seeprakalan ylläpitoa ja kantoja: seeprakalaa (Danio rerio) kasvatettiin ja lavastettiin vakiintuneiden protokollien mukaan30.Käytetyt siirtogeeniset linjat olivat TG(kdr-l:ras-MCHERRY)s91631, Tg(fli1ep:Lifeact-EGFP)zf49532, Tg(fli1:myr-EGFP)ncv233, Tg(fli1:myr-MCHERRY)ncv134, Tg(fli1:Lifeact-mCherry)ncv733, Tg(fli1:GAL4FF)ubs37, Tg(AMK:EGFP-UCHD) ubs1835, TgBAC(pdgfrb:GFP)ncv2236 ja Tg (KDRL:EGFP)s84337. RIKEN Kobe Branchin (IACUC) eläinten laitoshoidon ja käytön komitea hyväksyi kaikki eläinkokeet.
plasmidit ja oligonukleotidit: Seeprakalat marcksl1a, marcksl1b ja fscn1a kloonattiin PCR: llä cDNA: sta 1 hiukkassuodattimen alkioita käyttäen NEB® PCR-Kloonauspakettia. Kaikki tässä tutkimuksessa käytetyt ilmentymärakenteet on tuotettu Gateway® – kloonauksen ja / tai In-Fusion® – kloonauksen avulla Tol2Kit38: n plasmidien avulla. Plasmidit, joissa on mutatoitunut Marcksl1a ja Marcksl1b, on tuotettu käyttäen Q5® Site-Directed mutagenesis kit (NEB) – järjestelmää. shRNA sisältää vektorit on rakennettu ligoimalla Shrna järjestyksessä EcoRI ja PmeI sivustoja alavirtaan U6 promoottori modified pEGFP-U6 vector39 (lahja zuoshang Xu, Addgene plasmid #19799). Ihmisen MARCKSL1: n kohdesarja on 5 ’- GTGTGAACGGAACAGATGATG-3’. Salattu shRNA sekvenssi 5′ – GAGTCATGGGTCAGTTATATG-3 ’ suunniteltiin marcksl1 shrnan ristiriitaiseksi sekvenssiksi (alleviivattu). Vektorit, jotka sisälsivät hiiren Marcksl1, Marcksl1-S120A/T148A/T183A (Marcksl1-AAA) ja Marcksl1-s120d/T148D/T183D (Marcksl1-DDD), jotka oli kloonattu pEGFP-N1: ksi (Kloonitech)10, olivat Eleanor T. Coffeylta (Turun yliopisto) saatuja lahjoja. Tarkempia tietoja tässä tutkimuksessa käytetyistä plasmideista on Lisätaulukoissa 1 ja alukkeista 2.
RNA-eristäminen ja cDNA-synteesi: Kokonais-RNA eristettiin TRI-reagenssilla (epigenetiikka) ja Direct-zolTM RNA MicroPrep kitillä (Zymo-tutkimus) ja cDNA syntetisoitiin SuperScript III® – Alkujuostesynteesijärjestelmällä (Invitrogen) valmistajan protokollien mukaisesti.
konstruktioiden ja siirtogeenisten seeprakalalinjojen mosaiikkimainen ilmentymä: Tol2 – pohjaisia ilmentymärakenteita (5-10 pg) ruiskutettiin samanaikaisesti yksisoluisiin seeprakalan alkioihin 50 pg Tol2-transposaasia mRNA litteroituna NotI-linearisoidusta pCS-TP-vektorista (lahja Koichi Kawakamilta, Japanin kansallinen genetiikan instituutti) käyttäen Mmessage mMACHINE SP6 kit (Invitrogen) – pakkausta. Transgeenien mosaiikkia varten alkiot analysoitiin injektioiden jälkeen 1 tai 2 hiukkassuodattimella. TG(fli1ep:MYL9B-EGFP)rk25-ja TG(fli1ep:EGFP-PLC1δPH)rk26-linjojen luomiseksi ruiskutetut alkiot nostettiin aikuisille ja seulottiin perustajille.
