Kluyveromyces marxianus kehittää etanolinsietokykyä adaptiivisen evoluution aikana ja parantaen merkittävästi useita reittejä

parempi etanolinkestävyys 100 päivän evoluution jälkeen

villin tyypin haploidista K. marxianus-kantaa viljeltiin väliaineessa, jossa oli 6% (v/v) etanolia 30 °C: ssa 100 päivän ajan.450 sukupolvea (KS. tarkemmat menetelmät). Biomassa kasvoi jatkuvasti (mitattuna od600: lla päivittäin) tänä aikana (Kuva. 1a), joka osoittaa solujen selviytymistä etanolistressissä, voidaan parantaa. Lopussa saimme K. marxianus-populaation, jolla oli huomattavasti parempi vastustuskyky etanolille (Kuva. 1b). Kauttaaltaan KM tarkoittaa raakaa kantaa ennen evoluutiota, ja KM-100D viittaa K. marxianus-populaatioon 100 päivän evoluution jälkeen. Suurin etanolin sietokyky KM: llä oli 7% (v/v) ja KM-100D: llä se oli jopa 10% (Kuva. 1b). Vertailimme KASVUPROFIILEJA KM: n ja KM-100D: n välillä eri etanolipitoisuuksilla (0%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8% v / v, kuva. 1c). Koska etanolia ei ollut, kantojen välillä ei ollut merkittävää eroa. Niiden ero kasvoi etanolipitoisuuden noustessa ja saavutti maksimin 6%: n (v/v) etanolilla viljelyaineissa. Tällaisessa tilanteessa KM-100D: n biomassa oli 48 tunnin jälkeen lähes kaksinkertainen verrattuna KM: n biomassaan. Molempien kantojen kasvu oli hidastunut väliaineessa, jossa oli 7% etanolia, eikä se kasvanut väliaineessa, jossa oli 8% etanolia. Lisäksi KM-100D osoitti myös huomattavaa korkeampaa enimmäiskasvunopeutta kuin KM 6% etanolilla (Lisätiedosto 1: kuva S1).

K. marxianus evolution 6% (v/v) etanolissa. päivittäinen OD600 arvo K. marxianus väestöstä evoluution aikana. Soluja siirrettiin ja kasvatettiin päivittäin uuteen elatusaineeseen, joka sisälsi 6% (v/v) etanolia, ja alkuperäinen OD600 oli 0,6. Sen jälkeen kun od600 oli inkuboitu 30 °C: ssa orbitaalivahvistimessa 24 tunnin ajan, se mitattiin solujen kasvun tallentamiseksi. b Täplitetty laimennusanalyysi etanolin sietokyvyn määrittämiseksi ennen evoluutiota ja sen jälkeen. KM ja KM-100D-kennot inokuloitiin nestemäiseen väliaineeseen etanolilla yhdellä gradienttipitoisuuksista: 0, 1, 2,…, 11% (v / v), ja inkuboidaan 30 °C: ssa 3 päivän ajan. 10 OD600: n solususpensio nestemäisestä elatusaineesta laimennettiin 5-kertaisesti sarjamaisesti ja täplitettiin YPD-levylle, ja sitä viljeltiin 30 °C: ssa 2 päivän ajan. C KASVUPROFIILIT KM ja KM-100D eri etanolipitoisuuksilla. Punainen käyrä on km-100d ja musta KM. Kasvuprofiilimittauksen aikana KM ja KM-100D tehtiin molemmat biologisina kolmena kappaleena

