2.3.4.1 rakenne
apo-sCTLA-4-homodimeeri ilmaistiin trombiinin pilkkoutuvana Fc-fuusioproteiinina CHO-soluissa kifunensiinin läsnä ollessa.23 deglysylaation jälkeen homodimeeri tuotti kiteitä diffraktoituen 1,8 Å: n Bragg-väleihin, joiden yksikkökennon mitat ovat a = 43.86 Å, b = 51.46 Å ja c = 102.85 Å, ja avaruusryhmä P212121 (viite. 130). Rakenne ratkaistiin molekyylikorvauksella. Epäsymmetrinen yksikkö koostui disulfidisidoksisesta homodimeeristä, joka mahdollisti vertailun sCTLA-4/SB7-1-ja sCTLA-4/SB7-2-komplekseihin ja sctla-4: ään sitoutuneena valmistettuun lipokaliiniin.131
epäsymmetrisen yksikön kaksi monomeeriä koostuivat β-sandwich-domeeneista, joilla oli AGFCC’ – ja ABED-topologia metzlerin et al: n odotusten mukaisesti.132 lyhyt kahdeksan jäännös” varsi ” disulfidi-sidottu cys122 linkitetty IgSF verkkotunnukset kalvon. Yllättäen apo-CTLA-4-homodimeerin kaksi puoliskoa eivät muistuttaneet toisiaan yhtä paljon kuin kompleksoituneita vastineitaan, korostaen, että sitoutumiseen ei liity laajamittaisia rakenteellisia uudelleenjärjestelyjä (Fig. 2, 2 tuntia). Automatisoidut rakennevertailut tunnistivat CD28: n ja PD-1: n rakenteiksi, jotka muistuttavat eniten CTLA-4: ää. Merkittäviä eroja ctla-4: n ja CD28: n välillä olivat: (i) cd28: n β-juosteessa G on kinkki, (ii) silmukkakokojen muutokset, mukaan lukien laajennetut AB -, BC-ja CC’-silmukat CTLA-4: ssä ja typistetty C”D-silmukka, ja (iii) C’ – ja C” β-säikeiden h-sidos, joka johtuu C ’C” – silmukan uudelleensijoittamisesta CD28: ssa. Keskeinen merkitys oli pitkälti identtinen konformaatio FG silmukka 99MYPPPY104 sekvenssi muodostavat ytimen niiden ligandeja sitova pinnat. Apo-CTLA-4: n epätavallisen kuivalla ligandeja sitovalla pinnalla havaittiin vain yksi vesimolekyyli, kun muualla havaittiin 228 vettä.
CD28: n ja PD-1: n jälkeen seuraavaksi eniten samanlaisia rakenteita CTLA-4 V-set-domeenin kanssa oli 215 vasta-ainetta tai TCR V-domeenia, jotka erosivat toisistaan lähinnä vain silmukoiden pituuksissa. R. m.S.-ero ctla-4: n superpositiolle, jossa on eniten samanlaisia TCR Va-domaineja, oli 2.09 Å 102: lle jäämälle, vastakohtana 2.89 Å: lle 86: lle jäämälle CD2: n superpositiolle D1: lle. Tärkeitä jaettuja ominaisuuksia Va-verkkotunnuksen kanssa olivat pitkä CC-silmukka ja säilöttyjä β-pullistumia C-ja G-säikeissä, jotka asettivat voimakkaan kierteen AGFCC: n β-arkille. Erityisen huomionarvoista oli sekvenssin suuri säilyvyys ja Ca-konformaatio lähellä G-lohkon β-pullistumaa, eli GNGTQIYV (CTLA-4) ja GDGTQLVV (Va). CD2: ssa ja CTLA-4: ssä silmukat olivat samanlaisia, ja verkkotunnukset erosivat sikäli kuin: (I) CD2: ssa ei ollut ßA-ja ßB-säikeiden h-sidosta, (ii) CD2: ssa ei ollut β-pullistumien