Niikawa ja Kuroki kuvasivat ensimmäisen kerran vuonna 1981 kdm6a: n poiston, Histonidemetylaasin, jolla on yhteisvaikutus Mll2: n kanssa,kolmella potilaalla,joilla on Kabukin oireyhtymä | Jumbuck

main Text

Kabukin oireyhtymä (KS; mim 147920). kirjallisuudessa on raportoitu 1, 2 ja yli 400 tapausta. Tärkeimmät kliiniset ominaisuudet ovat erottuvat kasvonpiirteet, kehityksen viivästyminen, lievä tai kohtalainen kehitysvammaisuus, synnytyksen jälkeinen kasvun hidastuminen, ja muita ominaisuuksia, kuten luuston poikkeavuuksia, hypodontia, ja pysyvät sikiön sormenpäät tyynyt. Vertaileva genomic hybridization (CGH) – mikroarray-analyysi ei onnistunut havaitsemaan toistuvaa poikkeamaa 72 KS-yksilöllä.3-8 exome-sekvensointistrategian käyttö johti äskettäin MLL2 (mim 602113) – mutaatioiden tunnistamiseen KS: n pääsyyksi.9 viidessä äskettäin julkaistussa sarjassa MLL2: n mutaatioita havaittiin 56-76%: lla KS-potilaista.9-13

koska merkittävällä osalla potilaista ei ole havaittavaa MLL2-mutaatiota, oletimme, että KS: ään liittyy muitakin geenejä. Etsittäessä toista KS: ää aiheuttavaa geenimutaatiota seulottiin kymmenen mll2: n kanssa vuorovaikutuksessa olevaa geeniä 15 MLL2-mutaationegatiiviselta KS-yksilöltä, eikä patogeenisiä mutaatioita tunnistettu.11 toinen mll2-vuorovaikutuksessa olevaa proteiinia koodaava geeni, KDM6A (tunnettiin aiemmin nimellä UTX; mim 300128), seulottiin 22: lta MLL2-mutaationegatiiviselta KS-yksilöltä, eikä myöskään havaittu aiheuttavia mutaatioita.13

käyttämällä array CGH-analyysiä (Agilent platform 244K), tunnistimme de novo Xp11.3-mikrodeleet kahdella belgialaisella MLL2-mutaationegatiivisella KS-tytöllä (potilaat 1 ja 2). Koska molemmat poistot olivat de novo, ne ovat todennäköisesti patogeenisiä. Molemmat poistot sisälsivät joko osan KDM6A: sta tai kokonaan. lisäksi edellisessä tutkimuksessa 411 normaalin kontrollin kohortissa ei ollut kdm6a: n poistoja.14 potilaan 1 deleetiossa oli kdm6a eksonit 21-29, jotka koodaavat kdm6a: n katalyyttisen alueen terminaalista osaa, ja cxorf36, geeni, joka on äskettäin yhdistetty X-linkitettyyn autismiin.15 potilaasta 2 kdm6a, CXorf36, DUSP21 (mim 300678) ja FUNDC1 (Kuva 1) poistettiin kokonaan. Dusp21: n ja FUNDC1: n toiminnot ovat edelleen tuntemattomia.

alue Xp11.3, jossa esitetään potilaiden poistot

alue Xp11.3, osoittaa poistot, jotka on otettu UCSC: n Genomiselaimesta (GRCh37/hg19) potilailla 1, 2 ja 3. Mustat täyskappaleet kuvaavat jokaisen potilaan poistoa, ja jokaisen potilaan Numero on hänen oman kappaleensa yläpuolella. Potilaan 1 poisto ulottuu 283.5 kb kantaluvusta 44 941 324 kantaluokkaan 45 224 829, potilaan 2 poisto kantaluvusta 815.7 kb tukikohdasta 44,377,858 perustasoon 45,193,629, ja potilaan 3 poisto ulottuu 45,4 kb perustasosta 44,866,302 perustasoon 44,912,718. Alueen geenit on merkitty poistoraitojen alle. Genomivarianttien tietokannan CNV: t näkyvät alimmilla riveillä. Aikaisempia raportteja kdm6a: n kopionumeromuutoksista ei ole.