Seeprakalojen Marcksl1a-ja marcksl1b-mutanttien sukupolvi: marcksl1a-mutantit syntyivät CRISPR/Cas9-välitteisellä mutageneesillä. Yhden oppaan RNA (sgRNA), joka kohdistuu toiseen eksoniin (Supplementary Fig. 4a) luotiin käyttämällä kloonauksesta riippumatonta protocol40-protokollaa. Cas9 / sgRNA RNP-kompleksi koottiin juuri ennen injektiota ja 5 minuutin huoneenlämmössä tapahtuneen inkubaation jälkeen ruiskutettiin samanaikaisesti 200 pg Cas9-proteiinia (Invitrogen) ja 100 pg sgRNA:ta yhden soluvaiheen Tg(fli1ep:Lifeact-EGFP)zf495;Tg(kdr-l: ras-mCherry)s916-alkioon. marcksl1b-mutantit syntyivät TALEN-välitteisellä mutageenisuudella. TALEN kohdistaminen ensimmäinen eksoni marcksl1b (täydentävä Kuva. 4b) on suunniteltu käyttäen TAL Effector Nucleotide Targeter 2.0 (https:// tale-nt.cac.cornell.edu/node/add/talen-old) ja koottiin Golden Gate-menetelmällä 41. TALEN repeat variable di-residues (RVDS) kloonattiin rciscript-GoldyTALEN-vektoriksi (Addgene) ja capped mRNAs jokaiselle Talenille transkriboitiin in vitro SacI-linearized expression plasmideista käyttäen mMESSAGE mMACHINE T3 kit (Invitrogen). Yksisoluvaihe Tg (fli1ep:Lifeact-EGFP)zf495; Tg (kdr-l:Ras-mCherry)s916 alkiot mikroinjektoitiin 200 pg: llä RNA: ta (100 pg kumpaakin vasenta ja oikeaa talen mrnaa). F0: n perustajat tunnistettiin ulkoistamalla talen-tai CRISPR/Cas9-ruiskutetut kalat villityyppisillä kaloilla ja seulomalla jälkeläiset mutaatioiden varalta 2 dpf: ssä käyttäen T7-endonukleaasi I (NEB) – määritystä (TALEN-ruiskutetuille kaloille) tai Sanger-sekvensointia (CRISPR/Cas9-ruiskutetuille kaloille). Lyhyesti genominen DNA eristettiin viiden alkion ryhmistä HotSHOT-menetelmällä 42 ja vastaavat genomialueet monistettiin. Mutaatiot arvioitiin puhdistettujen PCR-tuotteiden suoralla sekvensoinnilla. Positiivisten F0-solujen F1-jälkeläiset kasvatettiin aikuisiksi, ja mutaatioiden heterotsygoottiset kantajat tunnistettiin fin-leikkauksella ja rutiininomaisella PCR-genotyypin määrityksellä käyttäen samoja alukkeita.
kuusi mutanttialleelia marcksl1a: ssa ja viisi mutanttialleelia marcksl1b: ssä tunnistettiin seulonnassa (täydentävä Kuva. 13). Alleeli rk23 sisältää 2-nt: n poiston, joka johtaa kehyksensiirtoon aminohappo 51: n jälkeen ja ennenaikaiseen pysäyttämiseen kodonissa aminohappo 56: ssa 5 missense-aminohapon jälkeen (täydentävä Kuva. 4 A, c). Alleeli rk24 sisältää 5-nt: n poiston, joka johtaa kehyksensiirtoon aminohappo 13: n jälkeen ja ennenaikaiseen pysäytyskodoniin aminohappo 17: ssä 4 missense-aminohapon jälkeen (täydentävä Kuva. 4b, d). Näistä syistä pidämme marcksl1ark23: A ja marcksl1brk24: ää nollaballeeleina ja keskityimme tutkimuksissamme näiden mutanttien analyyseihin.
elävä kuvantaminen: alkioita asennettiin 0, 8% low-melt agarose (Bio-Rad) – elatusaineeseen E3-elatusaineessa, joka sisälsi 0, 16 mg/mL Trikaiinia ja 0, 003% fenyylitioureaa. Confocal z-Pinot hankittiin käänteisellä Olympus IX83 / Yokogawa CSU-W1 spinning disc confocal-mikroskoopilla, joka on varustettu Zyla 4.2 CMOS-kameralla (Andor). Kirkaskenttäkuvat hankittiin Leica M205FA-mikroskoopilla. Kuvia käsiteltiin Fidžillä (NIH).