uudelleensijoituksesta johtuvaa a” gfcc”-levyn kiertymistä, (iii) CD2: ssa olevan C ”β-juosteen sijainti, mutta ei ctla-4: ssä sallittu kanoninen H-sidos ja agfcc’ C ” β-levyn laajennus, ja (iv) CTLA-4: ssä ei ollut CD2: ssa esiintyvää FG-silmukan kiertymistä (ja myös esim.B7-1). Viidenkymmenenkahden V-set IgSF-domeenin analyysi käyttäen sekventiaalista rakenteen linjausohjelmaa133 osoitti, että CD28/CTLA-4-perhe käsittää aliryhmän V-set-domeeneja, jotka eroavat CD8 -, antigeenireseptori-ja ”adheesiomolekyyliryhmistä”, esimerkiksi B7-1 ja CD2. Kaiken kaikkiaan CD28/CTLA-4-alaryhmä muistutti antigeenireseptoriperhettä enemmän kuin adheesiojoukko. Analyysin mukaan CD28 / CTLA-4-perheen proteiineilla ja antigeenireseptoreilla oli yhteinen esi-isä, joka oli mahdollisesti samanlainen kuin PD-1, Ja nämä kaksi perhettä erosivat toisistaan jo varhain.
Apo-CTLA-4 koostui homodimeeristä, jonka alayksiköt hyväksyivät järjestelyn, joka suosi ortogonaalisia bivalentteja vuorovaikutuksia apposoiville solupinnoille sijoitettujen ligandien kanssa. Vertailut Ctla-4-monomeeripareihin B7-1-ja B7-2-komplekseissa106,107 ja monomeeriin lipokaliinikompleksissa131 paljastivat hyvin rajallisen pyörimisjoustavuuden homodimeerin rajapinnassa ja huomattavan vähän, jos lainkaan, ligandin sitoutumisesta johtuvia muutoksia. Ainoat erot olivat havaittavissa B7-2-kompleksissa, jossa BC-ja CC-silmukoiden, sekä C” β-juosteen ja viereisten silmukoiden, ja konformaatioeroja G β-juosteessa sen C-päätepisteessä. Nämä paikalliset vaihtelut olivat kaukana ctla-4: n ligandisitoutumiskohdasta, eivätkä apo-monomeerit missään tapauksessa poikenneet systemaattisesti kaikista viidestä kompleksoituneesta CTLA-4-monomeerista. 99mypppy104-sekvenssin pääketjun atomiasennot olivat pääosin identtiset.
CTLA-4: n B7-1: llä ja B7-2: lla muodostamien kompleksien rakenteet, joita ei ollut aiemmin verrattu, olivat aivan erilaiset.130 substituutio B7-2: ssa, val28 vs. Arg29 B7-1: ssä, muodosti B7-2: ssa sitovan taskun, jonka ctla-4 täytti vain osittain. Näin varmistettiin, että B7-1/CTLA-4-kompleksilla oli parempi muodon täydentävyys kuin B7-2 / CTLA-4-kompleksilla. Hieman tätä kompensoiden ctla-4: n hautaama pinta-ala B7-2: ssa oli jonkin verran suurempi kuin B7-1: ssä. Kaiken kaikkiaan B7-1 sitoutui CTLA-4: ään vielä jäykemmällä runkomaisella tavalla kuin CTLA-4 sitoutui B7-1: een. B7-2 Sitominen ctla-4: llä oli kuitenkin monimutkaisempaa ja kantoi ”indusoidun istuvuuden tunnusmerkkiä.”Ctla-4 bound-vs apo-B7-2, oli 2.3–3.5 Å siirtyminen B7-2 FG silmukka kohti CTLA-4, joka aloitettiin ~ 120 astetta kierto Phe31 B7-2 (Ref. 130). Tämä tuotti phe31: n pinoamisvaikutuksen CTLA-4: n 99mypppy104-sekvenssin Pro102: n kanssa.
