C. polyakryyliamidi sulautettuna Fluoresoiviin helmiin
kuten edellisessä jaksossa on kuvattu, piipohjat osoittautuivat hyödyllisiksi nopeasti liikkuvien keratosyyttien voimien mittaamisessa. Nämä samat substraatit ovat kuitenkin paljon vähemmän hyödyllisiä useimpien nisäkkäiden solujen tutkimisessa. Jotta traktiot voidaan laskea tarkasti, substraatti on viritettävä vastaamaan tietyn solutyypin liikkuvuutta ja voimantuotantoa. On vaikea tuottaa tarkasti piisubstraattia, joka on halutun mukainen hitaammin liikkuville soluille, jotka kykenevät kohdistamaan suurempia voimia. Tämän rajoituksen poistamiseksi Dembo ja Wang (1999) käyttivät polyakryyliamidin substraattia, joka oli upotettu submikrometrin kokoisiin fluoresoiviin helmiin. Polyakryyliamidisubstraattien vaatimustenmukaisuus voidaan virittää kemiallisesti vaihtelemalla monomeeri-ja crosslinkeripitoisuuksia (Pelham and Wang, 1997). Polyakryyliamidilla on useita lisäetuja piisubstraatteihin verrattuna. Se esiintyy lineaarisesti kimmoisana monenlaisissa muodonmuutoksissa. Polyakryyliamidi ei myöskään ole tyypillisesti sovitettavissa solujen sitoutumiseen yksinään ilman spesifisten solujen adheesioligandien konjugaatiota (Nelson et al., 2003). Siksi se on täydellinen tukiranka solujen tarttumisen ja käyttäytymisen tutkimiseen hallittavalla, määritellyllä tavalla.
laskennallinen menetelmä, jolla substraatin muodonmuutoksia käytetään solun traktioiden määrittämiseen, on hyvin samankaltainen kuin edellä mainituilla stressaantuneilla piisubstraateilla käytetyt menetelmät. Loisteputkimerkkien käyttö on kuitenkin parantanut huomattavasti seurantamenetelmää ja kykyä laskea tarkka kanta-ala.
Dembo ja Wang julkaisivat useita tutkimuksia käyttäen tuloksena saatua tekniikkaa, vetovoimamikroskopiaa, joka valottaa fibroblastien migraation mekanismeja. Erityisesti ne ovat osoittaneet, että solun lamellipodia antaa lähes kaiken eteenpäin liikkumiseen tarvittavan voiman (Munevar et al., 2001a). Niiden tulokset osoittavat, että lamellipodium on muusta solurungosta erillinen mekaaninen kokonaisuus. On kiinnostavaa, että tätä samaa mekaanista jakoa solun sisällä ei näytä olevan H-ras-muuntuneissa soluissa, mikä ehkä selittää eron niiden liikkuvassa käyttäytymisessä. Lisäksi Beningo et al. (2001) tutki fokusliimojen roolia vedon tuottamisen säätelyssä ja havaitsi, että fokusliimojen koko on kääntäen suhteessa tuotetun voiman määrään. Lisäksi kiinnikkeiden jakautuminen ei vastaa hyvin vetovoimien jakautumista. Kirjoittajat päättelevät, että nämä tulokset voivat viitata siihen, että varhaiset fokaalikompleksit ovat vastuussa voimakkaista työntövoimista, ja näiden adheesiokohtien kypsyminen johtaa muutokseen passiivisiksi ankkurointipaikoiksi — tätä päätelmää on käsitelty laajalti kirjallisuudessa. Lisäksi Dembo ja työtoverit tutkivat dynaamisia rooleja, jotka edessä-vs.-takana kiinnikkeet (Munevar et al., 2001b), myosin IIb (Lo et al., 2004), fokaalinen adheesiokinaasi (Wang et al., 2001), ja stretch-activated Ca2+ kanavat pelata fibroblast migration (Munevar et al., 2004). Vetovoimamikroskopian avulla Dembo ja työtoverit ovat edistyneet merkittävästi ymmärtämään voiman muodostuksen roolia fibroblastien migraatiossa.