Laser-ablaatio: Laser-ablaatiot suoritettiin käyttäen 405 nm: n laseria (Andor) ja frappa-moduulia (Andor), joka oli asennettu ylösalaisin käännettyyn Olympus IX83/Yokogawa CSU-W1-konfokaalimikroskooppiin, jossa oli Olympus UPLSAPO 60x/NA 1.2-vesikylpytavoite. Kolme peräkkäistä laserblaatiota, joiden viipymisaika oli 1000 µs, tehtiin kukin 51%: n laserteholla.
Mikroangiografia: Mikroangiografia tehtiin luonnonvaraisilla alkioilla, marcksl1ark23, marcksl1brk24 ja marcksl1ark23;marcksl1brk24. Kaiken kaikkiaan 2 ja 3 hiukkassuodattimen alkiota ruiskutettiin 1-2 nL dekstraanitetrametyylirodamiinilla tai dekstraanifluoreseiinilla (MW = 2000 kDa, Invitrogen) annoksella 10 mg/mL, ja ne kuvattiin välittömästi. Confocal z-Pinot hankittiin Olympus UPLSAPO 10× / NA 0.4-objektiivilla. Kokonaisen alkion peittämiseksi useita alueita kuvattiin ja ommeltiin käyttäen Fidži43: n Tikkausliitännäistä.
Solusiirto: 15-25 luovuttajasolun ryhmät marcksl1ark23:sta;marcksl1brk24 Mutanttialkiot Tg: ssä(kdr-l: ras-mCherry)s916 Tausta kerättiin satunnaisesta kohdasta blastoderm: ssä ja siirrettiin lateraaliselle marginaalivyöhykkeelle blastoderm 44: ssä villityyppisten vastaanottajien alkioita, joiden pitoisuus oli 4, 5–6 hpf. Uutto ja elinsiirto suoritettiin käyttämällä celltram® 4r-öljyn mikroinjektoria (Eppendorf), jossa oli borosilikaattilasikapillaari GC100-15 (Harvard Apparatus Ltd) muotoiltuna vaakasuoralla mikropipette-vetimellä P-87 (Sutter Instrument Co.) ja MF-900 microforge (Narishige) saada ”lusikka” muoto sileä kärki. Elinsiirron aikana alkioita, joita säilytetään agaroosilla päällystetyissä petrimaljoissa, joissa on 0, 5 x E2 puskuria . Mikroangiografiaa ja kuvantamista varten valittiin 2 dpf: n kohdalla alkioita, joilla oli Mcherry-positiivinen ISV-arvo. Itsenäisiä elinsiirtoja tehtiin yhteensä kahdeksan.
kemialliset käsittelyt: Latrunkuliini B (Merck Millipore) liuotettiin DMSO: Hon arvoon 1 mg/ml ja varastoitiin -20 °C: ssa.CK666 (SIGMA) liuotettiin DMSO: Hon 50 mM: iin ja varastoitiin 4 °C: ssa. kaikki yhdisteet laimennettiin haluttuun pitoisuuteen E3-puskurissa.
Transfektio, siRNA-välitteinen proteiini knockdown ja leikkausjännityskoe: Huveceja (Lonza, C-2519a) viljeltiin EGM-väliaineessa (Lonza) ja käytettiin 4.jaksoon saakka. Plasmidisiirtoja varten solut kylvettiin Opti – mem-väliaineeseen (Gibco) 5, 8 × 104 solua/cm2 poly-l-lysiinillä ja gelatiinipäällysteisillä peitelevyillä ja transfektoitiin 2 µg: lla plasmidia Lipofektamiini 3000: lla (ThermoFisher Scientific). Kahden tunnin kuluttua verensiirrosta Opti-MEM-medium vaihdettiin EGM-Mediumiin ilman antibiootteja. Sirnan verensiirtoon, HUVECs (7.9 × 104 solua/cm2) transfektoitiin 20 nM siRNA: lla käyttäen dharmafect1-reagenssia (Dharmacon). Transfektio toistettiin 24 tunnin kuluttua. soluja kasvatettiin vielä 24 tunnin ajan ennen RNA: n täydellistä uuttamista tai kiinnittymistä. ON-TARGETplus ihmisen MARCKSL1 siRNA-SMARTpool (dharmacon) käytettiin knockdown MARCKSL1. ON-TARGETplus Non-target pool (Dharmacon) käytettiin control siRNA transfektio. Soluissa oli 4% PFA/PBS, permeabilisoitu 0, 1% Triton X-100: lla ja värjätty 14 µM: n Dapi: lla tumien merkitsemistä varten, Alexa 568-falloidiini (1:1000, ThermoFisher Scientific) F-aktiinin ja anti-VE-cadherinin vasta-aineen (1:100, Cell signaling) visualisointiin, jota seuraa anti-rabbit Alexa 488 toissijainen vasta-aine (1:1000, ThermoFisher Scientific) EY-liittymien merkitsemiseksi.
