rakenteellinen perusta K48-linkitetyn Ub-ketjun tunnistamiselle proteasomaalisella reseptorilla Rpn13

K48-linkitetyn Ub-ketjun tunnistamiselle dynaamisesti vaihtelee useiden konformaatioiden välillä

käytimme smfretiä arvioidaksemme kahden UB-alayksikön tilajärjestelyä ligandittomassa K48-diubissa. Otimme käyttöön fluoroforit, Alexa Fluor 488 ja Cy5, distaalisen Ub: n n-terminuksessa ja proksimaalisen Ub: n C-terminuksessa (täydentävä Kuva. S1a). Käyttämällä odotuksen maksimointi algorithm32, Smfret profiili K48-diUb voidaan parhaiten kuvata kolme päällekkäistä tuskailla lajeja (täydentävä Kuva. S2). High-, medium -, ja matala-tuskailla lajit ovat keskittyneet tuskailla tehokkuutta 0.74, 0.57 ja 0.23, vastaavien populaatioiden ~48, ~39, ja ~13% (Kuva. 1 A). FRET etäisyydet keskustan fluorifores lasketaan ~43, ~50, ~64 Å, vastaavasti. Siten, korkea -, Keski -, ja matala-tuskailla lajeja voidaan määrittää kompakti, puoliavoin, ja avoimet tilat, jotka ovat olemassa jo K48-diUb.

A, jossa fluoroforit ovat konjugoituneet proksimaalisen Ub: n 76 C: n ja distaalisen Ub: n 0 C: n kohtaan (vrt. Täydentävä Kuva. S1a), smFRET-profiili voidaan asentaa kolmeen päällekkäiseen TUSKAILULAJIIN. Ellei toisin mainita, tätä konjugaatioparia käytetään kaikissa K48-diubin smFRET-tutkimuksissa. Korkea-tuskailla lajeja (värillinen punainen) vastaa ennestään kompakti tila. B-d kompakti tila voidaan valikoivasti rikastuttaa täyspitkä Rpn13, ja väestönkasvu voidaan sovittaa sitova isotherm. e-g kompakti tila voidaan valikoivasti rikastuttaa rpn13ntd, ja väestönkasvu voidaan sovittaa sitova isotherm. h n25c/N25C-paikoissa konjugoituneilla fluoroforeilla Rpn13NTD voi valikoivasti rikastuttaa K48-tetraubin distaalisen diubin olemassa olevaa kompaktia tilaa (vrt. Täydentävä Kuva. S5), jolla on sitova affiniteetti. SmFRET – lajien populaatioille on laskettu keskiarvot kolmesta riippumattomasta mittauksesta, ja virheet osoittavat 1 SD: tä; KD-arvot ilmoitetaan parhaina sopivina ± sopivina virheinä.

K48-diubin konformaatiovaihtelua on aiemmin tutkittu smfret26: n avulla. Tässä tutkimuksessa kirjoittajat ratkaisivat kaksi smFRET lajeja K48-diUb, nimittäin korkea-tuskailla ja matala-tuskailla lajeja center tuskailla tehokkuutta 0.69 ja 0.41, vastaavasti, lisäksi ei-tuskailla lajeja. Kirjoittajat osoittivat, että inaktivoidun OTUB1: n (OTUB1i) titraus, K48-isopeptidisidokselle33 spesifinen deubikvitinaasi, rikastuttaa pääasiassa matalakärkisiä lajeja. Heidän havaintonsa johti ehdotukseen, että K48-diubin voi tunnistaa nimenomaan otub1: stä konformaation valintamekanismin kautta. Täällä toistimme smFRET titraus, ja totesi, että OTUB1i rikastuttaa keskipitkän tuskailla lajeja(täydentävä Kuva. S3a-c). Lisäksi otub1i-titrauksen yhteydessä keskiraskaiden lajien populaatiokasvu voidaan sovittaa sitovaan isotermiin, jonka KD-arvo on 7,7 ± 0.1 µM (täydentävä Kuva. S3d), joka on lähellä aiemmin ilmoitettua KD-arvoa 26. Näin ollen tässä tutkimuksessa keskiraskaiden lajien pitäisi vastata edellisen tutkimuksen matalarakoisia lajeja, ja ristiriita voi syntyä erilaisista fotonilaskennan tehokkuuksista ja smfret-aikajälkien sopivista rutiineista.