sitten sekvensoimme KDM6A: n Sanger-sekvensoinnilla ja etsimme introgeenisiä poistoja tai päällekkäisyyksiä kohdennetulla mukautetulla Agilent-ryhmällä CGH: lla kohortissa, jossa oli 22 MLL2-MUTAATIONEGATIIVISTA KS-yksilöä (8 naarasta, 14 urosta). Institut de Pathologie et de Génétique-eettisen komitean eettisten standardien mukaisesti kaikkien tutkimukseen osallistuneiden DNA-analyysiin ja valokuvien julkaisemiseen saatiin vanhempien suostumus. Tässä julkaisussa käsitellyt CGH microarray-tiedot (täydentävät tiedot, saatavilla verkossa) on talletettu National Center for Biotechnology Information-keskukseen (NCBI)Gene Expression Omnibus (GEO) 16, ja ne ovat saatavilla liittymisnumerot-osiossa (Katso Liittymisnumerot).

pistemutaatioita ei havaittu, mutta tunnistimme de novo-introgeenisen deleetion (eksonit 5-9) yhdellä italialaisella KS-miehellä (potilas 3). Me myös sekvensoimme DESSITYN (MIM 400009), Kdm6a: n Y-kromosomin paralogin (katso alla), ja etsimme introgeenisiä poistoja tai päällekkäisyyksiä, kuten edellä on todettu, mutta emme havainneet mutaatioita.

potilailla 1 ja 3 oli tyypillinen KS-fenotyyppi, johon kuuluivat pitkät palpebraaliset halkeamat, alaluomen lateraalinen kiertyminen ja kohtalainen tai vaikea kehitysvamma (Taulukko 1 ja kuva 2). Vaikka potilaan 2 kasvonpiirteet eivät olleet yhtä klassisia, hänellä oli monia piirteitä tästä häiriöstä, mukaan lukien kulmakarvojen lateraalinen harvuus, pitkät ripset, karsastus, pitkät palpebraaliset halkeamat, suuret ja näkyvät korvat, pysyvät sikiön sormenpäät, aortan koarktaatio, areolaarinen täyteläisyys lapsenkengissä ja hirsutismi. Hänellä oli lievä kehitysviive, ja hänellä oli normaali verbaalinen älykkyysosamäärä (IQ), huono suorituskyky IQ-pisteet ja hyperaktiivinen käyttäytyminen (Taulukko 1 ja kuva 2). Havaitsimme, että potilailla 1 ja 2 oli pitkiä aistiharhoja (kuva 3).

kasvojen ulkonäkö potilailla, joilla on

(a) potilas 1.

(B) Potilas 2.

(C) Potilas 3.

huomaa pitkät kämmenluun halkeamat potilailla 1 ja 2 ja kaarevat kulmakarvat potilailla 1 (lievä) ja 3.

jalkojen esiintyminen sairastuneilla

(A) potilailla 1.

(B) Potilas 2.

huomaa molemmilla potilailla pitkät aistiharhat.

näin ollen kdm6a-poistumat näillä kolmella potilaalla liittyvät laajaan fenotyyppiseen kirjoon, joka vaihtelee tyypillisistä KS-henkilöistä (potilaat 1 ja 3) lievempään kliiniseen esitystapaan (potilas 2). Tämä kliininen vaihtelu on tyypillistä myös potilailla, joilla on MLL2-mutaatioita.13 on kuitenkin otettava huomioon myös cxorf36: n deleetion mahdolliset vaikutukset potilaan 1 ja cxorf36: n, DUSP21: n ja FUNDC1: n deleetion mahdolliset vaikutukset potilaan 2 fenotyyppeihin.

