DBE-tekniikalla keräsimme järjestelmällisesti koepaloja ihmisen koko suolistosta ja kartoitimme enteroendokriini K-ja L-solujen jakautumista ja niiden hormonivalmisteiden ilmentymistä terveillä ja tyypin 2 diabetesta sairastavilla henkilöillä.
koska tyypin 2 diabetekseen liittyy ylipaino/lihavuus ja häiriintynyt glukoositasapaino, joka saattaa korreloida enteroendokriinisten K-ja L-solujen muutoksiin, tutkimus suunniteltiin kuvaamaan näiden solujen jakaantumistapaa ja joidenkin niistä saatavien tuotteiden ilmentymistä kahdessa prospektiivisesti rekrytoidussa, samankokoisessa, hyvin määritellyssä ja vastaavissa vapaaehtoisryhmissä, joilla ei ollut tunnettuja ruoansulatuskanavan häiriöitä. DBE: n avulla oli mahdollista saada suuri määrä näytteitä koko suolistosta: yhdeksältä anatomisesti spesifiseltä alueelta (Fig. 1) ja 7-22 ”asemaa” jejunumin ja ileumin varrella. Anatomisesti tarkkaan määritellyiltä alueilta otetut koepalat olivat hyvin vertailukelpoisia. Suurempi epävarmuus on olemassa biopsia paikoissa jejunum ja proksimaalinen ileum (biopsia paikoissa 3-9, Kuva. 1) intubaation pituuden ja siten yksilöiden välillä otettujen näytteiden määrän vaihtelun vuoksi. Tämän ongelman ratkaisemiseksi jaoimme jejunumin ja ileumin järjestelmällisesti seitsemään alueeseen (KS.menetelmät). Anterogradisen enteroskopian aikana maksimisyvyyteen asetettu mustemerkki havaittiin retrogradisen enteroskopian aikana neljällä 24: stä yksilöstä, mikä osoittaa täydellistä enteroskopiaa (Kuva. 2). Oletetaan, että suurin osa suoliston tutkittiin loput osallistujat arvioituna pituus intubaation saavutettu (lisätietoja, Katso metodologia paperi ).
käytimme immunohistokemiaa ja solumäärää enteroendokriinisten solujen ja prohormonia käsittelevien entsyymien kvantifiointiin ja qPCR mRNA-ekspressioanalyysiä hormonaalisten/entsymaattisten tuotteiden arviointiin. Molemmat menetelmät ovat vakiintuneita, mutta aiheuttavat myös rajoituksia. Immunohistokemiassa käytettävien vasta-aineiden suuri spesifisyys on erittäin tärkeää, jotta varmistetaan vähintään epäspesifinen värjäys (väärät positiiviset). Niinpä valitsimme vasta-aineita, jotka ovat vakiintuneita ja hyvin luonnehdittuja . Kolmiulotteisia objekteja (eli enteroendokriinisoluja) arvioidaan kaksiulotteisella kuvantamistekniikalla käyttäen immunohistokemiaa ja solumäärää viipaloitujen koepalojen mikrofotografeista. Optimaalisempi menetelmä solujakauman arvioimiseksi olisi stereologia, jossa todellinen tiheys (eli solut/mm3-kudos) arvioidaan . Tämä tekniikka vaatisi kuitenkin täydellisiä poikittaisia kudoslohkoja, jotka eivät sovi yhteen biopsiakohtien suuren määrän kanssa, ja siten tässä tutkimuksessa pyrittyä yksityiskohtaista kartoitusta elävien ihmisten suolistosta. Lisäksi olisi otettava huomioon seuraavat seikat. Ensinnäkin mRNA-ilmaisun arviointi osoittaa endokriinisten solujen aktiivisuuden, mutta ei mittaa tietyn solutuotteen kokonaistuotantoa, koska kaikkea mRNA: ta ei muuteta lopulliseksi aktiiviseksi tuotteeksi. Toiseksi lauseke on suhteellinen, koska erityiset mRNA-transkriptit liittyvät vakaasti ilmaistun geenin ilmentymiseen (KS.ESM-menetelmät tarkempia tietoja varten). Kun otetaan huomioon tyypin 2 diabeteksen biologinen heterogeenisuus, suurempia eroja olisi mahdollisesti voitu havaita suuremmalla otoskoolla ja potilailla, joilla oli laajempi glukoosihäiriö.
