Knocking-down-ja Knocking-out-geenit

geeni Knocking-down
tämä tekniikka mahdollistaa yhden tai useamman anorganismin ilmentymisen vähentämisen. Tämä voi tapahtua geenimuuntelun tai areagent-hoidon avulla, kuten lyhyellä DNA-tai RNA-oligonukleotidilla, jolla on sekvenssikomplementti joko geenin tai mRNA-transkription kanssa.
jos geeniekspression muutos johtuu oligonukleotidin sitoutumisesta mRNA: han tai väliaikaisesti sitoutumisesta geeniin, tämä johtaa väliaikaiseen muutokseen geeniekspressiossa,joka ei muuta kromosomaalista DNA: ta, ja tulosta kutsutaan ”ohimeneväksi knockdowniksi”.
ohimenevässä knockdownissa tämän oligonukleotidin sitoutuminen aktivegeeniin tai sen transkriptioihin aiheuttaa ekspression heikkenemistä. Sitoutuminen voi tapahtua transkription eston, mRNA-transkription hajoamisen (esim. siRNA tai RNaasi-h-riippuvainen antisense), tai estämällä joko mRNA-translaatio, mRNA: ta edeltävät liitoskohteet tai nukleaasi-cleavagesiitit, joita käytetään muiden funktionaalisten RNA: iden, mukaan lukien miRNA, kypsyttämiseen (e.g.by morfolino oligos).
suorinta käyttöä transient knockdowneilla on saada tietoa geenistä, joka on sekvensoitu, mutta jolla on tuntematon tehtävä. Tätä kokeellista lähestymistapaa kutsutaan käänteiseksi genetiikaksi. Kehitysbiologiassa käytetään usein ohimeneviä tyrmäyksiä, koska oligoja voidaan injektoida yksisoluisiin tsygootteihin ja niitä on injektoidun solun tytärsoluissa.

RNA-interferenssi (RNAi) on keino vaientaa geenejä mRNA: n hajoamisen avulla. Geeni knockdownby tämä menetelmä saadaan aikaan tuomalla pieni kaksijuosteinen interferingrna (siRNA) sytoplasmaan. Kun se on tuotu soluun, exogenousirnat käsitellään RISC: llä. SiRNA täydentää hiljennettävää targetmRNA: ta, ja RISC käyttää siRNA: ta mallina kohteen mRNA paikantamisessa. RISC: n paikallistettua kohdehenkilön mRNA: n RNA pilkkoutuu ribonukleaasin avulla.
RNAi: ta käytetään geneettiseen funktionaalianalyysiin. RNAi: n käytöstä voi olla hyötyä mahdollisten terapeuttisten tavoitteiden, lääkekehityksen tai muiden sovellusten määrittämisessä.

Gene Knocking-out
Geneknockout (KO) on geenitekniikka, jossa jokin eliön geeneistä tehdään toimimattomaksi. Knockout organismeja käytetään tutkimaan geenin toimintaa, yleensä tutkimalla vaikutusta geenin menetys. Heterotsygoottiset ja homotsygoottiset Kos: edellisessä vain yksi alleeli tyrmätään, jälkimmäisessä molemmat kaksi alleelia tyrmätään.

KO: n suunnattu luominen alkaa koeputkessa plasmidilla,bakteerien keinotekoisella kromosomilla tai muulla DNA-rakenteella ja etenee soluviljelmään. Solut transfektoidaan Dnaconstructilla. Usein tavoitteena on luoda siirtogeeninen eläin, jolla on muuttunut geeni.
jos näin on, alkion kantasolut muunnetaan geneettisesti ja lisätään varhaisalkioihin. Tuloksena olevat eläimet, joilla on geneettinen muutos niiden sukusoluissa, voivat sitten usein siirtää geenin tyrmäyksen tuleville sukupolville.

