kokonais-RNA uutettiin Tripure-Eristysreagenssilla (Roche).
RNA-näytteitä käsiteltiin Rnaasivapaalla DNaseI-valmisteella ja puhdistettiin RNEASY Mini Kit-valmisteella (QIAGEN). Tuloksena saatu RNA-arvo hupeni ribosomaalisesta RNA: sta Ribo-Zero rRNA-Poistopaketin (ihminen/hiiri/rotta) (Epicentre) avulla. RRNA-köyhdytettyä RNA: ta käytettiin ensimmäisen juosteen cDNA: n syntetisoimiseen SuperScript® III-Alkujuostesynteesijärjestelmän (Invitrogen) avulla valmistajan ohjeiden mukaan. Tämän jälkeen toinen juoste syntyi käyttämällä E. colin DNA-ligaasia (Invitrogen), E. coli-DNA-polymeraasi (Invitrogen) ja dutp -, dctp -, dATP-ja Dgtp-sarja (10 µmol kummassakin, Promega) toisessa Lohkopuskurissa (Invitrogen). Sitten cDNA kerittiin Covaris noin 300bp. Sirpaloitumisen jälkeen näytteet puhdistettiin Miinapylväillä (Qiagen). Fragmenttien ulkonevat 3′ ja 5 ’ päät korjattiin T4 DNA-polymeraasin (NEB) ja T4 DNA-Polynukleotidikinaasin (NEB) avulla T4 DNA-ligaasipuskurissa (NEB). Seuraavaksi dA-päät saatiin aikaan käyttämällä Klenow-fragmenttia (3′ ->5’ exo -, NEB) puskurissa 2 (NEB). Adapterin ligaatioreaktiot määritettiin sitten indeksoitujen adapterien ja nopean Ligaasin (Neb) avulla. Tuotteita käytettiin mallina UNG (Fermentas)-käsittelylle ja PCR-monistukselle, jossa käytettiin Phuusio-Hifi-DNA-polymeraasia (Neb). Kirjastot visualisoitiin 2% e-Gel® – Yleiskäyttöisillä Agaroosigeeleillä (Invitrogen). Viivakoodatut kirjastot sekvensoitiin yhdelle kaistalle HiSeq2500 (Illumina).
