- tulokset
- KLF2-ekspressio vähenee monosyyttien aktivaation/erilaistumisen myötä makrofageiksi.
- KLF2 estää monosyyttien aktivaatiota ja Fagosyyttikykyä.
- KLF2 ei estä monosyyttien rekrytointia.
- KLF2 estää karrageenin aiheuttamaa tulehdusta.
- Klf2 Knockdownin vaikutus tulehdukselliseen Geeniekspressioon.
- KLF2 estää NF-kB: n ja AP-1: n Promoottoritoimintaa.
- KLF2 rekrytoi COACTIVATOR CBP-Associated Factor (PCAF) – yhdistävän mekanismin.
tulokset
KLF2-ekspressio vähenee monosyyttien aktivaation/erilaistumisen myötä makrofageiksi.
ymmärtääksemme paremmin KLF2: n roolia immuunisolujen, kuten monosyyttien/makrofagin, säätelyssä arvioimme ensin klf2: n ilmentymistä ihmisen primaarisissa monosyyteissä. Kuten kuvassa. 1 Vasen KLF2-ilmentymä on vankka ihmisen primaarisissa monosyyteissä ja voimakkaasti vähentynyt erilaistumalla makrofageiksi 5 päivän kuluttua. KLF2: n ilmentyminen ihmisen monosyyttisolulinjassa THP-1 oli paljon vähäisempää kuin primaarisissa ihmisen monosyyteissä. Ekspressio kuitenkin väheni entisestään, kun näitä soluja käsiteltiin LPS: llä tai 12-o-tetradekanoyyliforbol-13-asetaatilla, kahdella solun aktivaatiota tai erilaistumista aiheuttavalla aineella (Kuva. 1 A Oikein).
KLF2-ilmentymä aktivoiduissa monosyyteissä in vitro ja In vivo. (A) klf2 mRNA: n määrä vähenee monosyyttien erilaistuessa ja aktivoituessa. Northern blot-analyysi tehtiin, kun ihmisen monosyyteistä ja makrofageista (vas.) saatiin 10 µg kokonais-RNA: ta kaistaa kohti. Samanlainen analyysi tehtiin 20 µg: lla kokonais-RNA: ta THP-1-soluista, joita viljeltiin FBS-vapaana 36 tunnin ajan sen jälkeen, ja lisäksi 6 h: n stimulaatiolla LPS: llä tai 12-o-tetradekanoyyliforbol-13-asetaatilla (oikealla). (B) klf2: n ekspressio vähenee ateroskleroosia sairastavien potilaiden monosyyteissä. Kvantitatiivinen reaaliaikainen RT-PCR tehtiin monosyyteillä, jotka eristettiin 14 potilaasta (potilaasta) ja 14 terveestä iästä vastaavasta kontrolliryhmästä (kontrolliryhmästä). Määritettyjen geenien ekspression tasot normalisoitiin kontrolligeenin eukaryoottisella translaation aloituskertoimella.
seuraavaksi pyrittiin selvittämään, säädelläänkö klf2: n ilmentymistä tulehduksellisessa ympäristössä in vivo. Monosyyttinen aktivaatio on keskeinen patofysiologinen tapahtuma ateroskleroosin, kroonisen matala-asteisen tulehdustilan kehityksessä, joten päättelimme, että KLF2: n ilmentyminen voi vähentyä näillä potilailla (11). Tutkimme ryhmä 14 Ikä-matched normaali koehenkilöiden ja 14 potilasta, joilla on laaja ateroskleroosi (≈50% kanssa historian sepelvaltimon revaskularisaatio), jotka on kerrostunut alin ja korkein tasot Finkel–Biskis–Jinkins osteosarkooma geeni (Fos), vastaavasti, joka on osoitettu toimivan markkeri tulehdus (12). Kuten kuvassa. 1 B, KLF2: n ilmentyminen väheni merkitsevästi, ≈30% potilaista. Sen sijaan klf3: lla, KLF6: lla, KLF11: llä ja KLF13: lla ei havaittu merkitsevää vaikutusta. Aiemman tutkimuksemme mukaisesti Fos: n ilmentyminen lisääntyi merkittävästi sepelvaltimotautia sairastavilla potilailla (12).