konstruktio on suunniteltu rekombinoitumaan kohdegeenin kanssa, mikä tapahtuu porrastamalla sekvenssejä itse geenistä konstruktioon.Rekombinaatio tapahtuu sitten kyseisen sekvenssin alueella geenin sisällä, mikä johtaa vieraan sekvenssin lisäämiseen geenin häiritsemiseksi.
ehdollinen tyrmäys mahdollistaa geenin poiston kudoksessa tai ajallisesti määrätyllä tavalla. Tämä tapahtuu ottamalla käyttöön loxP-sivustoja geenin ympärille. Nämä seuraukset tulevat itulinjaan samalla mekanismilla kuin aknock-out. Tämä iturata voidaan sitten risteyttää toiseen itureseptoria sisältävään Kre-rekombinaasiin, joka on virusentsyymi, joka voi tunnistaa nämä sekvenssit, rekombinoida ne ja poistaa näiden kohtien reunustaman geenin.
koska DNA-rekombinaatio on harvinainen tapahtuma, vieraaseen sekvenssiin, joka on valittu insertiota varten, kuuluu Yleensä toimittaja. Tämä mahdollistaa helpon valinnan selleistä tai yksilöistä, joissa knockout onnistui. Joskus DNAconstruct inserts osaksi kromosomi ilman toivottua homologista yhdistymistä kohdegeenin.

(Ivana Venezia)