KDM6A (29 eksonia) on yksi X-kromosomin geeneistä, joka suurelta osin pakenee X-inaktivaatiota.17 se koodaa 1 401 jäämäproteiinia, joka sisältää kaksi funktionaalista domeenia. Katalyyttinen domeeni on histonidemetylaasi, joka erityisesti katalysoi mono -, di-ja trimetyloidun lysiini 27: n demetylaatiota Histoni H3: ssa (H3K27).18,19 tämä demetylaatio välittää eri geenien kudosspesifistä ilmentymistä ja osallistuu enimmäkseen kehitysprosesseihin ja solusykliin.19-22 mielenkiintoista on, että KDM6A ja MLL2 vaikuttavat yhdessä transkriptioiden aktiivisen kromatiinin epigeneettisessä ohjauksessa torjumalla Polykombiryhmän (PcG) proteiineja.22 kdm6a: n toisella funktionaalisella osa-alueella on rooli kromatiinin remodelaatiossa, koska se on vuorovaikutuksessa Swi/SNF-remodelaatiokompleksin kanssa, joka sisältää transkription aktivaattorin Brg1.23

, kuten MLL2, KDM6A: lla on rooli embryogeneesissä ja kehityksessä. Homotsygoottiset dUTX (Drosophila kdm6a ortholog) Drosophila-mutantit ilmentävät karkeita silmiä, dysmorfisia siipiä ja sukupuolikampojen muuntelua.21 Tämä fenotyyppi muistuttaa trithorax-fenotyyppiä, mikä tukee edelleen käsitystä, että KDM6A torjuu PcG-torjuntaa.21 lisäksi UTX-1 (C. elegans kdm6a ortolog) saattaa vaikuttaa C. elegans vulval-prekursorisoluissa tapahtuviin kehityshäiriöpäätöksiin niiden geenien transkriptiosäätelyn kautta, jotka koodaavat matoilta ihmiselle siirtynyttä retinoblastooma (RB) – proteiinikompleksia.20 Kdm6a1 on tärkeä myös posterioristen HOX-geenien ilmentymisessä Seeprakaloilla.19 lisäksi KDM6A: lla on yhdessä MLL2: n kanssa merkittävä rooli lihasspesifisten geenien säätelyssä alkiogeneesin aikana.22,24 lopuksi toisen tärkeän kehitysgeeniperheen jäsenet (T-box-geenit, jotka toimivat mesodermissä sydämen ja nikamien muodostumisessa) värväävät kdm6a: n aktivoimaan kohdegeeninsä, korostaen jälleen KDM6A: n roolia kehitysprosesseissa.23 mielenkiintoista, useimmat patogeeniset mutaatiot raportoitu T-box geenit ihmisen sairauksia sijaitsevat T-box domeeni, joka vuorovaikutuksessa KDM6A.23

KDM6A pakenee X inaktivaatiota, 17 mutta on esitetty, että hiirillä inaktiivisen X-kromosomin kdm6a-ilmentymä on huomattavasti pienempi kuin aktiivisen X-kromosomin.25 Kdm6a ilmentyminen on suurempi aikuisten aivoissa, aikuisten maksassa ja tietyillä kehittyvillä aivojen alueilla naisilla kuin miehillä.25ture on kdm6a: n paralogi Y-kromosomissa.17tityllä on 84% aminohappojärjestyksen samankaltaisuus KDM6A: n kanssa ja se saattaa korvata kdm6a: n lisääntyneen ilmentymisen naisilla, huolimatta siitä, että demetylaasiaktiivisuutta ei ole vielä osoitettu tälle kdm6a-paralogille.14, 25

ei ole yllättävää, että X-kromosomista löytyy toinen KS: ään liittyvä geeni, koska on raportoitu KS: n kaltaisista potilaista, joilla on pienet rengas-X (r) – kromosomit.26-34 lisäksi on olemassa selvä päällekkäisyys synnynnäisten sydänvikojen vallalla mies KS-potilailla(aortan koarktaatio ja muut vasemman puolen esteet) ja ne löytyy potilailla, joilla on monosomia X ja R (X) kromosomit.28,35 pientä r(X) – kromosomia johtaa tyypillisesti Turnerin oireyhtymään r (X): n täydellisen inaktivaation kautta. On kuitenkin epäselvää, miksi joillekin yksilöille kehittyy KS-tyyppinen fenotyyppi. X-kromosomin epätäydellistä inaktivaatiota ja sitä seuraavaa yleensä tukahdutettujen geenien ilmentymistä on ehdotettu KS-fenotyypin selitykseksi joillakin r(X) – potilailla.32-34 kdm6a poistettiin niiltä kolmelta potilaalta, joilla oli sekä KS: n kaltainen fenotyyppi että R(X), joiden raja-arvot oli kartoitettu; tämä havainto on yhdenmukainen sen hypoteesin kanssa, että kdm6a: n deleetiolla on tärkeä rooli KS: n kaltaisessa fenotyypissä, joka on havaittu joillakin potilailla, joilla on R(X).30, 32, 34 emme pystyneet osoittamaan kdm6a: n haploinsuojavuutta potilailla 1 ja 2, koska kdm6a: n ilmentyminen oli hyvin vähäistä perifeerisen veren lymfosyyteissä (tietoja ei näy). Tutkimukset ovat kuitenkin osoittaneet, että kaksi kopiota kdm6a: sta on tarpeen normaalille ilmentymiselle naarashiiren alkioissa ja täysikasvuisissa hiirissä,25 mikä viittaa siihen, että haploinsufficiency saattaa olla patogeeninen mekanismi. Tämä selitys ei kuitenkaan selittäisi sitä,että 45, X ja muut R(X) – potilaat, joilla on kdm6a-poisto, eivät kaikki kehitä Kabuki-fenotyyppiä.