Sjölundin et al: n vuonna 1983 tekemä enteroendokriinisten solujen jakautumista koskeva työ on tähän mennessä yksityiskohtaisin ihmisen suolistossa tehty työ, jossa on käytetty IHS: ää, jossa on laaja valikoima antiseerumeita (25 tyyppiä) tunnettuja tai ehdotettuja suolen neurohormonaalisia peptidejä vastaan . Minimaalisesti invasiivisia tekniikoita ei tuolloin ollut saatavilla. Näin ollen näytteitä otettiin vain seitsemältä alueelta: proksimaalisesta ja distaalisesta pohjukaissuolesta, jejunumin keskiosasta, distaalisesta sykkyräsuolesta, nousevasta paksusuolesta, poikittaisen paksusuolen distaalisesta osasta tai sigmoidisesta paksusuolesta ja peräsuolesta. Kudosaineistoa saatiin jokaiselta alueelta 9-17 yksilöltä. Näytteet otettiin joko vatsaleikkauksessa (joka tehtiin ensisijaisesti maligniteetin vuoksi) tai enteroskooppisissa tutkimuksissa, joihin sisältyi koepaloja henkilöille, joilla oli ”muita ruoansulatuskanavan häiriöitä”, mukaan lukien erilaisia määrittelemättömiä oireita ja sairauksia (esim. ”piilevä verenvuoto” ja ”maksasairaus”). Vuonna 1985 Adrian et al käyttivät radioimmunoanalyysimenetelmää määrittääkseen PYY: n määrän mahalaukun silmänpohjassa ja antrumissa, pohjukaissuolessa, jejunumissa, sykkyräsuolessa, nousevassa paksusuolessa, sigmoidisessa paksusuolessa ja peräsuolessa . Näytteet kustakin paikasta saatiin 5-8 ihmiseltä, joille tehtiin karsinooman tai mahahaavan vuoksi leikkaus. Eissele et al raportoi vuonna 1992 tutkimuksesta, jossa tutkittiin enteroendocrine L-solujen jakautumista ihmisillä . Näytteet otettiin seitsemältä alueelta: pohjukaissuolesta, proksimaalisesta ja distaalisesta jejunumista, sykkyräsuolesta, nousevasta paksusuolesta, poikittaisesta paksusuolesta ja peräsuolesta. Näytteet saatiin vain viideltä osallistujalta, joille tehtiin karsinooman tai Crohnin taudin vuoksi leikkaus. Vuonna 2005 Guedes et al tutki GIP-, GLP-1 – ja CgA-positiivisten solujen jakautumista IHS: llä ohutsuolen 20 cm: n välein otetuissa näytteissä 30 ihmisen ruumiissa .
on korostettava, että edellä mainituissa neljässä tutkimuksessa tutkittiin normaalilta näyttäviä kudosnäytteitä, joissa ei ollut merkkejä patologisista muutoksista. Pahanlaatuiset tai tulehdukselliset muutokset suoliston alueella tai solujen hajoamisen nopea alkaminen kuoleman jälkeen ovat kuitenkin voineet vaikuttaa yleiseen enteroendokriiniseen solujen jakautumiseen ja toimintaan. Lisäksi osallistujien heterogeenisyys on saattanut vaikuttaa tuloksiin.
