1. KRAS exon 2 (kodonit 12/13) ja exon 3 (kodoni 61) – mutaatiotesti: Cobas® KRAS-Mutaatiotesti in Vitro-diagnostiikkaan (Roche).
Cobas® KRAS-Mutaatiotesti on reaaliaikainen PCR-testi KRAS-geenin somaattisten mutaatioiden kvalitatiiviseksi osoittamiseksi ekson 2: ssa (kodonit 12/13) ja ekson 3: ssa (kodoni 61) käyttäen 100 ng: n DNA-syöttöä. Testillä voidaan havaita 19 KRAS-mutaatiota. Mutaatioiden esiintyminen havaitaan analyyttisellä spesifisyydellä, joka on vähintään 99% ja havaitsemisraja vähintään 5% mutanttitasolla villin tyypin genomi-DNA: n taustalla.
Cobas® KRAS-Mutaatiotesti perustuu kahteen pääprosessiin: 1) näytteen manuaalinen valmistelu genomisen DNA: n saamiseksi yhdestä tai kahdesta 5 µm: n paksuisesta osasta FFPE CRC-kudosta, joka sisältää vähintään 10% kasvainsoluja, 2) kohde-DNA: n PCR-monistaminen käyttämällä komplementaarisia pohjustuspareja ja kahta fluoresoivalla väriaineella merkittyä oligonukleotidisondia. Käytetyt primer-parit määrittelevät 85 emäsparin sekvenssin eksonille 2, joka sisältää KRAS-kodonit 12 ja 13, ja 75 emäsparin sekvenssin eksonille 3, joka sisältää Kras-kodonin 61 ihmisen genomisessa DNA: ssa. Yksi luotain on suunniteltu havaitsemaan Kras-kodonin 12/13 sekvenssi eksonissa 2 ja toinen luotain on suunniteltu havaitsemaan KRAS-geenin eksonissa 3 oleva Kras-kodoni 61-sekvenssi. Mutaatioiden havaitseminen tapahtuu sulamiskäyräanalyysillä Cobas z 480-analysaattorilla (1).
2. KRAS-Mutaatiotesti v2 (LSR)
KRAS-Mutaatiotesti v2 (LSR) on alleelispesifinen reaaliaikainen PCR-testi ekson 2 -, 3-ja 4-mutaatioiden kvalitatiiviseksi osoittamiseksi ja tunnistamiseksi V-Ki-ras2 Kirsten rotan sarkoomavirus onkogeeni homolog (KRAS) – geenissä formaliinikiinteästä, parafiiniin upotetusta kudoksesta (ffpet). Testi on suunniteltu havaitsemaan 28 ainutlaatuista mutaatiota. Mutaatioiden esiintyminen havaitaan analyyttisellä spesifisyydellä, joka on vähintään 99% ja havaitsemisraja vähintään 1% mutanttitasolla villin tyypin genomi-DNA: n taustalla.
KRAS-Mutaatiotesti v2 (LSR) perustuu kahteen prosessiin: 1) näytteiden manuaalinen valmistelu genomisen DNA: n saamiseksi FFPET: stä ja 2) PCR-monistus ja kohde-DNA: n osoittaminen komplementaarisilla primer-pareilla ja oligonukleotidikoettimilla, jotka on merkitty fluoresoivilla väriaineilla.
KRAS-Mutaatiotestissä v2 (LSR) käytetään alukkeita, jotka määrittelevät kullekin kohdemutaatiolle spesifiset emäsparin sekvenssit. Monistumista tapahtuu vain Kras-geenin alueilla alkulukujen välissä; koko geeni ei monistu. Kohdennetut KRAS-sekvenssit vaihtelevat 79-114 emäsparin välillä. Mutaation havaitseminen tapahtuu PCR-analyysillä Cobas z 480-analysaattorilla. (1)
3. BRAF/NRAS-Mutaatiotesti (LSR)
BRAF/NRAS-Mutaatiotesti (LSR) on reaaliaikainen ALLEELISPESIFINEN PCR-testi proto-onkogeeni B-Raf (BRAF)-geenin ekson 11-ja 15-mutaatioiden sekä neuroblastoma RAS-viruksen onkogeenihomologigeenin (NRAS) – geenin ekson 2 -, 3-ja 4-mutaatioiden osoittamiseksi ja tunnistamiseksi formaliinikiinteästä, parafiiniin upotetusta kudoksesta (ffpet).
testi on suunniteltu havaitsemaan 36 ainutlaatuista mutaatiota. Mutaatioiden esiintyminen havaitaan analyyttisellä spesifisyydellä, joka on vähintään 99% ja havaitsemisraja vähintään 5% mutanttitasolla villin tyypin genomi-DNA: n taustalla.
BRAF/NRAS-Mutaatiotesti (LSR) perustuu kahteen pääprosessiin: 1) näytteiden manuaalinen valmistelu genomisen DNA: n saamiseksi FFPET: stä ja 2) PCR-monistus ja kohde-DNA: n osoittaminen komplementaarisilla primer-pareilla ja oligonukleotidikoettimilla, jotka on merkitty fluoresoivilla väriaineilla.