leikkausjännityskokeissa HPAEC (Lonza) viljeltiin pitoisuudella 1000-1500 solua/mm2 1% gelatiinipäällysteiselle astialle EGM-2-väliaineessa (Lonza) ja käytettiin ennen kulkua 9. Solut altistettiin staattiselle tai laminaariselle leikkausjännitykselle 0, 5,1 tai 6 tunnin ajan käyttäen rinnakkaista levytyyppistä laitetta 45, 46. Virtauskammion toisella puolella oli 1-prosenttinen gelatiinipäällysteinen lasilevy, jolla viljellyt Hpaekit lepäsivät, ja toisella puolella polykarbonaattilevy. Niiden tasaiset pinnat pidettiin 200 µm päässä toisistaan Teflon-tiivisteellä. Kammiossa oli sisäänkäynti ja uloskäynti nesteelle, ja sisäänkäynti oli yhdistetty ylempään säiliöön silikoniputkella. Uloskäynti oli auki alempaan tekojärveen. Virtausta ohjasi rulla / putkipumppu. Neste (EGM-2-väliaine) kulkeutui ylemmästä säiliöstä virtauskammion kautta alempaan säiliöön. Virtausnopeutta valvottiin sisäänkäyntiin sijoitetulla ultraäänikuljetusaikavirtausmittarilla (HT107, Transoniset järjestelmät), ja sitä säädettiin muuttamalla yläsäiliön ja virtauskammion ulostulon korkeuseroa. EC-kerrokseen vaikuttavan leikkausjännityksen intensiteetti (τ, dynes/cm2) laskettiin kaavalla τ = 6µQ/a2b, jossa μ on perfusaatin viskositeetti (poise), Q on virtaustilavuus (ml/s) ja A ja b ovat virtaustien poikkileikkausmitat (cm). Leikkausjännitysaltistuksen jälkeen kokonais-RNA eristettiin qPCR: ää varten.
kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR: qPCR suoritettiin käyttäen 1 µL cDNA: ta, joka oli tuotettu 150 ng: stä (HPAECs) tai 500 NG: stä (HUVECs) kokonaisrna: sta, 10 µL: n reaktioseoksessa, joka sisälsi 1x Luna Universal qPCR Master Mix (NEB) ja 400 nM eteenpäin ja taaksepäin. Reaktiot suoritettiin abi Prism 7900HT-laitteella nelinkertaisesti. Tiedot analysoitiin RQ Manager-ohjelmistolla (Applied Biosystems) ja MARCKSL1 mRNA: n suhteellinen lauseke laskettiin 2−ΔΔCt-menetelmällä 47 käyttäen referenssigeeninä GAPDH: ta.
