Keskustelu
havaittu korkean proteaasiaktiivisuuden tuotanto jatkuvan k-viljelyn aikana. sedentarius helpotti kahden proteaasin, P1: n ja P2: n, puhdistumista atsokaseiinia, insuliinin β‐ketjua, ihmisen kalluksesta erotettua keratiinia ja käsittelemätöntä kallusta vastaan. Näiden entsyymien yleiset ominaisuudet, mukaan lukien substraattialue, optimaalinen lämpötila ja pH sekä herkkyys proteaasinestäjille, viittaavat siihen, että ne ovat biokemiallisesti samanlaisia ja kuuluvat todennäköisesti emäksisiin seriiniproteaaseihin. Näitä proteaaseja tuottavat monenlaiset mikro-organismit ja ne toimivat endopeptidaaseina (Rao et al. 1998).
siitä, voidaanko entsyymit luokitella myös keratinaaseiksi, on kuitenkin edelleen kiistaa. Keratinaasien pitäisi määritelmän mukaan pystyä hydrolysoimaan puhdasta natiivia keratiinia. Keratiinin uuttaminen voidaan kuitenkin saavuttaa vain denaturointiaineilla tehdyllä etukäsittelyllä, joka erottaa sen muista kuin keratiiniproteiineista. Mekaaniset käsittelyt, kuten pallon jauhaminen, johtavat disulfidisidosten pilkkoutumiseen, mikä tekee proteiinista herkemmän proteolyyttiselle pilkkomiselle proteaasien kuten trypsiinin ja proteinaasi K: n avulla, joita ei luokitella keratinaaseiksi (Noval and Nickerson 1959). Samoin kuumasteriloitujen substraattien käyttöä keratinaasimäärityksissä on myös kritisoitu, koska kuumentaminen voi aiheuttaa keratiinin denaturaatiota.
vaikka tässä tutkimuksessa käytettiin entsyymisubstraattina hienoksi jauhettua kallusta, supernatanttiviljelmä tehosi ehjän kalluksen palasia vastaan. Siksi, vaikka nämä kaksi proteaasia eivät ole varsinaisesti keratinaaseja, ne hajottavat ihmisen kallusta in vitro ja on jonkin verran näyttöä siitä, että tämä tapahtuu myös In vivo (Nordstrom et al. 1987).
proteaasit on myös luokiteltu keratinaaseiksi niiden vähentyneeseen keratiiniin kohdistuvan vaikutuksen vuoksi, jolloin pelkistäviä aineita on joko lisätty entsyymimääritysseokseen tai käytetty keratiinin uuttamisessa. Vaikka useiden ihobakteerien keratinolyyttistä aktiivisuutta on tutkittu käyttämällä substraattina ”kotoperäistä” keratiinia, pelkistävä aine, ditiotreitoli (DTT), sisällytettiin määritysseokseen. Esimerkiksi kun Staphylococcus epidermidisin ilmeistä keratinaasiaktiivisuutta tutkittiin ilman DTT: tä, aktiivisuutta ei havaittu (Mikx and de Jong 1987). Samoin Seriiniproteaasi Candida albicans-hajoavista keratiineista, jotka oli uutettu ihmispohjien marraskedesta 8 mol l−1 urealla Tris-HCl: ssä ja β‐merkaptoetanolissa (Hattori et al. 1984). Tässä tutkimuksessa P1 ja P2 hydrolysoivat keratiinia, joka oli uutettu ihmisen jalkakalluksesta urean ja β‐merkaptoetanolin avulla, mutta mikä tärkeintä, se pystyi myös hajottamaan käsittelemätöntä kallusta.