potilailla 1 ja 2 molekyyli-X-inaktivaatiosuhteet ovat voimakkaasti vääristyneet ja ovat vastaavasti 89:11 ja 97:3. X-inaktivaatioprofiili määritettiin androgeenireseptorigeenin exon 1: ssä toistuvan CAG: n PCR-monistuksella ennen DNA: n pilkkoutumista HpaII: lla ja CfoI: lla ja sen jälkeen. Selvittääksemme, sijaitsiko kdm6a: n poistettu kopio aktiivisessa vai inaktiivisessa X-kromosomissa, suoritimme fluoresenssi in situ hybridization (FISH)-analyysin kdm6a-koettimella X-kromosomeille, jotka oli eri tavoin merkitty 5-bromi-2′ – deoksiuridiinin (5-BrdU) sisällyttämisellä. Tulokset osoittivat, että poistettu kdm6a-kopio sijaitsi inaktiivisessa X-kromosomissa Kaikissa 70 mitoosissa, jotka analysoitiin molemmilla potilailla (Kuva 4). Se, että KDM6A pakenee X-inaktivaatio17 viittaa siihen, että fytohemagglutiniini (PHA)-stimuloiduilla lymfosyyteillä, joilla on poistettu kopio kdm6a: sta inaktiivisessa X-kromosomissa, on eloonjäämisetu verrattuna solulinjoihin, joilla on poistettu kopio kdm6a: sta aktiivisessa X-kromosomissa. Tämä ehdotus on linjassa sen hypoteesin kanssa, että vaikka KDM6A pakenee X-inaktivaatiota, sen ilmentymä on pienempi inaktiivisesta X-kromosomista kuin aktiivisesta X-kromosomista.25

Image of FISH Study on X-kromosomi Differentially Labed with 5-BrdU

KALATUTKIMUKSEN kuva osoittaa X-kromosomin erilaistuneen merkittynä 5-BrdU: n inkorporaatiolla. Inaktiivinen X-kromosomi (valkoisessa ympyrässä) näyttää kirkkaammalta kuin aktiivinen X-kromosomi. Xqter subtelomeeriset luotaimet hybridisoituvat molempiin X-kromosomeihin (siniset nuolet). Kdm6a-signaali (valkoinen nuoli) puuttuu inaktiivisesta X-kromosomista ja on aktiivisessa X-kromosomissa. Tässä kokeessa potilaiden 1 ja 2 perifeerisen veren lymfosyyttejä stimuloitiin fytohemagglutiniinilla ja niitä viljeltiin 72 tunnin ajan. myöhään replikoituvan inaktiivisen X-kromosomin tunnistamiseksi käsittelimme soluja 5-BrdU: lla (30 µg/ml) 5 tuntia ennen sadonkorjuuta. Tämän jälkeen kolsemidia lisättiin pitoisuudeksi 0,2 µg/ml, ja 1 tunti myöhemmin metafaasivalmisteita valmistettiin standardimenetelmillä, joihin kuului 75 mM:n KCl: n turpoaminen ja 3: 1 metanoli/etikkahappo. Teimme kala-analyysin käyttämällä samanaikaisesti subtelomeerista Xqter-koettinta, jossa on Spektrimoranssi (Vysis), osoittaaksemme X-kromosomit (sininen nuoli) ja Rp11-435k1, jossa on Spektrimoranssi (AmpliTech) erottaaksemme poistetut ja poistamattomat X-kromosomit (valkoinen nuoli). Yhdistetyn 5-BrdU: n havaitsemisen helpottamiseksi denaturoimme solun DNA: ta 2N HCl: ssä 30 minuutin ajan 37°C: ssa.5-BrdU merkittiin sitten 5-BrdU-spesifisellä monoklonaalisella vasta-aineella, joka on konjugoitu fluoreseiiniin (Roche) (1 µg/ml). Lopulta TORJUIMME DNA: n käyttämällä antifade-liuosta, jossa oli 0.1 µg/ml DAPI.