KNOCKDOWN
kyseessä on tekniikka, jolla geenin ilmentymistä vähennetään. Tämä reduktio voi johtua DNA-muunnoksesta tai oligonukleotidista, joka sitoutuu joko mRNA: han tai geeniin. Tässä tapauksessa ilmaisun muutos on väliaikainen, joten wetalk noin ohimenevä knockdown.
yksi geenin tilapäisen tyrmäyksen mahdollistavista tekniikoista on Morfolinoligomeerien käyttö. Niistä on tullut standardi knockdown-työkalueläinalkiojärjestelmissä, joten Morfolinooligoja käytetään usein tutkimaan tietyn mRNA-transkription roolia inan-alkiossa. Sen molekyylirakenteessa on DNA-emäksiä, jotka ovat kiinnittyneet fosforodiamidaattiryhmien kautta toisiinsa liittyneiden metyleenimorfoliinirenkaiden selkärankaan. Morfolinot estävät muiden molekyylien pääsyn pieniin (~25 emästä) spesifisiin sekvensseihin ribonukleiinihapon (RNA) emäsparipinnoilla. Koska Morfolinot ovat täysin epäluonnollisia, niitä ei tunnisteta soluproteiineista. Nukleaasit eivät hajota Morfolinoja, eivätkä ne hajoa seerumissa tai soluissa. Ei ole julkaistu raportteja morfoliinoista, jotka aktivoisivat tietullin kaltaisia reseptoreita tai synnynnäisiä immuunivasteita, kuten interferonin induktiota tai NF-kB-välitteistä tulehdusvastetta.Morfolinojen ei tiedetä muuttavan DNA: n metylaatiota.
Morfolinot eivät laukaise kohde-RNA-molekyyliensä hajoamista,toisin kuin monet antisense-rakennetyypit (esim.fosforotioaatit, siRNA). Sen sijaan Morfolinosaktia ”steerisellä estolla”, sitoutumalla kohdesekvenssiin RNA: n sisällä estäen molekyylejä,jotka muutoin saattaisivat vuorovaikuttaa RNA: n kanssa.
Morfolinot voivat myös muuttaa mRNA: n esiastetta tai estää mirnan muodostumista ja toimintaa.
Blokkitranslaatio
sitoutuneena lähetti-RNA: n (mRNA) 5′ – transloitumattomaan alueeseen Morfolinot voivat häiritä ribosomaalisen initiaatiokompleksin etenemistä 5′ cap: sta startcodoniin. Tämä estää kohdennetun transkription koodausalueen kääntämisen (kutsutaan ”knocking down”geneexpressioniksi). Tämä on hyödyllistä kokeellisesti, kun tutkijahaluaa tietää tietyn proteiinin toiminnan; Morfolinot tarjoavat akonvenient keinot tuhota proteiinin ilmentyminen ja oppia, miten knockdown muuttaa soluja tai organismia.
mRNA: ta edeltävän liitoksen muuttaminen
Morfolinoskaani vaikuttaa mRNA: ta edeltäviin prosessointivaiheisiin joko estämällä pieniä ydinnukleonukleoproteiineja (snRNP) sitoutumasta kohteisiinsa intronien rajoilla Pre-mRNA: n säikeellä tai estämällä nukleofiilisen adeniiniemäksen ja estämällä sen muodostamasta liitos-lariatuurirakennetta tai häiritsemällä liitoksen säätelyproteiinien, kuten liitosäänenvaimentimien ja liitoksen tehostajien, sitoutumista. Snrnp U1: n (luovuttajakohdassa) tai U2/U5: n (polypyrimidiiniosassa ja hyväksymiskohdassa) sitoutumisen estäminen voi aiheuttaa muuntunutta saumausta, jolloin eksonit jätetään yleensä pois mRNA: n luonteesta. Joidenkin liitoskohteiden kohdentaminen johtaa intronisulkeumiin, kun taas kryptisten liitoskohteiden aktivointi voi johtaa osittaisiin sulkeumiin tai poissulkemisiin.Tavoitteet U11 / U12 snRNPs voidaan myös estää. Splice-modifiointi voidaan määrittää käänteiskopioijaentsyymipolymeraasiketjureaktiolla (RT-PCR), ja se nähdään kaistanvaihtona RT-PCR-tuotteiden geelielektroforeesin jälkeen.
KNOCKOUT
muunnelma perinteisestä gene knockoutista on ehdollinen gene knockout.
ehdollinen geeninkoutuminen on tekniikka, jota käytetään poistamaan tietystä kudoksesta, kuten maksasta, tietynlainen geeni. Tämä tekniikka on hyödyllinentutkimus rooli yksittäisten geenien elävissä organismeissa. Se eroaa perinteisestä geeninkosketuksesta, koska se kohdistuu tiettyihin geeneihin tiettyinä aikoina sen sijaan, että se olisi poistettu elämän alusta. Käyttämällä ehdollista geneknockout tekniikka poistaa monia sivuvaikutuksia perinteisen geenin knockout. Perinteisessä geenien tyrmäyksessä voi tapahtua geenimutaatiosta johtuva alkiokuolema,mikä estää tutkijoita tutkimasta geeniä. Joitakin kudoksia ei voida tutkia kunnolla eristyksissä, joten geenin on oltava inaktiivinen tietyssä kudoksessa ja pysyttävä aktiivisena toisissa. Tämän teknologian avulla tutkijat pystyvät tyrmäämään geenit tietyssä kehitysvaiheessa ja tutkimaan, miten geenin tyrmäys yhdessä kudoksessa vaikuttaa samegeeniin muissa kudoksissa.
yleisimmin käytetty tekniikka on Cre-lox-yhdistelmäjärjestelmä. Cre-rekombinaasientsyymi tunnistaa erityisesti kaksi DNA: n rekombinaatiopaikkaa (loci of rekombination) ja aiheuttaa niiden välisen rekombinaation. Tämä rekombinaatio aiheuttaa geenien deleetion tai Inversion kahden lox-alueen välillä riippuen niiden orientaatiosta. Anentire geeni voidaan poistaa tai inaktivoida. Tämä koko järjestelmä on indusoitavissa, joten achemical voidaan lisätä tyrmäämään geenit tiettyyn aikaan. Kaksi yleisimmin käytettyä kemikaalia ovat tetrasykliini, joka aktivoi rekombinaasigeenin transkription ja tamoksifeeni, joka aktivoi Krerekombinaasiproteiinin kuljetuksen tumaan. Vain harvat solutyypit ilmentävät Krerekombinaasia, eikä yksikään nisäkässolu ilmaise sitä, joten lox-alueiden satunnaisaktivaation vaaraa ei ole, kun nisäkkäillä käytetään ehdollista geeninkoutumista.
Cre-geenin sisältävä hiiri ja loxP-sekvenssejä sisältävä hiiri jalostetaan tuottamaan ehdollinen tyrmäys kiinnostavalle particulargeenille. Hiiret eivät luonnostaan ilmaise Cre-rekombinaasia tai loxsiittejä, mutta ne on suunniteltu ilmentämään näitä geenituotteita toivottujen jälkeläisten luomiseksi. Sinun on hankittava hiiri, jossa tärkeä eksoni floksataan (se tarkoittaa, että sillä on alox-P ylä-ja alavirtaan) ja hiiri, jolla on Cre-sekvenssi, jonka lauseketta säätelee solutyyppikohtainen promoottori tai indusoituva promoottori. Sitten risteytetään nämä hiiret ja saadaan hiiri, jossa Cre: tä ilmentämättömien solujen geeni toimii normaalisti, kun taas Cre: tä ilmentävien solujen geenin toiminta häiriintyy lox-p: n välisellä osuudella.
(Francesca Luca)

RNA-interferenssimekanismi

RNA-interferenssimekanismi (RNAi), anansitiivinen solujen antiviraalinen vaste, on luonnollinen mekanismi geneekspression hiljentämiseksi. Sitä voidaan hyödyntää minkä tahansa kohdegeenin toiminnan spesifisen eston mahdollistamiseksi. RNAi on osoittautumassa korvaamattomaksi tutkimusvälineeksi, se auttaa tunnistamaan uusia geenejä, jotka osallistuvat tautiprosesseihin.