vahvistaaksemme edelleen, että K48-diUb vaihtelee kolmen aikaisemman konformaatiotilan välillä, otimme käyttöön fluoriforeja lisäpareilla fluoroforikonjugaatiopaikoilla (täydentävä Kuva. S1b-d). Vaihtoehtoisten kohteiden osalta, vaikka FRET-lajien keskitehot eroavat toisistaan, smFRET-profiileja voidaan silti kuvata kolmena päällekkäisenä FRET-lajina, joilla on samanlaiset populaatiot (täydentävä Kuva. S4). Esimerkiksi 25 C/25 C konjugaatio sivustoja, high-, medium-, ja matala-tuskailla lajit ovat keskittyneet tuskailla tehokkuutta 0,68, 0,54 ja 0,21, vastaavien populaatioiden ~48%, ~43%, ja ~9% (täydentävä Kuva. S4d). Näin ollen fluoriforeiden konjugaatio ei todennäköisesti häiritse proteiinirakennetta, ja smFRET-mittaukset ovat paljastaneet K48-diubin synnynnäisen konformaatiodynamiikan konjugaatiokohdasta riippumatta, eli K48-diUb vuorottelee kolmen erillisen tilan välillä kumppaniproteiinin puuttuessa.

arvioidaksemme tarkemmin, vaihtelevatko UB-alayksiköt pidemmässä K48-linkittyneessä Ub-ketjussa myös useiden konformaatiotilojen välillä, analysoimme K48-linkittyneen tetra-ubikitiinin (K48-tetraUb) smFRET-Profiilin. Konjugoimme fluoroforit kahteen n25c-kohtaan K48-tetraubin distaalisessa diubissa (kunnioitettuna proksimaaliseen diubiin). SmFRET-profiili voi sopia myös kolmena päällekkäisenä FRET-lajina (Supplementary Fig. S5a). Vaikka näiden kolmen lajin suhteelliset populaatiot ovat erilaiset kuin eristetyllä K48-diubilla, jonka fluoriforit ovat konjugoituneet samoihin kohtiin (täydentävä viikuna. S4d), keskellä tuskailla tehokkuutta tuskailla lajit ovat lähes identtisiä. Näin ollen diubin yksikön konformaatiotilat todennäköisesti säilyvät pidemmässä K48-linkittyneessä Ub-ketjussa, kun taas suhteellisten populaatioiden ero voi olla seurausta proksimaalisen diubin moduloivasta vaikutuksesta.

korkea-tuskainen laji on selektiivisesti rikastettu rpn13

arvioidaksemme K48-linkitetyn Ub-ketjun konformaatiodynamiikan ja Rpn13-tunnistuksen välistä suhdetta, titrasimme 150 pM fluorofore-merkityn K48-diubin ihmisen täyspitkän Rpn13-proteiinin kanssa. Mielenkiintoista, kun lisätään 100 nM rpn13, ennestään korkea tuskailla lajien K48-diUb on rikastettu ~48% ~57% (Kuva. 1a, b), kun taas keski – ja matalaeväisten lajien populaatio vähenee. Populaatio korkea-tuskainen lajien jatkaa kasvuaan enemmän Rpn13 lisätty (kuva. 1C), ja sitova isotermi voidaan asentaa KD-arvoon 119 ± 24 nM (Kuva. 1d).