OFIDITYN rooli on suurelta osin tuntematon, eikä sillä ole in vitro-demetylaasiaktiivisuutta. Miespuolisen KS-yksilön (potilas 3), jolla on kdm6a: n introgeeninen poisto ja jonka kliininen vakavuus on samanlainen kuin potilaalla 1, löytyminen viittaa siihen, että karsinta voi osittain korvata kdm6a: n menetyksen miespuolisilla henkilöillä, kuten kirjallisuudessa on aiemmin esitetty.25

kuten MLL2: ssa, somaattisia homotsygoottisia ja hemizygoottisia mutaatioita kdm6a: ssa on todettu eri syöpätyypeissä (multippeli myelooma, ruokatorven okasolusyöpä, munuaissyöpä, myelooinen leukemia, rintasyöpä, kolorektaalisyöpä ja glioblastooma), mikä viittaa siihen, että KDM6A on tuumoria vaimentava geeni.Syöpä ei kuitenkaan ole KS: n keskeinen piirre, sillä tätä komplikaatiota on raportoitu vain seitsemällä KS-potilaalla36,37 (akuuttia lymfoblastista leukemiaa, Burkittin lymfoomaa, fibromyksoidista sarkoomaa, synoviaalista sarkoomaa ja hepatoblastoomaa on raportoitu kerran ja neuroblastoomaa on raportoitu kahdella KS-potilaalla).35,36 jos molempien alleelien häviäminen riittää aiheuttamaan syövän, voidaan olettaa, että syöpää esiintyy useammin KS: ssä, kuten retinoblastoomassa (MIM 180200) tai Wilmsin kasvaimessa (MIM 194070). Tämä viittaa joko siihen, että toisen alleelin menetys MLL2: ssa, KDM6A: ssa, tai että tämä komplikaatio on välttämätön, mutta ei riitä syövän kehittymiseen, tai että tämä komplikaatio on underrecognized, mikä osoittaa luonnonhistoriallisten tutkimusten merkityksen harvinaisissa oireyhtymissä.37

seuraavia histonimetylaaseja ja histonidemetylaaseja on yhdistetty muihin monipoikkeamaoireyhtymiin: EHMT1 (MIM 607001; Kleefstran oireyhtymä ), SETBP1 (mim 611060; Schinzel-Giedionin oireyhtymä ), JARID1C (Mim 314690; Claes-Jensenin tyyppi, X-linkitetty kehitysvammaisuusoireyhtymä), PHF8 (MIM 300560; Siderius-tyyppi, X-linkitetty kehitysvamma – oireyhtymä), ja MLL2 KS. KDM6A: n patogeenisten mutaatioiden tunnistaminen KS-potilailla laajentaa histonia muuntavien tekijöiden roolia kehitysvammaisuudessa ja synnynnäisissä epämuodostumissa.

lopuksi raportoimme KDM6A-mutaatioiden aiheuttavan KS: n yhdellä uroksella ja kahdella naaraalla. Löydöksemme vahvistavat sekä KS: n geneettisen heterogeenisyyden että X-kromosomin lokuksen, kuten aiemmin on esitetty. Koska jotkut KS-potilaat olivat negatiivisia MLL2: n, KDM6A: n ja leikkauksen sekvensoinnin suhteen eivätkä osoittaneet poistoja tai päällekkäisyyksiä seulonnan aikana, on todennäköistä, että muita KS: ään liittyviä geenejä ei ole löydetty.