marraskesi ja ihmisen kallus on monimutkainen ja vakaa rakenne, jonka tärkein komponentti on keratiini. Keratiinia varten on 30 ihmisen geeniä, joista 18 ilmenee iholla (Fuchs 1995). Yhteenveto keratiini tietokanta on osoittanut, että jokainen keratiini on potentiaalisia pilkkominen sivustoja proteaasien ja Asp-Arg ja Gly-Arg ovat yleisimpiä. Jos keratiinifilamentit ovat aluksi rikki näissä kohdissa, on mahdollista, että näiden pienempien yksiköiden asteittainen hajoaminen tapahtuu toissijaisissa pilkkomiskohdissa, jolloin syntyy peptidifragmenttien kokoluokka, kuten ihmisen kalluksesta erotettuihin keratiineihin kohdistuvan proteaasihyökkäyksen analyysi osoittaa. Tulokset esitetty Fig. 3b ilmoitetaan kaksi pH-optimaa P2: n kovettumaa heikentävälle aktiivisuudelle. Yksi mahdollinen selitys on, että näytteessä on kaksi entsyymiä. Tämä vaikuttaa epätodennäköiseltä, koska käytetty entsyyminäyte oli erittäin puhdistettu, kuten HOPEAVÄRJÄYKSELLÄ varustettu sivu osoittaa (KS. 1, kaista 6). Ei voida sulkea pois mahdollisuutta, että puhdistetussa P2‐näytteessä on kaksi kovettumia hajottavaa entsyymiä, joiden liikevoima sivulla on hyvin samanlainen. Sama näyte testattiin kuitenkin samoilla puskureilla atsokaseiinimäärityksellä, ja vain yksi pH-optimi havaittiin pH 10·2: ssa. Vaihtoehtoinen selitys on, että monimutkainen kallus substraatti/entsyymi vuorovaikutus eri pHs on tasapaino entsyymin toimintaa ja hienovaraisia konformaatio muutoksia substraatin, joka johtaa dual pH optima.
tämä tutkimus on osoittanut, että K. sedentarius tuottaa kahta solunulkoista proteaasia, joilla on kovettumaa hajottavaa aktiivisuutta. Perustiedot niiden suhteellisista molekyylikooista, niiden pIs, on määritetty. Tavanomaisia entsyymikineettisiä tutkimuksia ei kuitenkaan voitu käsitellä, koska näissä in vitro-kokeissa käytetty luonnollinen substraatti oli veteen liukenematon polymeerien monimutkainen seos. P2: n lisääntyneellä entsyymiaktiivisuudella 800 mmol 1-1 suolan läsnä ollessa voi olla merkitystä mikro-organismin selviytymiselle ihmisen iholla, jonka suolapitoisuus muuttuu riippuen ekcriinirauhasen aktiivisuudesta, joka määräytyy henkilön liikunnanopeuden ja ympäristön lämpötilan mukaan. Natriumkloridin vaikutukseen liittyviä mekanismeja ei ole käsitelty. Alustavasti on ehdotettu, että natriumkloridi voi vaikuttaa joko entsyymin ja substraatin tertiäärirakenteeseen tai molempiin, jotta entsyymien aktiivisen kohdan pääsy substraatin tiettyihin pilkkoutumiskohtiin paranisi.
yksinkertaisin selitys havaituille tuloksille on, että K. sedentariuksen supernatantissa on kaksi kallusta hajottavaa entsyymiä, seriiniproteaasia, jotka myös liuottavat kalluksessa olevaa ihmisen keratiinia. On mahdollista, että K. sedentarius tuottaa yhden proteaasin, jota koodaa yksi geeni, ja että autokatalyyttinen tai muu proteaasitoiminta tuottaa kaksi molekyylipainoltaan erilaista entsyymiä. Vaihtoehtoisesti on olemassa kaksi geeniä, jotka koodaavat kahta toisistaan riippumatonta ja läheistä entsyymiä. Jälkimmäistä hypoteesia tukee aiempi tutkimus (Holland et al. 1992). K. sedentariuksen jatkuvasta viljelmästä vakaassa tilassa eri laimennusnopeuksilla sivulla määritettynä ja kaseiinilla päällystettynä otetuissa näytteissä havaittiin kaksi entsyymiä, joista toinen oli konstitutiivinen ja toinen havaittiin suurilla pitoisuuksilla alhaisilla laimennusnopeuksilla. Tärkeää on, että laimennusnopeuksilla, jotka olivat lähellä µmax, sitä ei havaittu. P1‐polypeptidien (21 jäämää) ja P2-polypeptidien (15 jäämää) n-terminaalisen aminohapposekvenssin määrittäminen osoitti niiden olevan täysin erilaisia. Tämä tulos yhdessä jatkuvan viljelyn kokeen tietojen kanssa viittaa siihen, että entsyymit ovat itsenäisesti koodattuja.
