High Fidelity & Efficient PCR Enzyme: kod DNA polymerase
the hypertermophilic archaea Thermococcus kodakaraensis KOD1 (aiemmin Pyrococcus kodakaraensis KOD1) (Kuva. 1)eristettiin solfataarisesta kuumasta lähteestä (Kuva. 2)Kodakaran saarella (Kuva. 3) Japanissa, ja tunnistettiin ja luonnehdittiin.
tästä KOD1-kannasta löydettiin perheen B DNA-polymeraasi (KOD-DNA-polymeraasi), jolla on useita ainutlaatuisia ominaisuuksia (1).
-
Kuva. 1. Thermococcus kodakaraensis KOD1
-
Kuva. 2. Solfatara (Kodakaran saari, Japani)
-
Kuva. 3. Kodakaran saari (Kagoshiman prefektuuri, Japani)
KOD-DNA-polymeraasilla on vahva 3’→5 ’ eksonukleaasiaktiivisuus (oikolukutoiminto), jota Taq-DNA-polymeraasilla ei ole.
lisäksi tällä entsyymillä on erinomainen processivity-ja venymäkyky, sillä sen laajenemisnopeus on viisi kertaa suurempi (100-130 nukleotidia sekunnissa) ja 10-15 kertaa suurempi (>300 emästä) kuin Pyrococcus furiosuksella (PFU-DNA-polymeraasi). Tämän entsyymin venymänopeus on noin 2 kertaa suurempi kuin Taq-DNA-polymeraasin (Taulukko 1)(kuva. 4) (1).
Taulukko 1. Termostabiilien DNA-polymeraasien ominaisuudet
| Proterty | indisoidun DNA-polymeraasin arvo | ||
|---|---|---|---|
| KOD-DNA-polymeraasi | Pfu-DNA-polymeraasi | Taq-DNA-polymeraasi | |
| alkuperä | Archaea | Archaea | bakteerit |
| päätelty molekyylimassa (kDa) | 90.0 | 90.1 | 93.9 |
| optimaalinen lämpötila (ºC) | 75 | 75 | 75 |
| optimaalinen pH 75ºc: ssa | 6.5 | 6.5 | 8.0-8.5 |
| Termostaattisuus (puoliintumisaika) | 95ºC,12 h; 100oC,3, 0 h | 95ºC, 6 h; 100ºc, 2, 9 h | 95ºC, 1.6h |
| 5’→3′ exonuclease activity | – | – | – |
| 3’→5′ exonuclease activity | + | + | – |
| Terminal transferase activity | – | – | – |
| Processivity (bases) | >300 | <20 | ND |
| Elongation rate (bases/s) | 106-138 | 25 | 61 |
Fig. 4. Kod Pfu: n ja Taq DNA-polymeraasin venymisnopeuksien vertailu.
venymänopeus mitattiin synteettisen DNA: n pituuden mukaan käyttäen mallina M13 ssDNA: ta 75ºc: ssa.
samanaikaisesti KOD-DNA-polymeraasin toiminnan tutkimisen kanssa kehitettiin polymeraasin neutralisaatiovasta-aineita ja oikolukutoimintoja (2). Näitä vasta-aineita voidaan soveltaa ”hot start PCR-teknologiaan” kod-DNA-polymeraasin avulla.
DNA-polymeraasin 3-D-rakenne luonnehdittiin vuonna 2003 (Kuva. 5) (3).
Kuva. 5. KOD-DNA-polymeraasin 3-D-rakenne
J. Mol. Biol., 306: 469-477 (2001)
KOD-Plus – (koodi nro. KOD-201) on kehitetty KOD-DNA-polymeraasin pohjalta ja sillä on korkea PCR-uskollisuus (Table2).
Taulukko 2. Kunkin PCR-entsyymin mutaatiotaajuuden vertailu.
| emästen kokonaismäärä sekvensoitu | mutatoituneiden emästen lukumäärä | Mutaatiotaajuus (x10-5) | |
|---|---|---|---|
| KOD-Plus- | 145,753 | 5 | 3.4 |
| KOD FX | 144,535 | 19 | 13.1 |
| Pfu-DNA-polymeraasi | 113,080 | 12 | 10.6 |
| Taq-emäs pitkä-PCR-entsyymi | 167,343 | 218 | 130.3 |
| Taq-DNA-polymeraasi | 102,708 | 145 | 141.2 |
uskollisuus mitattiin mutaatiotaajuutena sekvensoimalla PCR-tuote. PCR-tuotteen kloonauksen (2,4 kb ihmisen beta-globin-alueelta) jälkeen valittiin ja sekvensoitiin noin 96 kloonia.
KOD FX (koodi nro. KFX-101) kehitettiin perustuu KOD DNA polymeraasi ja osoittaa paljon suurempi PCR onnistumisnopeus (perustuu tehokkuuteen ja venymä ominaisuuksia) kuin KOD-Plus- (koodi nro. KOD-201) tai muita Taq-pohjaisia PCR-entsyymejä. KOD FX on myös tehokas monistukseen raakanäytteistä (esim.hiirenhännän lysaatti, viljellyt solut).
Kuva. 6. Suora vahvistus raa ’ asta hiirenhännän lysaatista
1,2: KOD FX
3~6: muun yhtiön entsyymit
M: markkerit