koko mount in situ-hybridisaatio: Koko mount in situ hybridisaatio suoritettiin standardin protocol48 mukaisesti. Alkiot vahvistettiin 4%: n PFA: ssa 24, 48 ja 72 hpf: ssä ja permeabiloitiin 10 µg/mL proteinaasi K: lla.hybridisaatio suoritettiin puskurissa, joka sisälsi 5% natriumdekstraanisulfaattia (MW = 500 kDa) 70 °C: ssa yön yli. Tiukan pesun jälkeen näytteet estettiin 2-prosenttisella estoreagenssilla (Roche) maleiinihappopuskurissa ja inkuboitiin yön yli anti-digoksigeniini (DIG) – vasta-aineella, joka konjugoitiin alkalisen fosfataasin (Roche, 1:5000) kanssa 4 °C: ssa .alkiot värjättiin NBT/BCIP-liuoksella (Roche) värjäyspuskurissa. Alkiot puhdistettiin 70-prosenttisessa glyserolissa yön yli ja kuvattiin Leica M205FA-mikroskoopilla. Marcksl1a – ja marcksl1b-Dig-merkityt 1,2 kb pitkät riboprobit syntyivät plasmideista, jotka koodaavat täyspitkät cdnat MEGAscript SP6-tai T7-sarjojen (Invitrogen) avulla.
yksisoluinen RNA-sekvensointi: ECs eristettiin Tg(KDRL:EGFP)s843-siirtogeenisistä alkioista. Solujen lajittelu toteutettiin FACSAriaII Cell Sorter (Bd Bioscience) – järjestelmällä. Yksisoluinen jousitus ladattiin 10x Chromium-järjestelmään ja cDNA-kirjastot rakennettiin käyttämällä valmistajan protokollan mukaan Chromium Next GEM Single Cell 3′ GEM, Library and Gel Bead Kit v2 (10x Genomics). Kirjasto sekvensoitiin Illumina HiSeq 1500-sekvensseriin (Illumina, USA). Cell Ranger v2.1: tä käytettiin Illumina-sekvenssereiden tuottamien RAW base call (BCL) – tiedostojen poistamiseen fastq-tiedostoiksi, linjauksen, viivakoodilaskennan ja UMI-laskennan suorittamiseen. Sekvensointi lukee kartoitettiin zebrafish genome assembly (GRCz11, Ensembl release 92). Lisäanalyysit tehtiin käyttäen Seurat package49 in r-ohjelmistoa (https://www.r-project.org). Ekspressiomatriisit suodatettiin ensin pitämällä geenit, jotka ilmaistaan vähintään 3 solussa ja solut, jotka ilmentävät vähintään 200 geeniä jatkotutkimusta varten. Soluja suodatettiin edelleen valitsemalla solut, joiden mitokondriopitoisuus on alhainen (<7%). Tämän jälkeen tiedot normalisoitiin käyttäen NormalizedData-funktiota, joka normalisoi kunkin solun geeniekspression kokonaisekspressiolla.
verisuonten halkaisijan määrittäminen: Live Tg (fli1ep: Lifeact-EGFP) zf495; Tg (kdr-l:ras-mCherry)s916 siirtogeenisiä villityyppejä tai marcksl1-mutanttialkioita kuvattiin 50-52 hpf: n teholla. Confocal z-Pinot hankittiin Olympus UPLSAPO 40× / NA1. 25-silikoniöljykylpytavoitteella. DA: n ja PCV: n läpimitan laskemista varten tehtiin 4-5 mittausta ISVs: n välillä keltuaisen jatkeelta (ISVs no. 10-14). ISV: n halkaisijan osalta tehtiin keskimäärin 6 mittausta kutakin ISV: tä (ISVs no. 10-14) pitkin DA: n ja DLAV: n välillä. Mittaukset tehtiin Fidžillä (NIH).