DNA-analyysi viittaa siihen, että K. marxianuksella ei ole ploidian muutoksia tai kriittisiä geenejä adaptiivisen evoluution aikana

selvittääksemme DNA: n muutoksia KM-100D: ssä suoritimme DNA ploidy-analyysin ja DNA-mutaatioiden tunnistuksen. Adaptiivisen evoluution aikana K. marxianuksen populaation DNA-sisällössä on vain vähän muutoksia (Lisätiedosto 1: kuva S2), joten ploidia ei muuttunut. Km: n ja KM-100D: n DNA-seq-analyysillä, jotka molemmat kartoitettiin K. marxianus dmku 3-1042: n referenssigenomiin , saatiin SNP: n kohteet KM: n ja KM-100D: n väliltä (Lisätiedosto 2). Tunnistetuista 57 SNP: stä vain 4 aluetta oli määräävässä asemassa KM-100d: n populaatiossa. Kolme niistä sijaitsee san1 -, YAP1-ja KHT2-geenien koodausalueella; toinen on 445 bp yläjuoksulla erg26: sta. SAN1: n 1324: n kohta mutatoitui C: stä T: hen, minkä seurauksena vastaava aminohappo muuttui arginiinista kysteiiniksi. Pfam: n analyysin mukaan 32.0, tämä mutaatio ei kuulu mihinkään tunnistettuun proteiinidomeeniin. Sekä yap1: n että KHT2: n mutaatiot ovat synonyymimutaatioita ilman proteiinimuutoksia. Edellä esitetyt havainnot viittaavat siihen, että muutokset DNA-kontekstissa eivät läheskään riitä tukemaan tällaista fenotyypin paranemista KM-100D: ssä, ja transkriptioiden uudelleenohjelmoinnin on edistettävä tätä. Siksi suoritimme edelleen RNA-seq-analyysin.

100 päivän evoluution

indusoima maailmanlaajuinen uudelleenjohto etanolin sietokyvyn ymmärtämiseksi suoritimme RNA-seq-analyysin, jossa vertailimme väliaineissa kasvaneiden KM-ja KM-100D-hiivojen geeniekspressioita 4-ja 6-prosenttisella (v/v) etanolilla. Kasvuprofiilien perusteella (Kuva. 1C), havaittiin, että KM-100D: n ja KM: n kasvukyvyn välinen ero oli suurimmillaan 48 tunnin kohdalla; näin ollen 48 tunnin mittaisia näytteitä kerättiin RNA-seq-analyysia varten. Setting / log2ratio / ≥ 1 ja p-arvo < 0.05 kriteerinä merkittävien eri tavoin ilmaistujen (DE) geenien määrittelylle suoritimme DE-geenien tunnistamisen seitsemässä ryhmässä (Kuva. 2, merkitään seuraavasti 1, 2, 3, 4, 5, 6, ja 7, vastaavasti). Jokaisessa ryhmässä DE-analyysi tehtiin kontrolliin osoittavan nuolen mukaan. Lisätiedosto 3 sisältää kaikkien geenien ilmentymisarvot ja differentiaaliekspression tilastot. Km: n ja KM-100D: n välillä on maailmanlaajuinen ilmaisuero, kun molemmat kasvoivat etanolittomassa väliaineessa (Kuva. 2 ryhmä①). KM-100D-hiivoilla on 1342 geeniä, joilla on korkeampi ilmentymä kuin KM-hiivalla, kun taas vain 188 geenillä on heikompi ilmentymä. Medioissa, joissa on 4% ja 6% (v/v) etanolia, KM-100D: n säädeltyjen geenien määrä vähenee huomattavasti 415: een (ryhmä②) ja 453: een (ryhmä③). Ylöspäin säädeltyjä geenejä on kuitenkin vielä paljon enemmän kuin vähemmän ilmentyviä (geenit 104 ja 182). Tulokset viittaavat siihen, että KM-100D-hiivat ovat transkriptiivisesti uudelleen johdettuja aktivoimalla suuren määrän geenejä. Ehdotusta tukivat myös etanolin aiheuttamat ilmaisumuutokset KM-ja KM-100D-hiivojen sisällä. Etanolin induktiossa 4% ja 6% (v/v) KM-hiivoilla on 1452 ja 1465 säädeltyä geeniä (ryhmät ⑥ ja⑦), kun taas KM-100D-hiivoilla on vain 631 ja 596 säädeltyä geeniä (ryhmät ④ ja⑤). Lisäksi sovellimme heatmap.2 ohjelmisto R paketti klusterin geenien ja ryhmien perustuu log2ratio arvot (Lisätiedosto 1: kuva S3) ja löysi geeni ero lauseke profiili ryhmässä ① on lähellä, että ryhmä⑦. Yhdessä KM-100D-hiivat säilyttivät monia etanolin indusoimia ilmaisuominaisuuksia, vaikka ne kasvoivat etanolittomassa väliaineessa. Ominaisuudet tekevät kehittyneestä solusta adaptiivisemman nousevalle etanolistimulaatiolle, eli KM-100D-hiivan ei tarvitse aktivoida niin monta geeniä kuin KM.