BRAF / NRAS-Mutaatiotestissä (LSR) käytetään alukkeita, jotka määrittelevät kullekin kohdemutaatiolle spesifiset emäsparin sekvenssit. Monistumista tapahtuu vain BRAFIN tai NRAS-geenien alueilla alkulukujen välissä; koko geeni ei monistu. BRAF-sekvenssit vaihtelevat 101-120 emäsparin välillä. NRAS-sekvenssit vaihtelevat 94-121 emäsparin välillä. Mutaation havaitseminen tapahtuu PCR-analyysillä Cobas z 480-analysaattorilla. (2)
kliininen implisiittisyys
Kras ja kansalliset sääntelyviranomaiset ovat läheistä sukua RAS-onkogeeniperheelle, ja jommankumman geenin mutaatiot kodoneissa 12, 13 (ekson 2), kodoni 61 (ekson 3) ja kodoni 146 (ekson 4) nostavat guanosiinitrifosfaattiin sitoutuneiden RAS-proteiinien pitoisuuksia. Yliaktiivinen RAS-signalointi edistää onkogeneesiä. Kolorektaalisyövässä (CRC) näiden kodonien KRAS-ja NRAS-mutaatioita havaitaan jopa 50%: ssa tapauksista, ja ne ennustavat vasteen puutetta EGFR-ANTIHOIDOLLE. Useimmat RAS-mutaatiot ovat PISTEMUTAATIOITA, joita esiintyy KRAS-eksonissa 2 (kodonit 12 tai 13; noin 40%). Muut RAS-mutaatiot ovat harvinaisempia, kun yleisimmät mutaatiot esiintyvät KRAS-eksoneissa 3 ja 4 ja NRAS-eksoneissa 2 ja 3 (3).
noin 50% melanoomista Harborin aktivoivista mutaatioista BRAFISSA. Yli 90% BRAF-mutaatioista aiheuttaa nukleotidin 1799 T>muutoksen, joka johtaa valiinin ja glutamiinihapon substituutioon kohdassa 600 (V600E). BRAF V600E-mutaatio aiheuttaa MAPK-reitin hallitsematonta signalointia, joka johtaa solujen liialliseen kasvuun ja proliferaatioon. Aktivoidun mutantin BRAF: n (BRAF-inhibiittorit) kohteena olevat aineet ovat osoittautuneet menestyksellisiksi potilailla, joilla on metastasoitunut melanooma, jossa on tämä mutaatio (1-3).
melanooman ennustavan arvon lisäksi BRAF V600E-mutaatiolla on ennustava arvo myös kolorektaalisyövässä ja keuhkosyövässä (NSCLC) (4, 5, 7). BRAF V600E-mutaatio esiintyy noin 10%: ssa metastaattisesta kolorektaalisyövästä, ja siihen on liittynyt mikrosatelliitin epävakautta (6). Kaiken kaikkiaan potilailla, joilla on BRAF-mutantti CRC, on alhainen vaste tavanomaisille hoidoille ja epäsuotuisa ennuste. BRAF V600-mutatoituneet melanoomat ovat herkkiä BRAF-inhibiittoreille, mutta BRAF V600 – mutatoituneet CRC: t eivät välttämättä ole yhtä herkkiä. EGFR: n aktivoituminen kolorektaalisyövässä saattaa selittää, miksi kolorektaalisyövillä on yleensä heikompi vaste BRAF-estäjille. Siksi on suositeltavaa aloittaa yhdistelmähoito EGFR-ja BRAF-estäjien kanssa.
BRAF V600E-mutaatiota esiintyy myös 3-5%: ssa kaikista keuhkosyövistä (7). Vaikka BRAF-estäjät ovat osoittautuneet menestyksellisiksi V600E: n mutaatiopositiivisilla ei-PIENISOLUISILLA potilailla, FDA on hyväksynyt yhdistelmähoidon BRAFIN ja MEK – estäjän kanssa ei-pienisoluisen keuhkosyövän (V600E) mutaation omaaville potilaille kansainvälisen, satunnaistamattoman, ei-vertailevan, avoimen tutkimuksen tulosten perusteella potilailla, joilla on paikallisesti vahvistettu BRAF V600E: n mutaatiopositiivinen metastaattinen ei-pienisoluinen keuhkosyöpä.
Näytevaatimukset
testiin hyväksyttävät näytteet ovat formaliinikiinnitettyjä, parafiiniin upotettuja kolorektaalisyövän kudosnäytteitä, joiden kiinnitysaika on 6-48 tuntia.
tilavuus
1 edustava parafiinilohko on suositeltava. Vaihtoehtoisesti resektionäytteiden osalta vaaditaan vähintään 5 (5 µm: n paksuista) eristämätöntä kudososaa (täydellinen RAS-testaus).
varastointi-ja lähetysohjeet
näytteet säilytetään huoneenlämmössä ja ne lähetetään.
rajoitukset
riittämätön kasvainsisältö ei välttämättä mahdollista KRAS/NRAS/BRAF-mutaatioiden toteamista: tarvitaan 10% kasvainsoluista. Tuumoripitoisuus arvioidaan ennen analyysiä ja tehdään makrodissektio. Muut kiinnitysaineet kuin formaliini tai pitkittynyt kiinnitysaika voivat johtaa riittämättömiin tuloksiin.
erityisvaatimukset
ei ole.
Kääntymisaika
5-7 työpäivää diakuvien ja parafiinilohkojen osalta.
- Li ym. Erittäin varmennettu määritys Kras-mutaation toteamiseksi keuhko -, Kolorektaali-ja haimasyövän kudoksesta ja plasmasta. Arch Pathol Lab Med. 2019 helmi;143:183-9
- Patten ym. Herkkä ja tarkka testi 36 BRAF-ja NRAS-mutaation samanaikaiseen havaitsemiseen. Journal of Clinical Oncology 2018 36:15
- Douillard jy ym. Panitumumabi-FOLFOX4-hoito ja RAS-mutaatiot kolorektaalisyövässä. N Engl J Med. 2013 Sep 12; 369 (11): 1023-34.
päivitetty 03.12.2019