RNAi ei ole ainoa geenin ilmentymistä estävä mekanismi (taulukko 1).

Taulukko 1: eri geenien hiljentämismenetelmien Vertailu.

RNA-interferenssiä(RNAi) tapahtuu vastauksena kaksijuosteisen RNA: n (dsRNA)kulkeutumiseen soluun. DsRna: n käyttöönotto laukaisee dsrna-riippuvaisen proteiinikinaasi-r: n (PKR) aktivoitumisen. Aktivoitu PKR fosforyloi translaatiota käynnistävän tekijän EIF2: tämä vaikutus yhdessä RNaasi-L: n aktivoitumisen ja interferonin tuotannon induktion kanssa pysäyttää proteiinisynteesin ja edistää apoptoosia. Kaiken kaikkiaan tämän uskotaan edustavan viruslääkemekanismia. RNAi on hyvin säilynyt mekanismi kaikissa taksonomisissa lajeissa . Sen lisäksi tohave antiviraalinen aktiivisuus, RNAi uskotaan myös tukahduttaa ilmentymistä ofpotentiaalisesti haitallisia segmenttien genomin, kuten transposons, joka mightotherwise epävakauttaa genomin toimimalla insertional mutageenit.

vaikka sen mekanismia ei ole täysin selvitetty, RNAi edustaa monivaiheisen prosessin tulosta (kuva 1). Soluun päästyään pitkiä dsrnoja käsitellään ensin RNaasi III-entsyymin Dicer-menetelmällä. Tämä funktionaalinen dimeeri sisältää shelicase -, dsRNA-Sidonta-ja PAZ-verkkotunnuksia (niiden rooleja ei ole täysin selvitetty). Dicer tuottaa 21-23 nukleotidi dsRNA-fragmenttia, joissa on kaksinukleotidi 3 ’ – päätyylityksiä eli sirnoja. RNAi välittyy RNA-indusoidussilencing complex (RISC), joka sirnan ohjaamana tunnistaa mRNA: n sisältävän vastaavuuden siRNA: n kanssa ja pilkkoo mRNA: n paikassa, joka sijaitsee noin homologisen alueen keskellä. Näin geeniekspressio on erityisen inaktivoitu transkription jälkeisellä tasolla.

In C. elegans, Dicer on osoitettu olevan vuorovaikutuksessa rde-proteiinien kanssa. RDE-proteiinit sitoutuvat pitkään dsRNA: han ja niiden uskotaan esittävän pitkän dsRNA: n Dicerille käsiteltäväksi. Mutanteilla, joilla on suuri resistenssi RNAi: lle, on raportoitu olevan mutaatioita atrde-1 ja rde-4 loci.

Kuva 1: Rnainterferenssin mekanismi

kaksoissidonnaisen (DS) RNA: n ilmaantuminen solun sisälle (esim. virusinfektiosta johtuen)laukaisee monimutkaisen vasteen, joka sisältää muun muassa ilmiöitä (esim.interferonin tuotanto ja sen seuraukset) RNAi: nä tunnettu molekyylitapahtumien sarja. RNAi: n aikana soluentsyymin Dicer sitoutuu dsRNA: han ja pilkkoo sen lyhyiksi ~ 20 nukleotidiparin kappaleiksi, jotka tunnetaan nimellä smallinterfering RNA (siRNA). Nämä RNA-parit sitoutuvat soluentsyymiin calledRNA-indusoituun silenting complex (RISC), joka käyttää siRNA: n yhtä säiettä sitomaan yksijuosteisia RNA-molekyylejä (eli mRNA) komplementaarisessa järjestyksessä. Tämän jälkeen RISC: n tumatoiminta hajottaa mRNA: n, jolloin viruksen geenin ilmentyminen hiljenee. Samoin solujen geenikoneiston uskotaan toulilize RNAi: n hallitsevan endogeenisen mRNA: n ilmentymistä, jolloin siihen lisätään uusi jälkitranskiptionaalisen säätelyn muoto. RNAi: ta voidaan hyödyntää kokeellisissa asetuksissa, jotta voidaan kaataa kiinnostavia kohdegeenejä korkean spesifisen ja suhteellisen helpon tekniikan avulla (KS.tarkemmat tiedot tekstistä).