KLF2 estää monosyyttien aktivaatiota ja Fagosyyttikykyä.
vasteena tulehdusärsykkeille monosyytit ilmentävät tulehdusreaktiota edistävien tekijöiden ja sytokiinien/kemokiinien kohonneita pitoisuuksia ja parantavat fagosyyttikykyä. Selvittääksemme KLF2: n roolia monosyyttien toiminnassa teimme yli-ekspressiotutkimuksia. THP-1-solut infektoitiin joko kontrollipuhtaalla viruksella (ev) tai KLF2: lla (Ad-KLF2) 24-48 tunnin ajan, minkä jälkeen niitä stimuloitiin LPS: llä 2 ja 6 tunnin ajan, kuten kuvassa esitetään. 2 A, ev-infektoituneiden solujen hoito LPS: llä (25 ng/ml) johti syklo-oksygenaasi (COX)-2: n, kudostekijän ja monosyyttikemoattractanttiproteiini (MCP)-1 mRNA: n voimakkaaseen induktioon. Tätä induktiota sen sijaan heikennettiin huomattavasti KLF2-infektoituneissa soluissa (Fig. 2 A). Samanlaisia vaikutuksia havaittiin myös hiiren monosyyttisolulinjassa J774a (tietoja ei näy). Lisäksi klf2: n yliekspressio esti voimakkaasti erilaisten sytokiinien ja kemokiinien eritystä. Kuten kuvassa. 2 B, KLF2-yliekspressio heikensi LPS-välitteistä induktiota seuraaville tekijöille: CD40L (49, 6%), makrofagi-tulehduksellinen proteiini 1α (48, 4%), makrofagi-tulehduksellinen proteiini 1β (64, 2%), IL-1β (55, 0%), IL-8 (79, 1%), TNF-α (50, 2%) ja MCP-1 (68, 8%). Tämä vaikutus oli erityinen, koska useiden muiden relevanttien kasvutekijöiden (TGFß1, trombosyyttipohjainen kasvutekijä ja granulosyytti/makrofagiyhdyskuntaa stimuloiva tekijä), sytokiinien/kemokiinien (IL-4, IL-10, IL-12P40, IL-12P70, IL-1α ja IFN-γ) tai matriisia muuttavien entsyymien (matriisimetalloproteinaasityypit 1, 2, 3 ja 9) pitoisuuksilla ei havaittu merkitsevää vaikutusta (tietoja ei näy).
KLF2 yli-ekspressio estää monosyyttien aktivaatiota. (A) KLF2-yliekspressio estää tulehduksellisen geeniekspression. Northern blot-analyysi tehtiin osoitettujen tekijöiden osalta siten, että THP-1: n kokonais-RNA: ta oli 10 µg / kaista kohti yli-ilmentyneenä Ad-KLF2: lla (KLF2) tai EV: llä kontrollina LPS: llä tehtävän stimulaation jälkeen eri aikapisteissä kuten on ilmoitettu. (B) KLF2-yliekspressio estää sytokiinin/kemokiinin muodostumista. Miljoona THP-1-solua millilitrassa sai ev-tai KLF2-adenoviruksen 24 tunnin ajan ja sen jälkeen LPS-stimulaation vielä 2 tunnin tai 6 tunnin ajan. stimulaation jälkeen viljelmän supernatantit kerättiin talteen ja arvioitiin valonheittimen Proteomiryhmillä/multiplex sandwich ELISA-menetelmällä. Jokainen näyte arvioitiin kahtena kappaleena, ja kaksi erillistä koetta arvioitiin biologisten merkkiaineiden paneelille. Samanlainen tulos havaittiin eri kokeissa. C) KLF2 estää fagosytoosia. EV-ja KLF2-infektoituneita THP-1-soluja stimuloitiin LPS: llä (25 ng/ml), ja Fagosytoosimääritys tehtiin materiaaleissa ja menetelmissä kuvatulla tavalla. (D ja E) KLF2 ei estä monosyyttistä rekrytointia. D-tutkimuksessa esitetään edustava virtaussytometrinen analyysi GFP-positiivisista soluista, jotka on rekrytoitu vatsaonteloon tioglykolaatti-injektion jälkeen. Aidattu