on aiemmin osoitettu,että Rpn13NTD on pääasiassa vastuussa Ub-sidonnaisuudesta6, 7. Näin suoritimme smFRET-titrauksen 150 pM fluorofore-merkitylle K48-diubille käyttäen vain Rpn13NTD: tä, joka sisältää vain ensimmäiset 150 jäämää. Rpn13NTD rikastaa myös valikoivasti K48-diubin (Kuva. 1 e, f). Korkeaeväisten lajien populaation kasvu voidaan sovittaa siten, että KD-arvo on 33,1 ± 6,9 nM (Kuva. 1g), mikä on noin 4-kertainen affiniteetin kasvu verrattuna täyspitkään Rpn13: een. Jos fluoriforit ovat kiinnittyneet vaihtoehtoisiin konjugaatiokohtiin (täydentävä Kuva. S1b ja S4b), titraus Rpn13NTD aiheuttaa myös rikastuminen vastaavien tuskailla lajien jälkeen samanlainen suuntaus, jolla on lähes identtinen KD arvo (täydentävä Kuva. S6). Siten ulkonäkö ylimääräisiä jäämiä voi olla pieni estävä vaikutus vuorovaikutukseen Rpn13NTD ja K48-diUb.

lisäksi suoritimme smFRET-titrauksen 150 pM K48-tetraubille fluoroforeilla konjugoituneena distaaliseen diubiin (Supplementary Fig. S5a). Titraus Rpn13NTD valikoivasti rikastaa preexisting high-tuskailla lajien fluorofore-merkitty distaalinen diUb(täydentävä Kuva. S5b-d), ja sitova isotermi voidaan asentaa KD-arvoon 214 ± 70 nM (Kuva. 1t). Sitoutumisaffiniteetin 7-kertainen väheneminen verrattuna Rpn13NTD: K48-diUb-vuorovaikutukseen voidaan katsoa johtuvan distaalisen diubin ja proksimaalisen diUb34: n välisestä itsesidonnaisuudesta, jolloin sitoutumispinta on vähemmän käytettävissä Rpn13: n sitoutumiseen. Tärkeää on, että kaikki K48-diubin tai K48-tetraubin smFRET-titraukset, high-FRET-lajien keskitehokkuus muuttuu vähän rpn13: n tai Rpn13NTD: n puuttuessa tai läsnä ollessa. Tämä tarkoittaa, että Rpn13 sitoutuu olemassa olevaan K48-diubin konformaatioon konformaatiomekanismin kautta riippumatta siitä, onko K48-diUb itsessään vai osa pidempää Ub-ketjua. Se tarkoittaa myös sitä, että korkea-tuskainen laji eli K48-diubin edeltävä kompakti tila ei ole täysin sulkeutunut, vaan on valmis vuorovaikutukseen muiden proteiinien kanssa. Tärkeää on, että korkeakärkisten lajien valikoiva rikastuminen osoittaa myös, että Rpn13: n pitäisi olla vuorovaikutuksessa molempien Ub-alayksiköiden kanssa samanaikaisesti.

Rpn13 sitoutuu ensisijaisesti K48-sidokseen diUb

arvioidaksemme rpn13: n sitoutumisespesifisyyttä K48-sidokselle arvioimme rpn13: n ja muuntyyppisten Ub-proteiinien välisiä sitoutumis affiniteetteja. Kun titraus 200 nM rpn13ntd osaksi 150 pM fluorofore-merkitty K48-diUb, populaatio high-tuskailla lajien kasvaa 15% ~48% ~63% (Kuva. 1). Tällä pitoisuudella K48-diUb-sitoutuminen ei vielä kyllästy rpn13ntd: llä(Kuva. 1g) ja siksi korkeakärkisten lajien populaatio on herkkä käytettävissä olevan Rpn13NTD-pitoisuuden pienille muutoksille. Leimaamaton K48-diUb voi kilpailla sitoutumisesta rpn13ntd: hen fluoroforimerkityllä K48-diubilla. Lisäämällä 150 pM nimetön K48-diUb, populaatio korkea-tuskailla lajien vähenee 7,5%, mikä vastaa 50% esto rpn13ntd-sidottu fluorofore-merkitty K48-diUb (Kuva. 2 a). Lisäämällä 300 pM nimetön K48-diUb, populaatio korkea-tuskailla lajien vähenee 11%, yhteensä 73% esto (Kuva. 2b). Sellaisenaan sekä fluorofore-merkitty että leimaamaton K48-diUb kilpailevat samasta sitovasta rajapinnasta rpn13: lla samanlaisella sitovalla affiniteetilla. Tämä tarkoittaa myös sitä, että fluoroforien konjugaatio K48-diubiin aiheuttaa vain vähän häiriötä Rpn13NTD: n ja K48-diubin väliselle vuorovaikutukselle.