EY-numero ja proliferaatio: EC-numeron laskemiseksi 52 hpf wildtype, marcksl1ark23, marcksl1brk24 tai marcksl1ark23;marcksl1brk24 alkiot Tg(kdr-l:ras-mCherry)s916-taustassa vahvistettiin 4% PFA: ssa ja värjättiin 3 µM: n DAPI: lla. Confocal z-Pinot hankittiin Olympus UPLSAPO 40x / NA 1.25-silikoniöljykylpytavoitteella. Ytimet laskettiin kussakin ISV: ssä (ISVs no. 9-22) DA: n ja DLAV: n välillä. Mitoottisen ECs-arvon määrittäminen ISVs: ssä, wildtypessä tai marcksl1ark23: ssa;marcksl1brk24: n alkioissa Tg (fli1ep:Lifeact-EGFP)zf495; Tg(kdr-l:Ras-mCherry)s916-Tausta vahvistettiin 4% PFA:ssa 30, 36 ja 48 hpf:ssä, permeabiloitiin 1% DMSO/1% Triton X-100: ssa ja värjättiin anti-phospho H3-vasta-aineella (1: 250, Merck Millipore), jota seurasi anti-rabbit Alexa 488 secondary antibody (1: 1000, ThermoFisher Scientific) ja 3 µM Dapi. Confocal z-Pinot hankittiin Olympus UPLSAPO 40x / NA 1.25-silikoniöljykylpytavoitteella. Mitoottisolut (pH3-positiiviset solut) laskettiin ISV: iin alkion molemmin puolin (ISV: t nro 9-22). ISV: t visualisoitiin mcherryn fluoresenssilla. Vain yksi pH3-positiivinen solu ISV: tä kohti havaittiin riippumatta ISV: n sijainnista. Laskennan aikana pidimme TELOFAASIN EC: tä yhtenä Soluna. EC-jakaumien lukumäärän laskemiseksi wildtype tai marcksl1ark23; marcksl1brk24 alkiot Tg(fli1ep:Lifeact-EGFP)zf495;TG (kdr-l:ras-MCHERRY)s916-Tausta kuvattiin 24-48 hpf 6 minuutin välein käyttäen Olympus UPLSAPO 30×/NA 1.05-silikoniöljykylpytavoitetta. Solunjakautumien määrä kussakin ISV: ssä (ISVs nro 11-15) määritettiin.
aktomyosiinitasojen kvantifiointi apikaalisessa aivokuoressa: Live Tg (fli1:Lifeact-mCherry)ncv7; Tg(fli1ep:EGFP-PLCδ1PH)rk26 ja Tg(fli1ep:myl9b-EGFP)rk25; Tg (kdr-l:ras-mCherry)s916 seeprakalan alkiot kuvattiin 30-34 hpf: n teholla käyttäen Olympus UPLSAPO 60×/NA 1.2-vesikylpytavoitetta. Lifeactin eli Myl9b: n voimakkuus apikaalisessa aivokuoressa ja sytoplasmassa mitattiin Fidžillä. Aivokuoren ja sytoplasman keskimääräisen intensiteetin suhde laskettiin.
in vivo solumuotoanalyysi: ECS: n yksisolumerkintä ISVs: ssä saatiin aikaan joko fli1ep:lynEGFP-plasmidin, marcksl1brk24: n tai marcksl1ark23: n, marcksl1brk24: n mutanttialkioiden tai fli1ep: n mosaiikkiekspressiolla:marcksl1b-EGFP plasmidi villityyppisissä alkioissa. 2 dpf: llä tehtiin mikroangiografia ja alukset kuvattiin Olympus UPLSAPO 60×/NA 1.2-vesikylpytavoitteella, jossa optisten Z-tasojen väli oli 0.25 µm. Cell shape analysis of ECS of ISVs suoritettiin puoliautomaattisesti käyttäen custom-written ImageJ script kehitetty Python, laajentaa menetelmää kuvattu ref. 50. Kuvat rajattiin ensin karkealla rajauksella loppupään muistivaatimusten vähentämiseksi ja lisää metatietoja (alustyyppi ja alkiotunniste) syötettiin. Erillinen skripti ajettiin sitten projisoimaan ja purkamaan soluja aluksen ympäriltä 2D-pinnalle. Lyhyesti rajattuja kuvia käännettiin ensin alustyypin perusteella astian akselin suuntaamiseksi karkeasti Z-suunnan kanssa kuvapinossa, ja projektiota varten valittiin fluoresoivan mosaiikkikennoetiketin kanava. Jotta voitaisiin ratkaista ongelmat, jotka johtuvat vaihtelevista fluoresoivista taustarakenteista ja dekstraani-rhodamiinin perfuusiosta veripoolissa olevassa fluoresenssikanavassa, astian akseli tunnistettiin määrittämällä käsin astian sijainti noin 10 µm: n välein kuvapinon läpi ja tekemällä sitten Katmull-Rom-spline-sovitus ja interpolointi. Tämän jälkeen tietoja muutettiin aluksen akselin suoristamiseksi kolmessa ulottuvuudessa. Seuraavaksi määriteltiin projektiokanavan enimmäisintensiteetin sijainti säteitä pitkin 1 asteen välein astian akselin ympäri. Näitä tietoja käytettiin heijastamaan fluoresenssin voimakkuus tasolle, jossa akselit ovat aluksen akselin ja kulman suuntaisia, ja kartoittamaan etäisyys aluksen akselista kussakin asennossa projisoidulla tasolla. Kenno tunnistettiin projisoidusta kuvasta ImageJ: n sisäänrakennetun Intermodes-menetelmän avulla. Tämän jälkeen laskettiin kaaren pituudet, joita edustavat kunkin soluun liittyvän pikselin sivut (\(l = \frac{{2\pi rd^2}}{{360}}\), jossa r on kennoon liittyvän pikselin ja astian akselin välinen etäisyys ja d pikselin sivu) ja jota käytetään kennon pinta-alan ja kuvasuhteen mittausten tuottamiseen.