tämän tutkimuksen tulokset ovat vahvistaneet hypoteesia, jonka mukaan K. sedentariuksen spesifiset proteaasit voivat selittää kuoppaiselle keratolyysille ominaisen kalluksen hajoamisen. Tähänastinen näyttö viittaa myös siihen, että kyseessä on kaksi proteaasia ja että ne ovat aktiivisia ihokohdan pH: ssa, pH: ssa 6·3-6·9 (Marshall et al. 1988). In vitro-kokeista saatujen tulosten tulkinta in vivo-ympäristöön voidaan kyseenalaistaa, vaikka substraattina käytettiin ihmisen kallusta. Ihanteellista olisi ottaa ihmisen ihosta koepaloja, mukaan lukien alueet, joilla on normaali ja kuoppainen iho. Proteaasien esiintyminen ja sijainti tai puuttuminen voidaan sitten määrittää histologisin menetelmin käyttäen monoklonaalisia vasta-aineita proteaasien ja K. sedentariuksen antureina. Eettistä hyväksyntää biopsioille ei kuitenkaan annettaisi vaaditusta paikasta eli jalan kantavasta kohdasta edustavalta ihmismäärältä. K. sedentariuksen osallistumista kuoppaiseen keratytoosiin keratiinia hajottavien proteaasien tuotantomekanismilla ei ole virallisesti todistettu. Hypoteeseja ei kuitenkaan ole kumottu, ja sen uskottavuus on vahvistunut tässä esitettyjen tulosten myötä. Vahvaa in vitro-näyttöä on esitetty siitä, että K. sedentarius ja sen solunulkoiset kovettumia hajottavat entsyymit liittyvät kuoppaiseen keratolyysiin. Normaalilla ihon pHs: lla ja pinnan nesteytyksellä näiden entsyymien tuotanto ja toiminta on vähäistä, P1 on aktiivisempi. Ympäristön olosuhteissa okkluusio ja huono hygeiini, ihon pH liikkuu ja hieman yli neutraalius. Nämä ehdot suosivat P2: ta. Molemmat entsyymit ovat mitä luultavimmin haaskaavia entsyymejä, joiden avulla K. sedentarius saa hiili-ja typpilähteitä, pieniä peptidejä, jotka ovat lukittuneet asukkaaseen ja liukenemattomaan kompleksipolymeeriin, keratiiniin. Tällä hetkellä näiden entsyymien tuotannon säätelyä ei tunneta, kuten ei myöskään niiden suhteellista osuutta kalluksen hajoamisessa in vivo. Kliinisten vaikutusten lisäksi keratinolyyttisillä proteaaseilla on huomattavaa arvoa kaupalliselle sektorille, koska ne ovat hyödyllisiä useissa teollisissa prosesseissa, mukaan lukien siipikarja‐ja nahkateollisuuden keratiinijätteen hajoaminen (Shih 1993; Onifade et al. 1998). K: n korkea keratinolyyttinen aktiivisuus. sedentarius-proteaasit suhteellisen alhaisissa lämpötiloissa ja pH: ssa ovat moniin muihin proteaasiin verrattuna mahdollisia näiden entsyymien sovelluksia bioteknisessä teollisuudessa.