Global analysis of RNA-seq data in KM and KM-100D under etanol stress. Tässä luvussa lokeroimme RNA-seq-tiedot geenien differentiaaliekspressioanalyysiä varten. KM ja KM-100D esitettiin vastaavasti vasemmalla ja oikealla puolella, ja etanolipitoisuudet 0%, 4% ja 6% (v/v) sijaitsivat riveissä. RNA-seq-tiedot jaettiin seitsemään ryhmään, jotka merkittiin①,②,③,④,⑤, ⑥ ja⑦. Jokaisessa ryhmässä nuoli osoittaa differentiaalisen lausekkeen tunnistuksen säätelyyn, ja punaiset numerot merkitsevät ylös säädeltyä geenilukua, kun taas vihreät edustavat alas säädeltyä lukua

tämän jälkeen suoritimme jokaisessa ryhmässä Gene ontology (GO) – rikastusanalyysin DE genesille (Lisätiedosto 1: Kuva S4), ja totesi, että rikastetut GO-termit kattoivat laajan valikoiman solun perusfysiologisia prosesseja, mukaan lukien ribosomien biogeneesi, aminohappojen biosynteesi, DNA: n korjaus, RNA: n käsittely jne., mutta sillä ei ole suoraa merkitystä etanolinkestävyyden kannalta. Siksi seuraavassa keskityimme erityisesti etanolin aineenvaihduntaan ja toleranssiin vahvasti liittyviin reitteihin analysoimalla niihin liittyviä DE-geenejä (Lisätiedosto 4).

KM-100D tehostettu etanolin käyttö

kaavion kuvaamisen helpottamiseksi mukana olevien DE-geenien log2ratioarvot (Lisätiedosto 4) jaettiin viiteen intervalliin: 1 ~ 2, 2 ~ 3, 3 ~ 4, 4 ~ 5, 5 ~ 6 (ja edellä), kuten kuvassa. 3.

mahdolliset etanolin kulutuksen reitit K. marxianus. Tässä luvussa etanolia kuluu sekä sytoplasmassa (yläosa) että mitokondrioissa (alaosa). Siniharmaa suorakulmio merkitsee mukana geeni, ja ryhmät①,②,③,④,⑤, ⑥ ja ⑦ ovat linjassa näiden määritelmien Fig. 2. Punainen ja vihreä ryhmäluvussa tarkoittavat geenin ylös-ja alas-säätelyä vastaavasti. Värin voimakkuus kuvaa geenin ekspression muutoksen astetta, värin ja log2ratio-arvon vastaavuutta kvantifioidaan kuvan vasemmassa yläkulmassa olevalla väripalkilla

KM: n ja KM-100D: n eroa etanolin kulutuksessa tutkittiin. Kuten kuva. 3, kaksi reittiä voi olla olemassa suoraan kuluttaa etanolia, ja olivat molemmat säädelty KM ja KM-100D kun edessä etanolia (ryhmät④,⑤, ⑥ ja⑦). Yksi tapa on sytoplasmainen ADH6, joka katalysoi etanolia asetaldehydiksi NADP+: n avustamana. Toinen on mitokondrio ATF1, joka edistää etanolin esteröitymistä asetyyli-CoA: n avulla. Erityisesti KM-100D: ssä etanolistressissä (ryhmät ④ ja⑤) YGL039W: tä säädeltiin niin, että se tuottaa enemmän NADP+: ta ja voi siten tuottaa enemmän koentsyymejä etanolin muuntamiseksi asetaldehydiksi etanolin myrkyllisyyden vähentämiseksi. Mitokondrioissa ETANOLIJÄNNITYKSESSÄ altistuneiden kilometrien osalta (ryhmät ⑥ ja⑦) vain C2E1P301 ja ADH4 olivat yläsäädeltyjä. Vaikka KM-100D: ssä, prosessin aikana etanolista aldehydiksi asetaatiksi, C2E1P301, ALD4, ADH3, ADH4 ja ALD6 olivat kaikki säädeltyjä (ryhmä①). Edellä mainitut muutokset osoittavat, että KM-100D saattaa saada uudenlaisen kyvyn vähentää etanolin myrkyllisyyttä lisäämällä etanolin kulutusta. Teoria selittää, että KM-100D suoriutui KM: n aikana väliaineessa etanolilla.