in vitro solumuotoanalyysi: kiinteät Huvecit kuvattiin Olympus UPLSAPO 40×/NA 1.25-silikoniöljykylvyllä. Kaikkiaan jokaisesta kansilipusta otettiin 10-20 kuvaa kvantifiointia varten ja analysoitiin puoliautomaattisesti mittatilaustyönä tehdyllä ImageJ-skriptillä. Monikanavaiset z-Pinot projisoitiin maksimaalisesti ja GFP-merkkiainetta näyttävä kanava tunnistettiin instrumenttien metadatasta. ImageJ: n sisäänrakennettua Otsu-puintimenetelmää käytettiin erottamaan taustasta kiinnostavia soluja; tuloksena olevat binäärikuvat puhdistettiin poistamalla alle 105 µm2: n pienimmät alueet ja näkökentän rajaan kosketuksissa olevat alueet. Myöhemmässä manuaalisessa interventiovaiheessa käyttäjä pystyi valinnaisesti muokkaamaan tämän binäärikuvan perusteella kiinnostavia solualueita erottelemaan virheellisesti yhdistettyjä soluja tai sisällyttämään niihin soluja, jotka jäivät käyttämättä thresholding-operaatiossa. Script sitten laskettu alueet ja perimeters kullekin solulle ROI. Lisäksi kullekin kennolle laskettiin ”piikikkyysindeksi”, joka perustui kennon kehän ja vastaavan kuperan rungon kehän väliseen suhteeseen, ja kennon kuvasuhteen arvo laskettiin kennoon sijoitetun ellipsin pää-ja pienakselien suhteena.
Analysis of membrane blebbing: juonet, jotka liittyvät membrane blebbingiin, luotiin puoliautomaattisesti käyttäen kustomoitua ImageJ-skriptiä. Kullekin kuvaillulle kalvolle laskettiin kussakin aikapisteessä kalvon reunan ääriviivojen pituuden ja reunojen päätepisteiden välisen euklidisen etäisyyden suhde. Syntyneestä aikasarjasta tehon spektritiheydet laskettiin Welchin menetelmällä 51. Tehospektritiheys laskettiin sitten keskiarvoksi kiinnostavan ikkunan aikana, joka määriteltiin empiirisesti ominaisajaksi, jonka aikana blebs muodostui (0,04 – 0,06 Hz); näitä keskiarvoja verrattiin kokeellisten (Marksl1b-yliekspressio) ja kontrolliolosuhteiden välillä.