palkki osoittaa GFP-positiivisten solujen prosenttiosuuden analyysissä. E-ryhmässä esitetään yhteenveto tuloksista, joiden mukaan N = 5 hiirtä ryhmää kohti. F) materiaaleissa ja menetelmissä kuvattu immuunipuutoshiirien käyttövalmiiksi saattaminen klf2-yliekspressoiduilla J774a-soluilla paljastaa turvotuksen vähentyneen sekä 1-h että 2-h karrageenin aiheuttaman tulehduksen aikana. Tiedot ilmoitetaan ± SEM (n = 4). (G) KLF2 vähentää kudoksen turvotusta. Karrageeniin ruiskutettujen tassujen poikkileikkaukset (×100 suurennos) värjättiin hematoksyliinilla ja eosiinilla. KLF2-yliekspressoiduilla monosyyteillä ennallistettujen hiirten käpälissä näkyy nuolilla merkittyä ekstravasoitunutta nestettä. Maamerkit, kuten lihakset (M) ja luut (B), on merkitty. (H ja I) Klf2: n Knockdown lisää proinflammatorista geeniekspressiota. J774a-solut transfektoitiin epäspesifisillä (NS) tai siRNA: lla KLF2: een (siKLF2) 48-h: n kohdegeenejä varten, jotka arvioitiin pohjoisella blot-analyysillä (H) ja kvantitatiivisella reaaliaikaisella PCR-analyysillä (I). Kuvaajat I edustavat yhdistettyjä tietoja kolmesta kokeesta.
aktivoidun monosyytin/makrofagin klassinen ominaisuus on fagosytoosi. Selvittääksemme, vaikuttaako KLF2-yliekspressio monosyyttien fagosyyttiseen kykyyn, yliekspressoimme KLF2: ta tai kontrollia (ev) THP-1-soluissa, stimuloimme LPS: llä ja arvioimme näiden solujen kykyä ottaa Teksasin punamerkittyjä zymosan a-biopartikkeleita. Kuten kuvassa. 2 C, kontrolloivat viruksen saastuttamia soluja, jotka söivät zymosanin biopartikkelit. KLF2: ta ilmentävien monosyyttien sisäänotto sen sijaan väheni huomattavasti (Kuva. 2 C). Nämä tiedot yhdessä osoittavat, että KLF2 voi estää monosyyttien sytokiinien/kemokiinien eritystä ja fagosytoosia.
KLF2 ei estä monosyyttien rekrytointia.
yritimme seuraavaksi arvioida KLF2: n vaikutusta monosyyttien toimintaan in vivo. Vamman tai tulehduksellisen ärsykkeen seurauksena monosyytit siirtyvät verenkierrosta kudoksiin. Tutkimme ensin, muuttuiko klf2-ilmentymä monosyyttien rekrytointiin. Minimoidaksemme muiden solutyyppien osuuden käytimme C. B-17-Scid-beige-hiiriä, joilla on puutteita T -, B-ja luonnollisissa tappajasoluissa. Nämä eläimet (N = 5 ryhmää kohti) altistettiin sen jälkeen koko kehon säteilytykselle, ja ne saatettiin ennalleen joko kontrolliviruksen (ev) tai KLF2: n adenovirusinfektoimilla j774a-soluilla (kuvattu materiaaleissa ja menetelmissä). Tämän jälkeen eläimille annettiin tioglykolaattia (voimakas kemiallinen ärsyttävä aine, joka aiheuttaa monosyyttien aktivoitumista), ja GFP-positiivisten solujen määrä arvioitiin 48 tunnin kuluttua virtaussytometrisellä analyysillä. Kuten kuvassa. 2 C ja D, KLF2 ei estänyt GFP+ J774a-monosyyttien rekrytointia vatsakalvononteloon. Havaitsimmekin toistettavasti, että KLF2-transduktioiduissa eläimissä GFP + – solujen määrä lisääntyi merkittävästi. Nämä tiedot viittaavat siihen, että KLF2 ei estä vaan pikemminkin lisää monosyyttistä rekrytointia tulehduskohtaan.