genesilenssin lisäksi RNAi saattaa liittyä muihinkin geenisäätelyn ilmiöihin.. Näyttää siltä, että RNAi voi toimia myös metyloimalla sytosiineja sekä Cpgseurauksia, jotka liittyvät klassisemmin metylaatioon. Jos kohdesekvenssissä on homologia promoottorin kanssa, transkriptiovaimennus voi tapahtua viametylaationa. Lisäksi RNA näyttää olevan vuorovaikutuksessa kromatiinidomeenien kanssa, mikä saattaa lopulta ohjata DNA: n metylaatiota. C. elegansin tutkimukset ovat osoittaneet, että RNAi voi levitä soluissa mekanismien kautta, jotka eivät välttämättä ole sirnan varassa.Systeeminen RNA-interferenssipuutteinen (Sid) lokus, sid-1, koodaa konservoitua proteiinia signaalipeptidisekvenssillä ja 11 oletetulla transmembraanidomeenilla,mikä viittaa siihen, että sid-1-proteiini voi toimia pitkän dsRNA: n,sirnan tai toistaiseksi tuntemattoman RNAi: n liittyvän signaalin kanavana. Sid-1-mutantit pitävät kennon autonomista RNAi: tä, mutta eivät osoita RNAi: n leviämistä. On edelleen epäselvää, esiintyykö tätä systeemistä RNAi: ta nisäkkäillä, vaikka Sid-1: n ja ennustettujen ihmisen ja hiiren proteiinien välillä on voimakas samankaltaisuus.

(Justine Floret)

lähde : https://translational-medicine.biomedcentral.com/articles/10.1186/1479-5876-2-39#Sec3

lang= ”en-gb” xml:lang= ”fi-gb”>

ZFN, TALEN, CRIPR / CAS9

nämä kolme molekyylitekniikkaa mahdollistavat genomin muokkaamisen paikkasidonnaisella tavalla, jokaisella tekniikalla on erilainen mekanismi. Sinkkisormen nukleaasit (ZFNs) ja transkription aktivaattorin kaltaiset efektorinukleaasit (Taleenit) ovat kimeerisiä nukleaaseja, jotka koostuvat ohjelmoitavista, sekvenssispesifisistä DNA: ta sitovista moduuleista, jotka on liitetty epäspesifiseen DNA-pilkkoutumisdomeen. ZFNs ja Talen mahdollistavat laajan valikoiman geneettisiä muutoksia indusoimalla DNA: n kaksoisjuosteen katkoksia, jotka stimuloivat virhealttiita ei-homologista pääteen liittymistä tai homologisesti ohjattua korjausta tietyissä genomisissa paikoissa.

Kuva otettu http://gentaur-italy.com/prodotti/talen-un-sistema-semplice-e-veloce-per-gene-knockout/

zfns: n ja Talensin monipuolisuus johtuu kyvystä muokata DNA: ta sitova domeeni tunnistamaan lähes minkä tahansa sekvenssin. Nämä DNA: ta sitovat moduulit voidaan yhdistää lukuisiin efektoridomiineihin, jotka vaikuttavat genomin rakenteeseen ja toimintaan, mukaan lukien nukleaasit, transkriptioaktivaattorit ja repressorit, rekombinaasit, transposaasit, DNA: n histonimetyylitransferaasit ja histoniasetyylitransferaasit. Siten kyky onnistuneesti suorittaa geneettisiä muutoksia riippuu pitkälti DNA-sitova spesifisyys ja affiniteetti suunniteltu sinkki-sormi ja TALE proteiineja.