A, B lisäys 200 nM Rpn13NTD ensin rikastuttaa korkea-tuskailla lajien fluorophore-merkitty K48-diUb (vrt. Kuva 1F), ja edelleen lisäämällä 150 pM ja 300 pM nimetön K48-diUb vähentää populaatiota korkea-tuskailla lajien. c, d lisäys 150 pM ja 300 pM merkitsemätön Ub monomeeri on vähäinen vaikutus populaatioon korkea-FRET lajien. e, f lisäys 150 pM K48-diUb ja 150 pM M1-diUb aiheuttaa erittäin pieni lasku populaation high-FRET lajien

lisäksi 200 nM rpn13ntd: n ja 150 pM: n fluorofore-merkittyyn K48-diubin seokseen lisättiin merkitsemätön Ub-monomeeri, K63-linkitetty diubikvitiini tai M1-linkitetty diubikvitiini, jotta voitaisiin arvioida, voivatko muut UB-tyypit syrjäyttää K48-diubin. Korkeaeväisten lajien populaatio muuttuu vain vähän, kun siihen lisätään 150 pM tai 300 pM Ub-monomeeri (Kuva. 2c, d). Kun mukaan on lisätty 150 pM K63-diUb ja 150 pM M1-diUb, myös korkearaajaisten lajien populaatiot ovat muuttumattomia virhealueella (Kuva. 2 e, f). Toisaalta 1 µM rpn13ntd: n suora titraus fluoroforikonjugoituneisiin K63-diubiin ja M1-diubiin aiheuttaa vain vähän muutoksia niiden olemassa oleviin smFRET-profiileihin (täydentävä Kuva. S7). Yhdessä, Rpn13NTD selektiivisesti vuorovaikutuksessa K48-diUb.

Rpn13ntd: n Ratkaisurakenne:K48-diUb-kompleksi

vaikka olemme nyt osoittaneet Rpn13NTD: n olevan selektiivisesti vuorovaikutuksessa K48-diubin kanssa, vain kompleksirakenne Rpn13NTD: n ja Ub-monomeerin välillä on määritetty 6,8. Jotta ymmärtäisimme, miten K48-diubin kaksi alayksikköä voivat samanaikaisesti olla vuorovaikutuksessa Rpn13NTD:n kanssa, määritimme rpn13ntd: n ratkaisurakenteen: K48-diUb complex käyttäen ydinmagneettista resonanssia (NMR). Proteiinikompleksin muodostuessa interfacial-jäämät kokisivat erilaisen paikallisen ympäristön ja näyttäisivät siksi NMR-signaaleja. Havaitsimme, että merkitsemättömän K48-diUb: n titraaminen 15N-merkittyyn Rpn13: een aiheuttaa suuria kemiallisia siirtymävaurioita (CSPs), joihin liittyy pääasiassa jäämiä 73-83 ja 93-106 (Kuva. 3 A). Nämä jäämät muodostavat yhtenäisen pinnan rpn13: lle ja kattavat pinta-alan,joka on suurempi kuin aiemmin määritetyn kompleksirakenteen rpn13ntd: n ja Ub: n monomeeri 6, 7: n välillä on odotettavissa. Toisaalta, titraamalla merkitsemätön Rpn13NTD K48-dUb, joko proksimaalinen tai distaalinen Ub 15N-merkitty ja toinen alayksikkö merkitsemätön, CSPs on pääasiassa havaittu jäämiä β-arkin alueella molempien Ub alayksiköiden. Myös osa interfacial jäämistä katosi kompleksin muodostuessa (Kuva. 3b, c).