KM-100D tehostettu kalvon lipidien biosynteesi, Anti-osmoottinen paine, anti – oksidatiivinen stressi ja proteiinin taitto etanolirasituksen vastustamiseksi

sen lisäksi, että kertynyt etanoli kuluttaa, se vaikuttaa suoraan solukalvon eheyteen , muuttaa sisä-ja ulko-osmoottista painetta , häiritsee proteiinien konformaatiota ja aiheuttaa reaktiivisten happilajien (Ros) muodostumista aiheuttaen siten vakavia vaurioita hiivasolulle . Seuraavassa analysoimme näiden reittien DE-geenejä etanolin vastaisten vaurioiden varalta K. marxianuksessa (Kuva. 4).

antietanolin kaava aiheutti vahinkoa K. marxianuksella. Tämän luvun vasemmassa osassa väliaineeseen kertynyt etanoli asettaa hiivasolulle osmoottisen paineen ja aktivoi sen jälkeen osmoottisen reagointireitin. Keskiosassa ympäristön etanoli läpäisee solun ja häiritsee solukalvoa. Oikeassa osassa solukalvon lipidejä syntetisoidaan vaurioituneen solukalvon linnoittamiseksi ja korjaamiseksi. Alaosassa etanoli häiritsee proteiinien konformaatiota ja aiheuttaa oksidatiivista stressiä, jolloin siihen liittyvät anturit ja vastereitit aktivoituvat. Geenin differentiaaliekspression ryhmänumerot ja värit ovat linjassa Fig: n kanssa. 3

etanolivetoisen evoluution jälkeen alkoholin stressireitti KM-100D aktivoitui. ASR1, joka translokoituu sytoplasmasta ytimeen etanolille altistumisen yhteydessä , ja ETP1, joka toimii sytoplasmisena retentioproteiinina , jolla on rooli etanoliriippuvaisessa lämpöshokkiproteiinigeenien transcriptionaalisessa aktivoinnissa, olivat sekä säädeltyjä KM-100D: ssä (ryhmä①) ja osittain säädeltyjä KM: n kohtaamissa etanoleissa (ryhmät ⑥ ja⑦), mikä viittaa siihen, että jopa etanolittomassa väliaineessa KM-100D voi valmistaa reagoivia reittejä etanolihaasteeseen, aivan kuten KM: n vastaus etanolille.

kalvon lipidien muodostumisella on tärkeä rooli solukalvon eheyden säilyttämisessä etanolirasituksessa . Tyydyttymättömät rasvahapot, solukalvon rakenteen keskeiset osatekijät, liittyvät läheisesti etanolin sietokykyyn . Kuvitettu Kuvassa. 4, asetyyli-CoA tyydyttymättömän rasvahappojen biosynteesistä fosfolipidiin sisällyttämiseen, mukana olevat geenit PPT2, FAD2 ja TAZ1 olivat kaikki säädeltyjä KM-100D: ssä (ryhmä①), mikä viittaa siihen, että evoluution jälkeen KM-100D voi jo parantaa tyydyttymättömiä rasvahappojen biosynteesiä toimittamaan enemmän raaka-aineita solukalvon biogeneesiin. Ja etanolissa altistuneiden geenien ACC1, TSC13, FAS1 kilometreinä (ryhmät ⑥ ja⑦) alasäätely on edellisen raportin mukaista, mikä saattaa selittää K. marxianuksen heikon etanolinsietokyvyn ennen adaptiivista evoluutiota.