Cys2-His2 sinkkisormen proteiinit

Cys2-His2 sinkkisormen domeeni on yleisimpiä eukaryooteissa esiintyviä DNA: ta sitovia motiiveja ja edustaa toiseksi useimmin koodattua proteiinidomeenia ihmisen perimässä. Yksittäinen sinkkisormi koostuu noin 30 aminohaposta, jotka ovat säilyneessä ββα-konfiguraatiossa. Useat α-helixin pinnalla olevat aminohapot ovat tyypillisesti yhteydessä kolmeen emäspariin DNA: n pääurassa, joiden selektiivisyys vaihtelee. Sinkkisormiproteiinien modulaarinen rakenne on tehnyt niistä houkuttelevan kehyksen mukautettujen DNA: ta sitovien proteiinien suunnittelulle. Avain sinkki-sormiproteiinien soveltamiseen spesifiseen DNA-tunnistukseen oli sellaisten luonnottomien ryhmien kehittäminen, jotka sisältävät enemmän kuin kolme sinkki-sormi-domeenia. Tätä edistystä helpotti rakenteisiin perustuva erittäin säilyneen linker-sekvenssin löytäminen, joka mahdollisti synteettisten sinkki-sormiproteiinien rakentamisen, jotka tunnistivat 9-18 bps: n pituisia DNA-sekvenssejä. Koska 18 bps DNA-sekvenssiä voi antaa spesifisyyden 68 miljardin bp: n sisällä DNA: sta, tämä menetelmä mahdollisti tiettyjen sekvenssien kohdistamisen ihmisen genomiin ensimmäistä kertaa.

transkription Aktivaattorimaiset efektorit

Talit ovat luonnossa esiintyviä proteiineja, jotka ovat peräisin kasvipatogeenisten bakteerien suvusta Xanthomonas, ja sisältävät DNA: ta sitovia domeeneja, jotka koostuvat sarjasta 33-35 aminohappoa toistavia domeeneja, joista kukin tunnistaa yhden bp: n. TALE spesifisyys määritetään kaksi hypervariable aminohappoja, jotka tunnetaan toistuvan muuttujan diresidues (rvds). Kuten sinkkisormet, modulaariset TARINANKERRONNAT on yhdistetty toisiinsa tunnistaakseen yhtenäisiä DNA-sekvenssejä. Kuitenkin toisin kuin sinkki sormi proteiineja, ei ollut uudelleen engineering välinen yhteys toistaa tarpeen rakentaa pitkiä sarjoja tarinoita kyky teoreettisesti käsitellä yksittäisiä sivustoja genomin. Sen lisäksi, että ne helpottavat HDR: ää (homologinen suora rekombinaatio), paikkasidonnaiset nukleaasit mahdollistavat myös solulinjojen ja eliöiden nopean muodostumisen, joilla on nolla fenotyyppiä.; NUKLEAASIN indusoiman DSB: n nhej-välitteinen korjaus johtaa pienten insertioiden tai deleetioiden käyttöönottoon kohdekohdassa, mikä johtaa geenitoiminnan tyrmäykseen kehyssiirtymämutaatioiden kautta.

kuva, joka on otettu http://www.anim.med.kyoto-u.ac.jp/gma/nucleases.aspx

erotuksena edellä kuvatuista paikkasidonnaisista nukleaaseista, CRISPR (Clustered Regulatory Interspaced Short Palindromic Repeats)/CRISPR-related (CAS) – järjestelmä on äskettäin osoittautunut mahdollisesti helpoksi ja tehokkaaksi vaihtoehdoksi zfns: lle ja Taleneille kohdennettujen geneettisten muutosten indusoimiseksi. Bakteereilla CRISPR-järjestelmä tarjoaa hankitun immuniteetin vieraan DNA: n tunkeutumista vastaan RNA-ohjatun DNA-pilkkoutumisen kautta. Tyypin II CRISPR / cas-järjestelmässä vieraan DNA: n lyhyet segmentit, joita kutsutaan ”välilevyiksi”, integroidaan CRISPR-genomiseen lokukseen ja litteroidaan ja jalostetaan lyhyeksi CRISPR-RNA: ksi (crRNAs). Nämä crrnat hehkuttavat transaktivoivia crrnoja (tracrRNAs) ja patogeenisen DNA: n suoraa sekvenssispesifistä pilkkomista ja hiljentämistä Cas-proteiineilla. Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että Kohdetunnistus Cas9-proteiinin avulla edellyttää ”siemen” – sekvenssiä crRNA: ssa ja säilyvää dinukleotidia sisältävää protospacer adjacent motif (Pam) – sekvenssiä ennen crRNA: n sitoutumisaluetta. CRISPR / cas-järjestelmä voidaan siten kohdistaa uudelleen lähes minkä tahansa DNA-sekvenssin pilkkomiseen suunnittelemalla crRNA uudelleen. Merkittävää on, että CRISPR / cas-järjestelmän on osoitettu olevan suoraan siirrettävissä ihmissoluihin toimittamalla samanaikaisesti plasmideja, jotka ilmentävät Cas9-endonukleaasia ja tarvittavia crRNA-komponentteja.

Kuva otettu https://www.computescotland.com/crisprcas9-genome-editing-8111.php