KLF2 estää karrageenin aiheuttamaa tulehdusta.
rekrytoinnin ja kudoksiin siirtymisen jälkeen monosyytit erittävät sytokiineja, kemokiineja ja kasvutekijöitä ylläpitääkseen tulehdusvastetta. Kuten kuvassa. 2 B, huomasimme, että KLF2-yliekspressio heikensi useiden sytokiinien ja kemokiinien valmistusta. Selvittääksemme, vaikuttaako KLF2 monosyyttiseen proinflammatoriseen toimintaan, käytimme vakiintunutta mallia tulehdukseen: karrageenin indusoimaa jalkapöydän injektiota. Injection tämän kemikaalin on aiemmin osoitettu toistettavasti aiheuttaa tulehdusvasteen ominaista tassu turvotus (13-15). C. B-17-Scid-beige-hiiret (N = 4 ryhmää kohti) säteilytettiin edellä kuvatulla tavalla, liuotettiin uudelleen kontrolli-tai KLF2: ta ilmentävillä j774a-soluilla ja altistettiin sitten karrageeniruiskeella jalkapannassa (kuvattu materiaaleissa ja menetelmissä). Tassun tilavuus määritettiin pienille määrille muunnetulla hydropletismometrillä (Ugo Basile, Milano). Kuten kuvassa. 2 F, EV-tartunnan saaneilla eläimillä tassun tilavuus kasvoi 17 ± 1, 08-mm3 ja 23, 3 ± 3, 05-mm3 karrageeni-injektion jälkeen. Klf2: ta ilmentävillä j774a-soluilla ennalleen saatetuilla eläimillä tassun tilavuus kasvoi karrageenin injektion jälkeen vain 6, 25 ± 0, 85-mm3 ja 7, 5 ± 0, 95-mm3 (Kuva. 2). Tämän karkean vaikutuksen mukaisesti tassujen histologinen analyysi paljasti vähentyneen nesteen ekstravasaation, joka johtaa turvotuksen muodostumiseen (Kuva. 2 G, nuolia).
Klf2 Knockdownin vaikutus tulehdukselliseen Geeniekspressioon.
klf2: n merkityksen määrittämiseksi monosyyttisessä tulehduksellisessa geeniekspressiossa tehtiin myös pieniä häiritseviä RNA (siRNA)-välitteisiä knockdown-tutkimuksia. Kuten kuvassa. 2 H verrattuna hoitamattomiin (kontrolli -) ja epäspesifisiin siRNA-käsiteltyihin soluihin Klf2: n (≈60% knockdown) kaatuminen J774a-soluissa johti tulehdusgeenien, kuten MCP-1: n, induktioon ja vaatimattomampaan vaikutukseen COX-2: n ja kudostekijän ilmentymistasoihin. Nämä tulokset tarkistettiin myös reaaliaikaisella PCR-analyysillä(Kuva. 2).
KLF2 estää NF-kB: n ja AP-1: n Promoottoritoimintaa.