suuri määrä solukalvon lipidibiogeneesiin liittyviä geenejä, kuten fosfoglyseridi, sfingolipidi ja steroli, ilmeni etanolistressissä eri tavoin (Kuva. 4). Erityisesti fosfoglyseridin biosynteesiin osallistuvia geenejä säädeltiin yleisesti KM-100D: ssä (ryhmä①) ja KM-pinnoitetussa etanolissa (ryhmät ⑥ ja⑦), mikä osoittaa, että fosfoglyseridi voi olla tärkein komponentti etanoliresistenssissä solukalvossa. Sterolin biosynteesissä monet geenit (esim.ERG9 ja ERG7) olivat alasäädeltyjä ryhmissä ④ ja ⑥ ja useat geenit yläsäädeltyjä ryhmissä ⑤ (esim. ERG25) ja ryhmässä ⑦ (esim. ERG26), mikä viittaa siihen, että sterolin biogeneesi voi olla tärkeää korkean etanolin kestämisessä, mutta ei alhaisen etanolin. Lisäksi fosfoglyseridin ja sterolin biosynteesiin osallistuvat geenit CKI1, ERG2 ja ERG25 olivat vasta ryhmässä ⑤ säädeltyjä; tämä saattaa olla yksi johtolangoista KM-100D: n paremmalle suorituskyvylle kuin KM runsaassa etanolissa.

suuri etanolipitoisuus väliaineessa aiheuttaa osmoottista stressiä hiivasoluille . Kuten kuvassa. 4, plasmakalvon osmoottiset anturit (SLN1, OPY2 ja SHO1) ja geenit (HOG1, SSK1 ja ssk2), jotka olivat mukana alavirtaan reagoivassa reitissä, olivat kaikki säädeltyjä KM: ssä, joka altistui alhaisessa etanolissa (ryhmä⑥), ja erikseen säädeltyjä KM-100D: ssä (ryhmä①), KM-100D: ssä, joka kohtasi etanolin (ryhmät ④ ja⑤), Ja KM: ssä, joka kohtasi korkean etanolin (ryhmä⑦). Glyserolin tuotanto on tärkeä tapa S. cerevisiae kestää osmoottista painetta . Kun KM ja KM-100D kohtasivat etanolin, useimmat glyserolin biogeneesiin liittyvät geenit olivat alakuloisia. Edellä esitetyt havainnot viittaavat siihen, että ennen evoluutiota ja sen jälkeen K. marxianus parantaa aina väyliä osmoottisten jännityssignaalien tunnistamiseen ja muuntamiseen; sen strategia osmoottisen stressin vastustamiseksi ei kuitenkaan välttämättä perustu glyserolin tuotantoreittiin, on oltava olemassa joitakin muita tapoja.

soluseinä antaa solulle riittävän mekaanisen lujuuden osmoottista painetta vastaan, ja eritysreitti ei ainoastaan kuljeta soluseinän proteiineja ulospäin, vaan myös siirtää lipidejä plasmakalvolle vahvistamaan kalvon rakennetta; siksi nämä kaksi prosessia voivat olla vastuussa anti-osmoottisesta stressistä. Analysoimme de-geenit eritysreitissä ja soluseinän biogeneesissä (Lisätiedosto 1: kuva S5). Eritysreittiin ja soluseinän biogeneesiin osallistuvia geenejä säädeltiin yleensä KM-100D: ssä (ryhmä①), ja osa niistä säädeltiin myös etanolissa altistuneissa KM: ssä (ryhmät ⑥ ja⑦). Se merkitsee, että KM-100D ei ainoastaan säilyttänyt etanolirasitukselle vastustuskykyisen km: n eritysreitin säätelyä, vaan myös laajensi laajalti eritysreitin aktivointialuetta etanolihyökkäykseen valmistautumiseksi.; siksi eritysreitin ja soluseinän muodostumisen tehostaminen voi olla uusi strategia KM-100D, joka on kehitetty kestämään etanolin aiheuttamaa osmoottista stressiä. Toisaalta KM: llä ja KM-100D: llä, jotka altistuivat vähäisessä etanolissa (ryhmät ④ ja⑥), monet sekretorisen reitin geenit olivat molemmat alaspäin säädeltyjä, mikä viittaa siihen, että sekretorisen reitin aktivoituminen ei välttämättä ole K. marxianukselle välttämätön tapa reagoida vähäiseen etanoliin.