A-c CSP: n keskiarvona oli yli 1h ja 15N selkärangan amidiprotonien mitat kompleksin muodostuessa 0,2 mM isotooppimerkityillä ja merkitsemättömillä proteiineilla. Pikkukuvat: 15N-merkitty alayksikkö on kuvitettu pinta esitys, ja punainen värillinen jäämät on CSPs yläpuolella katkoviiva. d, e paramagneettisella anturilla konjugoituna distaalisen Ub: n e24c-kohtaan, paramagneettisten ja diamagneettisten spektrien väliset intensiteettisuhteet ja Pre Γ2-arvot arvioitiin 15N-merkittyjen rpn13ntd: n selkärangan amidiprotoneille. Harmaat laatikot osoittivat jäämiä, joilla on erittäin suuri intermolecular PREs. f kun paramagneettinen luotain konjugoitui proksimaalisen Ub: n n25c-kohtaan, Γ2-arvot mitattiin 15N-merkityn distaalisen Ub: n amidiprotoneille K48-diubissa. Virherivit osoittavat 1 S. D., ja jäännökset täysin laajentunut ulos monimutkainen merkitään tähdillä

Nuclear Overhauser effect (NOE) raportoi ydinten välisen etäsuhteen (<6 Å). Lisäksi 13C puolisuodatettu NMR-koe voi tuottaa NOE: tä 12C-sidotun protonin ja 13c-sidotun protonin välille eli intermolekulaarista etäsuhdetta. Saimme intermolekulaariset NOEs välillä Rpn13NTD ja proksimaalinen Ub, välillä Rpn13NTD ja distaalinen Ub, ja välillä proksimaalinen Ub ja distaalinen Ub (täydentävä Kuva. S8). Lisäksi konjugoimme maleimidi-EDTA-Mn2+ paramagneettisen koettimen distaalisen Ub: n e24c-paikalla ja keräsimme paramagneettisen relaksaatioparannuksen (PRE) rpn13ntd: n selkärangan amidiprotoneille vakiintuneen protocol22, 35-protokollan mukaisesti. Rpn13-jäämät 30-42 ja 101-106 kokevat suuren PREs: n, johon liittyy vakava viivan laajeneminen (Kuva. 3d, e). Konjugoimme myös paramagneettisen luotaimen proksimaalisen Ub: n n25c-kohtaan ja arvioimme distaalisen Ub: n poikittaisen relaksaationopeuden Γ2 (Kuva. 3 F). Ligandivapaan K48-diubin kahden Ub-alayksikön välillä havaitaan suuria PRE-arvoja, ja rpn13ntd: n lisääminen lisää inter-Ub PREs-arvoa, mutta vastaavalla Pre-profiililla. PRE NMR-kokeet vahvistavat siis, että Rpn13NTD rikastaa K48-diubin ennestään kompaktia tilaa.

tarkentaa rpn13ntd: tä:K48-diUb complex-rakenne kokeellisia rajoituksia vastaan suoritimme jäykän rungon telakoinnin vääntökulman vapaudella, joka annettiin diUb linker-jäämille ja interfacial-jäämien sivuketjuille. 20 alimman energian konformeerille kaikkien jäykkien jäämien runkoraskaiden atomien juuri-keskiarvo-neliö (RMS) – poikkeama on 0,86 ± 0,54 Å (täydentävä Kuva. S9 ja taulukko S1). K48-diubin kaksi Ub-alayksikköä ovat edelleen yhteydessä kompleksiin, joka hautaa liuottimen käytettävän pinta-alan (SASA) ~1130 Å2. Toisaalta, Rpn13NTD kiilat, hautaamalla ~940 Å2 SASA kanssa proksimaalinen Ub ja ~1300 Å2 SASA kanssa distaalinen Ub (Kuva. 4 A). Tässä tutkimuksessa K48-diubin kompleksirakenne rpn13ntd: n ja proksimaalisen Ub: n välillä on samanlainen kuin tunnettu kompleksirakenne Rpn13NTD: n ja Ub: n monomer6,7: n välillä, RMS-ero runkoraskaille atomeille 2.17 ± 0.31 Å (täydentävä Kuva. S10a). Mielenkiintoista on, että vaikka proksimaalisen Ub: n hydrofobiset jäämät L8, I44 ja V70 ovat mukana vuorovaikutuksessa Rpn13: n kanssa, samat kolme distaalisen Ub: n jäämää hautautuvat Ub-Ub-rajapintaan.