KLF2 voi voimakkaasti estää MCP-1: n, COX-2: n ja kudostekijän LPS-välitteistä induktiota (Kuva. 2 A). Näitä kohteita säätelevät tunnetusti transkriptioreitit, kuten NF-kB ja AP-1. Perustelimme, että periaatteessa KLF2 saattaa estää näitä reittejä useilla tasoilla, kuten ilmentymisen, DNA: n sitoutumisen tai transkriptiotoiminnan induktion.
keskityimme ensin NF-kB: hen ottaen huomioon sen keskeisen roolin tulehduksessa. KLF2: n yliekspressio ei muuttanut P65: n kertymistä ydinenergiaan eikä IKB-kinaasin (IKK) α: n ja IKKy: n (Fig. 3 A). KLF2-yliekspressio ei myöskään muuttanut IKKa: n, IKKß: n ja IKKy: n IKB: n fosforylaation tai hajoamisen tai sytoplasmatasojen kinetiikkaa (Kuva. 3). Näiden havaintojen mukaisesti KLF2 ei vaikuttanut NF-kB: n sitoutumiseen DNA: han. Kuten kuvassa. 3 C, kontrolliviruksen infektoimien solujen (ev) hoito LPS: llä indusoi yhden suuren kaistan. Kilpailu-ja supershift-tutkimukset vahvistivat, että tämä kaista edustaa NF-κΒ: tä. KLF2-yli-ilmentyvissä soluissa havaittiin lähes samanlainen NF-kB: n sitoutuminen. Sen arvioimiseksi, voiko KLF2 vaikuttaa NF-kB-välitteiseen transkriptioaktivaatioon, tehtiin gene reporter-määrityksiä. Kuten kuvassa. 3 D, transfektio p65 kanssa NF-kB luciferase reporter plasmid indusoi transkription toimintaa ≈11-kertainen. Tämä induktio väheni voimakkaasti KLF2: n läsnä ollessa, mikä viittaa siihen, että KLF2 estää NF-kB: n transkriptiotoimintaa. Samanlaisia klf2: n vaikutuksia havaittiin AP-1-reitillä (Kuva. 5 A-C, joka julkaistaan tukitietona PNAS-verkkosivustolla).
KLF2 estää NF-kB: n transkriptiotoiminnan. (A ja B) KLF2 ei muuta NF-kB-reitin komponenttien ilmentymistä. THP-1-solut infektoituivat adenoviruksella (EV tai KLF2), stimuloitiin LPS: llä 30 minuutin, 1 tunnin tai 2 tunnin ajan ja arvioitiin ilmoitettujen tekijöiden ilmentymiseksi Western blot-analyysillä käyttäen ydin-ja sytoplasmauutteita. (C) KLF2 ei vaikuta NF-kB DNA: n sitoutumiseen. THP-1-soluja tartutettiin adenoviruksella (EV tai KLF2) ja stimuloitiin LPS: llä 1 tunnin ajan, ja ydinuutteita käytettiin geelivirtausmäärityksissä. NF-kB-taajuusalue on merkitty nuolella. Spesifisyys varmistettiin kilpailu-ja superhiihtotutkimuksilla. (D) KLF2 estää p65-välitteistä NF-kB-aivotärähdyksen transaktivaatiota. Ohimeneviä transfektiotutkimuksia tehtiin raw264.7-soluilla, joilla oli ilmoitettu rakenne. Nämä kokeet tehtiin kolmena kappaleena ja toistettiin vähintään kolme kertaa.
KLF2 rekrytoi COACTIVATOR CBP-Associated Factor (PCAF) – yhdistävän mekanismin.
yhdessä, tulokset kuviossa. 3 Osoita, että KLF2 voi estää NF-kB-välitteistä transaktivaatiota riippumatta näiden tekijöiden DNA-sitoutumiseen kohdistuvista vaikutuksista. Yksi mahdollinen mekanismi on kriittisten koaktivaattoreiden rekrytointi. Esimerkiksi optimaalinen NF-kB-sitoutuminen edellyttää vuorovaikutusta useiden keskeisten koaktivaattoreiden kanssa, kuten steroidireseptorikoaktivaattori (SRC)-1, PCAF ja P300/CBP. KLF2 voi olla vuorovaikutuksessa yhden tai useamman näistä tekijöistä kanssa, rekrytoida ne pois NF-kB: stä ja siten vähentää NF-kB-välitteistä transkriptiotoimintaa.