etanolin aiheuttamaa oksidatiivista stressiä vastaan (Kuva. 4), hyr1 , joka toimii hydroperoksidijännityksen anturina ja anturina, säädeltiin KM: ssä ja KM-100D: ssä, jotka molemmat altistuvat korkealle etanolille (ryhmät ⑤ ja⑦). Oksidatiiviseen stressiin reagoivat transkriptiotekijät SKN7 ja STB5 olivat säädeltyjä KM-100D: ssä (ryhmä①) ja KM: ssä korkea etanoli (ryhmä⑦). Antioksidatiivista stressiä varten superoksididismutaasijärjestelmään (esim.MTM1 ja PRX1) osallistuvat geenit olivat yleensä säädeltyjä KM-100D: ssä joko altistettuina etanolissa tai ei (ryhmät①, ④ ja⑤). Tioredoksiinijärjestelmässä geenit (esim., MXR1 ja TRR1)olivat YLÄSÄÄDELTYJÄ KM-ja KM-100D: ssä, joissa molemmissa oli etanolia. Tioredoksiinin ja sen reduktaasin raportoitiin myös parantavan K. marxianuksen sietokykyä useille lignoselluloosista johdetuille estäjille . Glutaredoksiinijärjestelmässä geenejä GRX2 ja GLR1 säädeltiin vain KM-100D: ssä, joka altistettiin runsaassa etanolissa (ryhmä⑤). Peroksisomien biogeneesiä varten geenejä, kuten PEX6 ja PEX7, säädeltiin KM-100D: ssä (ryhmä①), ja joitakin muita geenejä (esim.PEX3 ja INP2) säädeltiin KM: ssä ja KM-100D: ssä, kun ne kohtasivat alhaisen etanolin (ryhmät ④ ja⑥). Edellä mainittu viittaa siihen, että KM-100D saattaa maailmanlaajuisesti vahvistaa hapettumisen estokykyä.

oikean proteiinin taittumisen varmistamiseksi etanolirasituksessa (Kuva. 4), lämpöiskun transkriptiokerroin HSF1 oli säädelty KM: ssä ja KM-100D: ssä, jossa oli alhainen etanoli (ryhmät ④ ja⑥), useita kaitselijoihin liittyviä geenejä (esim.PFD1 ja CPR7) säädeltiin KM: ssä, jossa oli etanolia (ryhmät ⑥ ja⑦), myös pidettiin yllä-säätelyä KM-100D: ssä (ryhmä①). Jotkin geenit (esim.CPR4), joita säädeltiin alaspäin KM-100D: ssä, eivät olleet säädeltyjä KM-100D: ssä. Siksi KM-100D voi yleensä parantaa proteiinin taittumista vakaamman soluympäristön luomiseksi.

on raportoitu, että S. cerevisiae-ryhmässä trehaloosin kertyminen oli tärkeää etanolinsietokyvyn kannalta, koska trehaloosi toimii yhteensopivana liuoksena estäen ylimääräisten suolojen kulkeutumisen hiivasoluihin ; samaan aikaan etanoli indusoi myös trehaloosin hajoamiseen osallistuvia geenejä säätääkseen sen optimaaliselle pitoisuudelle . K. marxianukselle (Kuva. 4), havaitsimme, että trehaloosin biosynteesiin ja hajoamiseen osallistuvat geenit (esim., NTH1 ja TSL1) olivat yleisesti korkeasäätöisiä, kun niitä hoidettiin vähäetanolilla (ryhmät ④ ja⑥), mutta ei geenin korkeasäätöisiä trehaloosiaineenvaihdunnassa, kun ne altistettiin runsasetanolille (ryhmät ⑤ ja⑦). Tämä viittaa siihen, että K. marxianuksella trehaloosin kertyminen voi olla erityinen strategia, jolla selvitään vähäisestä etanolista, mutta ei korkeasta etanolista.