rakenne Rpn13NTD: K48-diUb monimutkainen. Kompleksin muodostuminen hautaa laajat rajapinnat alayksiköiden välille. b Rpn13ntd: n sähköstaattiset potentiaaliset pinnat ja K48-diUb: n distaalinen UB, piirrettynä ± 3 kBT: n asteikolla. Jäämät R104 rpn13ntd: ssä ja D39 distaalisessa Ub: ssä esitetään palloina ja tikkuina. c r104e charge-reversal mutaatio rpn13ntd: ssä aiheuttaa smfretin arvion mukaan 300-kertaisen vähenemisen sitoutumisaffiniteetissa K48-diubiin (vrt. Täydentävä Kuva. S11). KD-arvo ilmoitetaan parhaana istuvuuden ± asennusvirheenä. d Western blot-analyysit osoittavat, että rpn13 R104E-mutantin transfektio (jossa on N-terminaalinen lippu) lisää K48-linkitettyjen polyubiproteiinien kokonaismäärää solussa. E Cell virabilities upon heat shock (related to cells without heat shock) show that transfection of Rpn13 R104E mutant, but not of wildtype Rpn13, confers thermotolerance. *P < 0, 05, ** * P < 0.001, saman ryhmän kontrollisoluihin, pariton t-testi; ##P < 0, 01, ##P < 0, 001, käsittelemättömiin soluihin, joissa on lämpöshokki, yksisuuntainen ANOVA; &&P < 0.01, &&&P < 0, 001, villityyppisiin Rpn13-transfektiosoluihin, joissa on lämpöshokki, yksisuuntainen ANOVA

rpn13ntd: K48-diUb monimutkainen rakenne voidaan myös vahvistaa yhden molekyylin tuskailla tietoja. Monimutkaisen rakenteen perusteella mallinnimme fluoroforit niiden konjugaatiokohdissa K48-diubissa. Keskimääräinen etäisyys on 43,2 ± 5.8 Å välillä geometrinen keskusten fluorifore aromaattisten renkaiden, joka vastaa teoreettinen tuskailla tehokkuutta 0,73 ± 0,13 (täydentävä Kuva. S10b). Tämä arvo on lähes sama kuin korkean tuskan lajeille havaittu keskitehokkuus (Kuva. 1 A).

Rpn13ntd: n häiriöt: distaalinen Ub-vuorovaikutus aiheuttaa ubikitinoituneiden proteiinien kertymistä soluun

kompleksirakenteessa rpn13ntd: n ja K48-diubin välillä, rpn13ntd: n ja proksimaalisen Ub: n välinen vuorovaikutus on samanlainen kuin rpn13ntd: n ja Ub: n monomeerin välinen vuorovaikutus, kuten aiemmin on raportoitu (täydentävä Kuva. S10a). Siten suunnittelimme kokeita, joilla arvioitiin toiminnallista merkitystä rpn13ntd: n ja K48-diubin distaalisen Ub: n väliselle vuorovaikutukselle. Monet varatut jäämät sijaitsevat rpn13ntd: n ja K48-diubin distaalisen Ub: n rajapinnassa, ja siksi sähköstaattisella voimalla voi olla tärkeä rooli kompleksin stabiloinnissa (Kuva. 4b). Niistä jäännös D39 distaalisessa Ub: ssä on lähellä jäämää R104 rpn13: ssa. Näin mutatoimme rpn13-jäännöksen R104 glutamaatiksi ja titrasimme mutantin Rpn13NTD: n fluorofore-merkityksi K48-diubiksi. Mutanttiproteiini rikastaa K48-diubin (Supplementary Fig. S11). Sitova affiniteetti kuitenkin heikkenee huomattavasti. Sitova isotermi voidaan asentaa KD-arvoon 10,0 ± 3,3 µM, noin 300 kertaa heikompaan kuin wildtype Rpn13NTD (Kuva. 4c). Yhteys distaaliseen Ub: hen on tärkeä rpn13: n ja K48-diubin välisen erityistunnustuksen kannalta.

