei kuitenkaan heti johda ka/Ks-suhdetestin lisääntyneeseen väärien negatiivisten tulosten määrään vaihtoehtoisesti yhdistetyissä eksoneissa, koska muut tulkinnat ovat mahdollisia. Merkitsevätkö nämä tiedot itse asiassa sitä, että huomattava määrä ihmisen est-sekvensseissä havaittuja vaihtoehtoisesti yhdistettyjä eksoneja ei edusta todellisia eksoneja, vaan ne todellakin tulevat est-aineistossa esiintyvistä artefakteista (esim. harvinaiset spliceosomaaliset virheet) (Modrek and Lee, 2002; Sorek and Safer, 2003)? Tämä selitys vaikuttaa erityisen uskottavalta mollimuotoisille eksoneille (jotka havaitaan pienessä murto-osassa EST-sekvenssejä). Testataksemme tätä mahdollisuutta, analysoimme osajoukon vaihtoehtoisesti yhdistetyistä eksoneista, joita täydet mRNA-sekvenssit tukivat. Havaitsimme samanlaisia osalukuja vaihtoehtoisesti yhdistetyistä eksoneista, jotka eivät läpäisseet ka / Ks-suhdetestiä (Taulukko 2). Siksi est-artefakteista peräisin olevat väärennetyt eksonit eivät voi selittää tietojamme. Edustavatko ka/Ks-suhdetestin epäonnistuneet vaihtoehtoisesti toisiinsa liitetyt eksonit suurelta osin ei-toiminnallisia liitosmuotoja? Vastataksemme tähän kysymykseen rajoitimme analyysimme 120 eksonin joukkoon, jotka vaihtoehtoisesti yhdistettiin sekä ihmisen että hiiren transkriptomeihin. Tällainen ”esivanhempien vaihtoehtoisten liitosten” malli hyväksyttiin laajalti toiminnallisten vaihtoehtoisten liitostapahtumien kriteerinä (Resch et al., 2004; Sorek et al., 2004a). Näissä eksoneissa vielä suurempi 49, 2% (verrattuna 22, 3%: iin kaikista vaihtoehtoisesti yhdistetyistä eksoneista) ei läpäissyt ka/Ks-suhdetestiä (Taulukko 1), Mikä on yhdenmukainen toisen äskettäisen tällaisia eksoneja koskeneen tutkimuksen kanssa (Ohler et al., 2005). Siksi hypoteesi ei-funktionaalisista liitosmuodoista ei voi selittää myöskään meidän tietoamme. Lopuksi, jotta CpG-saarten mahdollinen vaikutus voitaisiin sulkea pois, laskimme CPC: n frekvenssin GpC: hen nähden kussakin eksonissa, ja rajoitimme analyysimme vaihtoehtoisesti yhdistettyihin eksoneihin, joiden CpG/GpC-suhdeluvut olivat <0,8 (Iida and Akashi, 2000). Näistä eksoneista 20, 8% ei läpäissyt tätä testiä, mikä vastaa vaihtoehtoisesti yhdistettyjen eksonien kokonaisjoukon prosenttiosuutta (Taulukko 1). Vaikka periaatteessa lisääntynyt ka / Ks-suhde saattaa heijastaa erilaisia taustalla olevia mekanismeja, mikä ei ole tämän käsikirjoituksen painopiste, kontrollianalyysimme osoittavat, että suuri osa ihmisen genomin toiminnallisista vaihtoehtoisista eksoneista ei läpäise ka/Ks-suhdetestiä.

Konstitutiivisia eksoneita on enemmän kuin useimmissa proteiinia koodaavissa geeneissä. Koska monilla eliöillä transkriptiosekvenssin kattavuus (esim.ESTs) on vielä melko alhainen, ka/Ks-suhdetesti on tehokas työkalu laskennallisten geenirakenneennusteiden hiomiseen. Suurin osa nisäkäsproteiinia koodaavista geeneistä on kuitenkin vaihtoehtoisesti risteytetty, ja pienellä määrällä vaihtoehtoisesti risteytettyjä eksoneita saattaa olla syvällisiä toiminnallisia ja sääteleviä vaikutuksia, kuten äskettäin havainnollistettiin Piccolon C2A-domeenin vaihtoehtoisella risteytyksellä (Garcia et al., 2004) ja monet muut. Analyysimme viittaa siihen, että eliöissä, joilla on laaja vaihtoehtoinen liitos (esim.nisäkkäät), on suositeltavaa yhdistää Ka/Ks-suhdetesti muihin mittareihin, jotka osoittavat vaihtoehtoisen liitoksen todennäköisyyden. Onneksi evolutiivinen genomiikka on myös valottanut tyypillisiä piirteitä funktionaalisten vaihtoehtoisesti yhdistettyjen eksonien, joita on onnistuneesti käytetty ennusteissa (Philipps et al., 2004; Sorek et al., 2004B; Yeo et al., 2005). Tällaiset tiedot voidaan integroida Ka / Ks-suhdetestiin genomialueiden proteiinikoodausmahdollisuuksien tarkempaan arviointiin.

kirjoittajat kiittävät Anton Nekrutenkoa käsikirjoituksemme lukemisesta ja avuliaista kommenteista. Tätä työtä tuki nih Grant U54-RR021813, opettaja-tutkija palkinto C. J. L. Dreyfus-säätiöltä DOE grant DE-FC02-02ER63421. Y. X. tukee Ph. D. väitöskirja fellowship UCLA.

eturistiriidat: Ei ilmoitettu.