yhtäpitävästi tuloksiemme kanssa Sjölund et al, Eissele et al, Adrian et al ja Guedes et al kuvasivat L-solutuotteiden (GLP-1 ja/tai PYY) vaihtelua suolen sijainnin mukaan siten, että distaalisen jejunumin ja ileumin tiheys/määrä on suurempi kuin pohjukaissuolen ja proksimaalisen jejunumin, ja lisääntynyt tiheys/määrä proksimaalisesta distaaliseen paksusuoleen ja suurimmat pitoisuudet peräsuolessa . Tuloksemme tukevat tätä l-solujen jakautumista terveillä henkilöillä ja tyypin 2 diabeteksessa, jolloin GCG-ja PYY-geeniekspressio lisääntyy sekä GLP-1-ja PYY-positiivisten solujen tiheys kasvaa ohutsuolessa ja paksusuolessa. Havaitsimme myös suurimman signaalin l – solujen markkereista (PYY-ja GLP-1-positiiviset solut ja PYY mRNA-ilmentymä) peräsuolessa, GCG: n ilmentymistä lukuun ottamatta. Havaittujen ryhmien välisten erojen (tyypin 2 diabetesta sairastavien osallistujien paksusuolen GCG—ja PYY—ilmentymien merkitsevästi suuremmat kuin terveillä henkilöillä) vaikutuksia-jos lainkaan-ei tällä hetkellä tunneta. On hyvin osoitettu, että inkretiinin vaikutus vähenee tyypin 2 diabeteksessa, ja on ehdotettu, että ravinteiden aiheuttama vika GLP-1: n erityksessä voi osaltaan selittää tätä ilmiötä. Tutkimukset, joissa tutkittiin GLP-1-vasteita ravintoaineärsykkeisiin tyypin 2 diabetesta sairastavilla ja ei-diabeetikoilla, ovat kuitenkin osoittaneet, että tyypin 2 diabetesta sairastavilla henkilöillä GLP-1: n kokonaisvaste plasmassa ei yleensä ole alentunut .
havaitsimme poikkeaman GCG: n ilmentymistasojen ja GLP-1-positiivisten solujen tiheyden välillä suolistossa. Tämä korostaa, että ohutsuolen yhdessä osassa olevat l-solut voivat käyttäytyä eri tavalla kuin ohutsuolen toisessa osassa olevat enteroendokriiniset l-solut, kuten Svendsen ym .ehdottivat, sillä he havaitsivat, että rotilla l-solujen eritysmalli muuttuu ruoansulatuskanavassa, eli L-solut erittävät PYY: n ja GLP-1: n eri suhteita, joista osa erittää vain GLP-1: tä. Näiden havaintojen mukaisesti on todennäköistä, että distaalisesti sijaitsevat l-solut ilmentävät proglukagonia suuremmassa määrin kuin proksimaalisesti sijaitsevat l-solut.
havaintomme GIP-positiivisten solujen suuremmasta ilmentymisestä ja tiheydestä ohutsuolen proksimaalisessa osassa, sekä vähenemässä distaalisesti ileosekaalialueelle terveillä henkilöillä että tyypin 2 diabetesta sairastavilla, ovat linjassa aiempien löydösten kanssa . Toisin kuin Sjölund et al , jotka havaitsivat GIP-positiivisten solujen puuttuvan paksusuolesta, pystyimme havaitsemaan pieniä määriä GIP-positiivisia soluja suolen distaalisessa osassa. Emme kuitenkaan voi sulkea pois sitä, että tämä johtuu epäspesifisestä vasta-aineiden sitoutumisesta. Huomasimme kuitenkin mRNA: n ilmaisevan GIP: tä molempien ryhmien paksusuolessa, joskin hyvin alhaisella tasolla. GIP: n ilmentyminen oli merkitsevästi suurempaa tyypin 2 diabetesta sairastavilla henkilöillä koko suoliston alueella. Voidaan spekuloida, että GIP: n transkriptio lisääntyy kompensoivana seurauksena GIP: n resistenssistä eli GIP: n heikentyneestä insulinotrooppisesta vaikutuksesta tyypin 2 diabetesta sairastavilla henkilöillä . Lisäksi on ehdotettu, että GIP edistää tyypin 2 diabeteksessa esiintyvää hyperglykemiaa (joka johtuu pääasiassa GIP: n glukagonotrooppisesta vaikutuksesta) . Tiedot suun kautta otetun glukoosin tai sekaruokailun jälkeisistä GIP-vasteista tyypin 2 diabetesta sairastavilla henkilöillä ovat kuitenkin olleet epäjohdonmukaisia, ja meta-analyysiin perustuva systemaattinen katsaus on osoittanut, että aterianjälkeiset GIP-vasteet ovat samanlaisia tyypin 2 diabetesta sairastavilla ja terveillä henkilöillä .