edellä mainittuihin etanolinsietoratoihin osallistuvien 15 geenin differentiaaliekspressiot validoitiin RT-qPCR-analyysillä(Kuva. 5). Geenien ilmaukset ryhmässä ① (Kuva. 5a) olivat yleisesti säädeltyjä. Toisaalta ryhmässä ④ olevien geenien yläsäätely (Kuva. 5d)ja ryhmä ⑤ (kuva. 5e)ei ollut yhtä korkea kuin ryhmässä ⑥ (Kuva. 5b)ja ryhmä ⑦ (kuva. 5c). Analyysimme vahvisti, että etanolin sietoon vaikuttavat geenit aktivoituvat jatkuvasti KM-100D: ssä etanolistressin poistumisen jälkeenkin. Jatkuva geeniekspressio voi olla hyödyllistä vakauttaa solunsisäistä ympäristöä ja hyötyä solujen kasvulle tulevassa stressissä.

RT-qPCR-analyysi KM: n ja KM-100D: n geenien differentiaaliekspressiolle eri ryhmissä. km-100D vs. KM molemmat etanolittomassa väliaineessa. Tämä on De-geenianalyysiin ryhmässä①. b KM altistettuna 4%: ssa (v/v) etanolia vs. KM etanolittomassa väliaineessa. Tämä on ryhmälle⑥. c KM altistettuna 6%: ssa (v/v) etanolia vs. KM etanolittomassa väliaineessa. Tämä on ryhmälle⑦. d KM-100D altistettuna 4%: ssa (v/v) etanolia verrattuna KM-100D: hen etanolittomassa väliaineessa. Tämä on ryhmälle④. e KM-100D altistettuna 6%: ssa (v/v) etanolia verrattuna KM-100D: hen etanolittomassa väliaineessa. Tämä on ryhmälle⑤. Kussakin otoksessa käytettiin 18: aa sisäisenä kontrollina. Kokonais-RNA eristettiin soluviljelmästä 48 tunnin kohdalla biologisessa kolmena kappaleena

tehostetun etanolinkulutuksen ja monirasituksen kestävyyden validointi km-100D

tarkistimme KM: n ja KM-100D hiivojen kasvun YNB-väliaineessa eri hiililähteillä (Kuva. 6 A). Sekä KM-että KM-100D-hiivoilla on sama kyky hyödyntää glukoosia ainoana hiilenlähteenä. Koska ainoana hiililähteenä oli 1% ja 2% (v/v) etanolia, KM-100D-hiivat kasvoivat kuitenkin paremmin kuin KM-hiivat. Tulos tukee edellä mainittua hypoteesiamme, jonka mukaan KM-100D-hiivat hyödynsivät etanolia tehokkaammin kuin KM-hiivat.

Cell growth assay on etanol and cell lively and fermentation under multiple strengtures. KM: n ja KM-100D: n solujen kasvumääritys, joka perustuu hiililähteenä käytettävään glukoosiin tai etanoliin. 10 OD600: n solususpensio viisinkertaistettiin sarjalaimennettuna ja laikutettiin YNB-levylle, jossa ainoana hiililähteenä oli glukoosi tai etanoli, ja sitä viljeltiin 2 päivän ajan, kuten sarakkeet osoittavat. B-solujen elinkykymääritys KM ja KM-100D termisen stressin aikana. Lämpötila on 30 °C, 37 °C, 40 °C ja 45 °C. C-solujen elävyysanalyysi oksidatiivisessa stressissä. H2O2: ta käytettiin hapettumisärsykkeenä, ja sen pitoisuudet ovat 0%, 0,04%, 0,06% ja 0,08%. d solujen elinkyky osmoottisessa paineessa. Osmoottisen paineen aiheuttamiseen käytettiin korkeaa suolaa (NaCl), jonka pitoisuudet olivat 0 M, 0,5 M, 0,6 M ja 0.7 M. e etanolin saanto ja glukoosin käyttö km ja KM-100D perustilanteissa. f etanolin saanto ja glukoosin käyttö alle 45 °C. G etanolin saanto ja glukoosin käyttö alle 6% (v/v) etanolin rasitus. h etanolin saanto ja glukoosin käyttö alle 8% (v/v) etanolin rasitus. Alaluvussa B-d, KM ja KM-100D ovat ensimmäisellä ja toisella rivillä. 10 OD600: n solususpensio laimennettiin 5-kertaisesti sarjalaimennettuna ja täplitettiin YPD-levylle ja sitä viljeltiin 2 päivän ajan. Lämpökoetta lukuun ottamatta kaikki muut testit tehtiin 30 °C: ssa. Alaluvussa e-h vasen y-akseli ja oikea y-akseli edustavat glukoosijäämiä väliaineessa (merkitty mustalla) ja etanolin tuotanto (merkitty sinisellä) vastaavasti