r104e-mutantin vähentynyt sitoutumisaffiniteetti antoi mahdollisuuden arvioida rpn13: n ja K48-linkittyneen Ub-ketjun välisen vuorovaikutuksen toiminnallista merkitystä. Villityypin rpn13 ohimenevä transfektio lisää hieman K48-linkitettyjen polyubiproteiinien määrää (Kuva. 4d). On mahdollista, että rpn13-transfektiossa ylimääräinen määrä vapaata Rpn13: a kilpailee sitoutumisesta K48-linkitettyihin polyubiproteiineihin proteasomiin liittyvän Rpn13: n kanssa, jolloin ubikitinoituneiden substraattiproteiinien rekrytointi proteasomiin ei ole yhtä tehokasta. Toisaalta rpn13 R104E-mutantin transfektio lisää huomattavasti K48-linkitettyjen polyubiproteiinien määrää verrattuna villityyppisellä Rpn13: lla transfektoituihin soluihin(Kuva. 4d). Positiivisena kontrollina inkuboimme soluja 1 µM MG132: lla, joka on voimakas proteasomin estäjä36. Labiiliproteiinien hajoamisen estymisen vuoksi mg132: n lisääminen lisää merkittävästi K48-linkitettyjen polyubiproteiinien määrää. Yhdessä rpn13: n R104E-mutaatio voi johtaa ubikitinoituneiden substraattiproteiinien kertymiseen. Tämän voidaan katsoa johtuvan proteasomiin liittyvän Rpn13-mutantin ja K48-diubin ja K48-poyubin heikommasta yhteisvaikutuksesta.

lämpöshokki voi heikentää solujen elinkykyä. Huomasimme, että 30 min lämpöshokki 43 °C: ssa voi vähentää hek293-solujen elinkelpoisuutta 75%: iin. Samanlainen kuin edelliset raporttit36, 37, havaitsimme myös, että mg132: n käsittelyllä on suojaava vaikutus solujen selviytymiseen lämpöshokin jälkeen, ja solujen elinkyky laski ~90%: iin (Kuva. 4 e). Tämä johtuu siitä, että MG132 estää proteasomaalista hajoamista, jolloin muuten lyhytikäisiä lämpöshokkiproteiineja on enemmän saatavilla (Kuva. 4d). Määritimme myös lämpöshokkisolujen elinkelpoisuuden, jotka on siirretty villityyppisellä Rpn13: lla, emmekä löytäneet merkittävää eroa kontrollisoluista ilman rpn13-transfektiota. Toisaalta rpn13 R104E transfektoitujen solujen solujen elinkyky laski ~83%: iin lämpöshokin jälkeen, mikä on huomattavasti suurempi kuin kontrollisolujen ja villityyppisellä Rpn13: lla transfektoitujen solujen (Kuva. 4 e). Tämä viittaa siihen, että mutantti Rpn13: lla on suojaava vaikutus solujen eloonjäämiseen lämpöshokin jälkeen, samanlainen kuin mg132: lla. Yhdessä rpn13: n ja K48: aan linkitetyn Ub-ketjun välinen vuorovaikutus on välttämätöntä rpn13-välitteiselle ubikitinoituneiden substraattiproteiinien tunnistamiselle proteasomin avulla, kun taas interfacial-pistemutaatio rpn13: ssa voi aiheuttaa tiettyjen substraattiproteiinien, kuten lämpöshokkiproteiinien, kerääntymistä ja antaa termotoleranssin transfektoituneille soluille.