aktiinin ja myosiini II: n dynamiikan analyysi blebs: ssä: Tontteja, jotka liittyvät dynamiikkaa aktiinin tai myosiinin blebbing solut luotiin puoliautomaattisesti käyttäen custom-kirjoitettu ImageJ script. Monikanavaiset Z-Pinot projisoitiin ensin maksimaalisesti z-ulottuvuutta pitkin. Tämän jälkeen ohjelmisto yksilöi automaattisesti bleb: n reunan kahden käyttäjän määrittämän ankkuripisteen välillä kaikkina ajankohtina käyttäen ImageJ: n sisäänrakennettua Otsu-puintimenetelmää, joka toimii marksl1b-EGFP-kanavalla kalvomerkinnän korvikkeena. Bleb-reunan tarkan tunnistamisen varmistamiseksi suoritetun käyttäjän laadunvalvontavaiheen jälkeen aktin / myosiini-kanavan intensiteettiprofiili reunaa pitkin louhittiin jokaisena ajankohtana ja piirrettiin aikaa vasten kymografiassa. Kunkin ajankohdan intensiteettitilastot otettiin yhdessä bleb-alueen kanssa, joka määritellään tässä Z-projisoituna alueena, joka rajoittuu reunaan ja linjaan, joka yhdistää Bleb: n kummallakin puolella kauimpana Bleb: n kärjestä olevat pisteet akselia pitkin, joka on kohtisuorassa käyttäjän määrittämät ankkuripisteet yhdistävään linjaan nähden, ja keskimääräinen aktiini/myosiinikanava-intensiteetti ja bleb-alue piirrettiin aikaa vastaan.
aivokuoren aktiinitiheyden ja nipun leveyden määrittäminen: Korkearesoluutioiset kuvat aktiinista HUVECs: issa hankittiin Plan-APOCHROMAT 63x-öljyobjektiivilinssillä, joka oli asennettu Zeiss LSM880-konfokaalimikroskooppiin, joka oli varustettu Airyscan-ja GaAsP-ilmaisimella. Kunkin havainnon sisällä noin 3 µm: n neliöön rajatut alueet valittiin satunnaisesti ja rajattiin tyypillisesti 8 optista kohtaa, jotka kattavat aivokuoren mesh-rakenteen kyseisiltä alueilta. Projisoidut kuvat rajattujen pinojen Z-akselin suuntaisesti syntyivät maksimitehoprojektiolla ja niille tehtiin seuraava menettely. Koska kuvan aktiinifilamentit olivat monitulkintaisia ja koko verkostoa oli mahdotonta arvioida, määritimme aktiinifilamenttien määrän rajatuilla alueilla aktiinifilamenttien tiheydeksi. Tämä suoritettiin asettamalla X – ja Y – akseleita pitkin olevat skannausviivat 4 pikselin välein, ja jokaisen skannausviivan pikseliarvot alistettiin Savitzky-Golay-suodatus52: lle ensimmäisen kertaluvun derivaatan laskemiseksi. Aktiinifilamentit tunnistettiin tämän jälkeen löytämällä nollaristeyskohtia, jotka ovat skannausviivan intensiteettipiikkejä. Piikkien määrät jaettiin skannausviivan pikselimäärillä (kuvan leveys tai korkeus) ja hehkulankojen tiheys kuvan päällä laskettiin ottamalla näiden arvojen keskiarvo.
aktiinikimpun leveyden kvantifioimiseksi aktiinikimpun keskiviivat saatiin aikaan löytämällä savitzky-Golay-suodattimella laskettujen ensimmäisen kertaluvun derivaattien nollaristeyspisteet ja soveltamalla sen jälkeen Hilditchin harvennusalgoritmia. Jotta vältettäisiin se mahdollisuus, että aktiinifilamenttien haarautumis – tai ylityspisteet vaikuttaisivat mittauksiin, skeletonisoidun linjan haaroittumispisteet poistettiin ja segmentoitiin. Kokonaisjanan ortogonaalinen akseli määritettiin eigenvektorin avulla, ja Lanczos-5-interpolointimenetelmällä otettiin näytteitä fluoresoivista intensiteeteistä janan painovoimakeskusta pyörittävää ortogonaalista akselia pitkin. Tämän jälkeen hehkulangan läpimitta määritettiin sen alueen leveydellä, joka oli suurempi tai yhtä suuri kuin puolet kohtisuoran akselin suuntaisen näytteenoton huippuvoimakkuudesta koko janaan nähden.
tilastot: tilastollinen analyysi tehtiin käyttäen Prism 8: aa (GraphPad Software, Inc.). Otoskoot eivät olleet ennalta määrättyjä, kokeita ei satunnaistettu, eikä tutkijoita sokaistu jakamisesta kokeiden ja tulosten arvioinnin aikana.
Raportointikooste
lisätietoja tutkimuksen suunnittelusta on tämän artikkelin yhteydessä olevassa Nature Research Reporting Summary-julkaisussa.