toisaalta perustuu Fig. 4, KM-100D voi kehittää vastustuskykyä etanolin aiheuttama useita jännityksiä samanaikaisesti, mukaan lukien osmoottinen stressi, oksidatiivinen stressi, ja terminen stressi (lämpö shokkiproteiinit otetaan esiliinoina proteiinin taitto). Arvioidaksemme hiivojen toleransseja useisiin jännityksiin suoritimme solukelpoisuusmäärityksen eri lämpötiloille, hapettumiselle ja osmoottisille paineille (Kuva. 6b-d). Perusvaatimuksissa (30 °C, 0% H2O2 ja 0 M NaCl) km: n ja KM-100D: n hiivojen välillä ei ole elinkelpoisuuseroa. Erilaisten rasitusten vallitessa KM-100D-hiivoilla on kuitenkin huomattavasti parempi elinkyky kuin KM-hiivoilla. Lisäksi edut ovat merkittävämpiä, kun taas korostaa tuli vakavampi (Kuva. 6b-d). Odotimme, että useiden rasitusten toleranssit voisivat tuoda etanolintuotannossa käytettäviin hiivoihin uusia ominaisuuksia.

selvitimme edelleen etanolin tuottavuutta KM: n ja KM-100D: n hiivojen välillä useiden rasitusten alaisena. Perustilanteessa (30 °C ja 0% etanolia, Kuva. 6e), KM ja KM-100D hiivat ovat lähes samat sekä glukoosin kulutuksessa että etanolin tuotannossa. Kuitenkin KM-100D hiivat osoittivat merkittäviä etuja läsnä korkean lämpötilan (45 °C, Kuva. 6f) tai enemmän etanolia (6% tai 8%, Kuva. 6g, h); yhteinen ympäristö tapahtui yleensä käymisen myöhäisvaiheessa. Teimme RT-qPCR-analyysin sekä KM-että KM-100D-hiivoille, jotka on fermentoitu väliaineessa, jossa on 6% etanolia 48, 72 ja 120 tunnin lämpötilassa (Kuva. 7). Suurin osa näistä etanolia sietävistä geeneistä oli säädeltyjä KM-100D: ssä verrattuna KM: iin, erityisesti varhaisemmassa vaiheessa (48 h) etanoliin sopeutumista varten (Fig. 7). Yhteenvetona voidaan todeta, että säätelemällä etanolia sietävien geenien ilmauksia KM-100D-hiivat päihittivät km-hiivat stressaavissa olosuhteissa etanolisadon kasvaessa.

RT-qPCR-analyysi geeniekspressioille KM: n ja KM-100D: n käymisvaiheessa. KM-100D vs. KM molemmat 48 tunnin käymishetkellä. b KM-100D vs. KM molemmat 72 tunnin käymishetkellä. c KM-100D vs. KM molemmat 120 tunnin käymishetkellä. Kussakin otoksessa käytettiin 18: aa sisäisenä kontrollina. Sekä KM että KM-100D viljeltiin mediassa 6-prosenttisella etanolilla. Kokonais-RNA eristettiin soluviljelmistä biologisessa kolmoisviljelmässä