yksi merkittävimmistä polyakryyliamidigeelin teknisistä edistysaskeleista on kyky hallita luotettavasti solusubstraatin vaatimustenmukaisuutta ECM-tiheyttä muuttamatta. Substraatin vaatimustenmukaisuuden virittäminen oli kriittinen käännekohta vetovoimamikroskopian kehityksessä, sillä se mahdollisti lähes minkä tahansa solutyypin tutkimisen ja solun käyttäytymisen ymmärtämisen mekaanisen ympäristön funktiona. Ennen Pelhamin ja Wangin tutkimusta (1997) useimmat solujen migraatiota ja adheesiota tutkivat tutkimukset keskittyivät solun migraatioon sen liukoisen kemiallisen ympäristön (chemotaxis) tai substraattiin konjugoituneen ligandin (haptotaksis) vaikutuksesta. Lisäksi tutkimuksissa, joissa solun mekaaninen ympäristö keskittyi vasteeseen, joka johtui määrätyistä voimista, kuten nesteen leikkausjännityksestä ja mekaanisesta venymisestä. Kuitenkin muuttamalla jäykkyyttä Alustan, Pelham and Wang (1997) luotu merkittävä muutos tapa tutkijat lähestyvät solujen vastausta ja mekanotransduction. Käyttämällä polyakryyliamidisubstraattia Pelham ja Wang pitivät ECM-tiheyden substraatilla vakiona muuttaen mekaanista vaatimustenmukaisuutta. Ne osoittivat, että fibroblastit kykenevät aktiivisesti reagoimaan substraattinsa mekaaniseen myötäilyyn. Jäykempien geelien solut leviävät ja vaeltavat hitaammin kuin vaatimukset täyttävämpien geelien solut. Lisäksi solujen kyky aistia substraattinsa mekaanista vaatimustenmukaisuutta näkyy niiden kyvyssä muuttaa fokaalisen adheesiorakenteen sisältämien lukuisten proteiinien fosforylaatiotilaa. Jäykillä alustoilla olevat fokusliimat ovat suurempia, pitkulaisempia ja vakaampia, kun taas yhteensopivilla alustoilla olevat fokusliimat sisältävät vähemmän fosforyloituja pp125FAK-ja paxillin-yhdisteitä ja esiintyvät paljon epäsäännöllisemmin. Nämä tulokset olivat ensimmäiset, jotka viittasivat siihen, että mekaaniset ECM-vihjeet voivat olla aivan yhtä tärkeitä kuin kemialliset vihjeet solujen tarttumisen säätelyssä.
Pelhamin ja Wangin kirjoituksen (1997) jälkeen useat tutkimukset ovat selvittäneet compliance-ilmiön vaikutuksia solujen käyttäytymiseen. Lo et al. (2000) käytti polyakryyliamidikemiaa luodakseen substraatin, joka sisältää jäykkyysvaiheen — substraatin keskiosan, jossa kaksi eri kompositioiden substraattia kohtaavat. He osoittivat durotaxis-nimisen käyttäytymisen, jolla solut pystyivät aktiivisesti havaitsemaan ja reagoimaan substraatin vaatimustenmukaisuuden muutoksiin. Solut, jotka olivat siirtymässä pehmeällä alustalla, lyömällä rajan jäykkä-pehmeä siirtyminen, ylittäisi päälle jäykkä substraatti, kun taas solut jäykkä alustoilla näytteillä suurempi tractions ja enemmän levinnyt alue, ja joko vetäytyi tai muutti suuntaa vastauksena jäykkä–pehmeä raja. Myöhemmin, Wong ym. (2003) tutki fibroblastien kykyä siirtyä polyakryyliamidivetyihin, jotka sisältävät yhteensopivuuden gradientteja, eikä askelta, kuten Lo ja työtoverit tekivät. He havaitsivat, että verisuonten sileät lihassolut vaeltavat pehmeämmillä alustoilla nopeammin kuin jäykemmillä alustoilla (15 kPa vs 25 kPa) ja että solut kerääntyvät jäykemmille alustoille. Lisäksi gradienttiystävällisten geelien migraatiomalli näytti suuntautuvan jäykempiin geelialueisiin sen sijaan, että siinä esiintyisi tyypillinen solujen migraatiolle ominainen satunnainen kävelykuvio. Engler ym. (2004) tutki edelleen soluvastetta vaatimustenmukaisille geeleille ja osoitti, että vaste välittyy suurelta osin aktiinin sytoskeletonin kokoonpanon kautta. Testaamalla muutoksia sytoskeletonissa Engler ja työtoverit pystyivät osoittamaan, että vähäinen aktiinin yliekspressio solussa voi kompensoida pehmeissä geelivasteissa havaitun leviämisen häviämisen. Lisäksi Yeung et al. (2005) osoitti, että vaatimustenmukaisuuden tunnistamisen herkkyyskynnys on solutyyppikohtainen ja että solujen ja solujen väliset kontaktit voivat myös auttaa pelastamaan pehmeissä substraateissa havaitut morfologiset muutokset muistuttamaan paremmin jäykemmillä substraateilla olevien solujen morfologiaa (Yeung et al., 2005). Kaiken kaikkiaan durotaxiksen tutkimus on vielä suhteellisen nuori, ja paljon on vielä opittavaa siitä, miten solu aistii ja reagoi substraattinsa ja ympäristönsä materiaalisiin ominaisuuksiin mekaanisesti.