koska hapan glykoproteiini CgA on solurakkuloiden komponentti ja sillä katsotaan olevan useita rooleja endokriinisten tuotteiden eritysprosessissa, sitä käytetään enteroendokriinisten solujen yleismarkkerina . Toisin kuin Guedes et al, jotka havaitsivat CGA-positiivisten solujen jatkuvan tiheyden ohutsuolessa, tutkimuksemme osoitti merkittävää vähenemistä. Lisäksi havaitsimme CGA-positiivisten solujen tiheyden terveillä henkilöillä ohutsuolessa enemmän kuin tyypin 2 diabetesta sairastavilla osallistujilla. Voidaan spekuloida, että CGA-positiivisten solujen (enteroendokriinisten solujen) kokonaismäärä muuttuu tyypin 2 diabeteksessa—joko tyypin 2 diabeteksen seurauksena tai ehkä siten, että se edistää tyypin 2 diabeteksen patogeneesiä. Havaitsimme melko suuria määriä CGA-positiivisia soluja molempien ryhmien peräsuolessa. Äskettäin Engelstoft et al osoitti hiirillä , että CgA oli pääasiassa lokalisoitu monoamiinia erittäviin enteroendokriinisoluihin ja niukemmin peptidejä erittäviin enteroendokriinisoluihin, mikä ehkä tuki Sjölundin et al: n ehdotusta, että peräsuolen enteroendokriinisoluilla voisi olla ensisijaisesti paikallinen (parakriini) funktio systeemisen funktion sijaan .
koska PC1/3: n tiedetään prosessoivan prohormoneja, jotka johtavat GIP: n ja GLP-1: n muodostumiseen, odotimme PC1 / 3: n esiintyvän koko suolistossa. Havaitsimme vastaavasti poikkeaman, johon liittyi pcsk1/3: n suurempi ilmentyminen ja PC1/3-positiivisten solujen pienempi tiheys tyypin 2 diabetesta sairastavien osallistujien ohutsuolessa verrattuna terveisiin osallistujiin. Kuten edellä on esitetty, tätä havaintoa on tulkittava siten, että jotkin enteroendokriiniset solut voivat olla hyvin aktiivisia joillakin alueilla ja niiden aktiivisuus on vähäistä muilla alueilla.
koska PC2 tunnetaan ensisijaisesti proglukagonin prosessoinnista glukagoniksi haiman alfasoluissa, oli mielenkiintoista löytää pcsk2-ja PC2-positiivisten solujen mRNA-ilmentymä koko suolistosta. Tämä voi viitata siihen, että glukagonia tuotetaan suolistossa, kuten Lund ym .äskettäin ehdottivat. Tämän mukaisesti voidaan spekuloida, että PCSK2: n suurempi ilmentyminen tyypin 2 diabetesta sairastavien henkilöiden ohutsuolessa johtaa ylimääräisen glukagonin muodostumiseen, mikä osaltaan aiheuttaa tyypin 2 diabeettista hyperglukagonemiaa. Tämän seikan selventämiseksi tutkimukset, joihin sisältyy immunohistokemiallinen kaksoisvärjäys, ovat perusteltuja.
yhteenvetona voidaan todeta, että nykyinen enteroendokriinisten K-ja L-solujen jakautumisen kartoitus ja niihin liittyvien valmisteiden ilmentymistasojen havaitut vaihtelut ihmisen suolistossa sekä osoitetut erot tyypin 2 diabetesta sairastavien osallistujien ja terveiden yksilöiden välillä tarjoavat hakuteoksen tutkijoille ja kliinikoille. Yhdessä suolistohormonien fysiologisista tutkimuksista saatujen tietojen kanssa tiedoistamme voisi olla hyötyä sen ymmärtämisessä, miten suolisto vaikuttaa glukoosiaineenvaihdunnan ja ruokahalun säätelyyn. PC2: n tunnistaminen enteroendokriinisoluista on mielenkiintoista, koska tämä saattaa olla yhdenmukaista glukagonin muodostumisen kanssa ihmisen suolistossa. Lisätutkimuksia kuitenkin tarvitaan tämän mahdollisuuden todistamiseksi ja löydöstemme liittämiseksi tyypin 2 diabeteksen patofysiologiaan.