PCAF: n roolin määrittämiseksi KLF2-välitteisessä NF-kB-transkriptioaktiivisuuden estossa teimme kotransfektiotutkimuksia eksogeenisella PCAF: llä. Pcaf: n (mutta ei p300: n) transfektio; tietoja ei näy) pelasti merkittävästi KLF2-välitteisen tukahduttamisen NF-kB concatemer (Kuva. 4 A). Osittainen pelastus havaittiin myös KLF2: n kyvyssä estää AP-1: n transkriptiotoimintaa (Kuva. 5D). Selvittääksemme, ovatko KLF2 ja PCAF vuorovaikutuksessa keskenään, suoritimme GST pull-down-ja coimmunoprecipitation-määrityksiä. Käyttämällä in vitro litteroituja ja käännettyjä tuotteita, huomasimme, että KLF2 ja PCAF voivat olla vuorovaikutuksessa suoraan soluttomassa järjestelmässä (Kuva. 4). Jotta tiedämme, sitoutuuko PCAF KLF2: een in vivo, yliekspressoimme KLF2: ta (hemagglutiniini-tagged) ja PCAF: tä (Flagglutiniini-tagged) COS-7-soluissa. Immunopresipitaatio anti-Flag-vasta-aineella, jota seurasi Western blottaus anti-hemagglutiniini-vasta-aineella, osoitti, että KLF2 sitoutuu pcaf: hen soluissa (Kuva. 4 C).
KLF2 on suoraan vuorovaikutuksessa PCAF: n kanssa. (A) PCAF-yliekspressio pelastaa KLF2-välitteisen NF-kB-transkriptiotoiminnan eston. Ohimeneviä transfektiotutkimuksia osoitetuilla plasmideilla tehtiin raw264.7 soluissa edellä kuvatulla tavalla (N = 9-12 ryhmää kohti). (B) KLF2 vuorovaikuttaa PCAF: n kanssa soluttomassa järjestelmässä. Sitoutumiskokeita tehtiin käyttämällä in vitro transkriboituja ja käännettyjä pcaf-ja GST-KLF2-valmisteita (TNT). Autoradiografiatiedot (ylempi) ja geelin Coomassie-värjäys (Alempi)osoittavat kuormitusmäärän ja PCAF-proteiinin (∗). Tulo on 2% PCAF-TNT: stä. C) KLF2 ja PCAF vaikuttavat toisiinsa soluissa. COS-7-solut transfektoitiin merkityillä konstruktioilla, ja immunopresipitaatiotutkimuksia tehtiin materiaaleissa ja menetelmissä kuvatulla tavalla. (D) KLF2 vähentää PCAF: n rekrytointia. THP-1-solut infektoitiin Ad-KLF2-tai EV-viruksella, ja niitä stimuloitiin LPS: llä, ja COX-2-promoottorin ilmoitettujen tekijöiden osalta suoritettiin Sirumääritykset (KS.materiaalit ja menetelmät).
selvittääksemme, ovatko havaittujen vaikutusten taustalla olevat mekanismit toimivia in vivo, teimme kromatiinin immunoprecipitation (ChIP) – tutkimuksia. Odotetusti THP-1-solujen LPS-stimulaatio johti P65: n ja PCAF: n rekrytointiin COX-2: n promoottoriin (Kuva. 4 D). Lisäksi havaittiin hh3: n ja HH4: n samanaikaista asetylaatiota. KLF2: n yliekspression yhteydessä PCAF: n rekrytointi ja histoniasetylaatio ovat kuitenkin molemmat voimakkaasti heikentyneitä (Kuva. 4 D). Gel-shift-määritystemme mukaisesti klf2: lla ei havaittu merkittävää vaikutusta P65-värväykseen.