Rpn13NTD:K48-diUb-vuorovaikutus voidaan kohdistaa moduloimaan rpn13-funktiota

Rpn13 rekrytoidaan dynaamisesti proteasomiin rpn13ntd: n ja rpn27,13: n C-terminaalisen hännän vuorovaikutuksen kautta. Monimutkainen rakenne tässä osoittaa, että sitova rajapinta rpn13ntd: llä rpn2: lle on lähellä mutta ei päällekkäinen K48-diubin distaalisen UB: n sitovan rajapinnan kanssa (Fig. 5 a). Näin esisekoitimme viimeiset 16 jäämää Rpn2:sta (Rpn2CTD) rpn13ntd:llä tai täyspitkällä Rpn13: lla 1: 1-suhteessa, ja titrattu Rpn13NTD: Rpn2CTD-kompleksi fluorifore-merkittyyn K48-diubiin. Rpn2ctd:n esisekoitus nosti rpn13ntd: K48-diubin KD-arvoa 33,1 ± 6,9 nM: stä (viikunat. 1g) arvoon 66,8 ± 13,9 nM(täydentävä Kuva. S12a-c ja Fig. 5b), kun taas laski Rpn13:K48-diubin KD-arvoa 119 ± 24 nM: stä (viikunat. 1d) arvoon 43,9 ± 12,8 nM(täydentävä Kuva. S12d-f ja Fig. 5c). Mittausepävarmuuden vuoksi rpn2ctd: n assosiaatio aiheuttaa vain pientä häiriötä Rpn13: n ja K48-diubin väliselle sitovalle affiniteetille, joka voi liittyä myös linkerin läsnäoloon ja Rpn13: n C-terminaaliseen domainiin.

a rpn13ntd: n K48-diubin distaalisen UB: n sitova pinta on rpn2ctd: n sitovan pinnan vieressä. Kanssa Rpn13NTD-Rpn2CTD monimutkainen rakenne (PDB koodi 5V1Y) päällekkäin rpn13ntd, Rpn2CTD näkyy punainen sarjakuva. Rpn13 jäännös K34 on lähellä distaalisen Ub: n C-terminusta (esitetty katkoviivana). B, c sitovat affiniteetit saatiin ekvimolaarisen Rpn13NTD:Rpn2CTD:n tai Rpn13: Rpn2CTD: n smfret-titrauksista fluorofore-merkittyyn K48-diubiin. KD-arvot ilmoitetaan parhaan istuvuuden ± asennusvirheinä. d Rpn2-ankkuroituneen Ub-monomeerin sitoutuminen vie todennäköisesti distaalisen Ub: n saman sitoutumispinnan, mikä aiheuttaa jälkimmäisen siirtymisen. e, f smFRET-kilpailun kokeet, joissa lisätään edelleen 150 pm Rpn2CTD-Ub-fuusioproteiinia 200 nM rpn13ntd-tai täyspitkään Rpn13-ja 150 pM fluoroforimerkittyyn K48-diUb-seokseen (c.f. Kuva 1c ja f). Virhe osoittaa 1 SD: tä smFRET-lajien populaatioiden kolmesta riippumattomasta mittauksesta

Rpn2 ja distaalinen Ub K48-diUb miehittää lähellä pinnat rpn13ntd. Siksi fuusioproteiini, jossa on Rpn2CTD: n C-terminukseen liitetty Ub-monomeeri, voi työntyä ulos ja häiritä rpn13ntd: n vuorovaikutusta K48-diubin distaalisen Ub: n kanssa (kuva. 5d). Kuten olemme osoittaneet, lisäämällä 200 nM rpn13ntd lisää populaation korkea tuskailla lajien 150 pM fluorophore-merkitty K48-diUb ~63% (Kuva. 1f), kun taas UB-monomeerin lisääminen ei voi kilpailla Rpn13NTD-sitomisesta (Kuva. 2c, d). Kun lisäsimme lisää 150 pM merkitsemätön Rpn2CTD-Ub fusion proteiini, populaatio korkea tuskailla lajien vähenee ~4% ~59% (Kuva. 5 e). Toisaalta olemme osoittaneet, että lisäämällä 200 nM täyspitkä Rpn13 lisää populaation korkea tuskailla lajien 150 pM fluorophore-merkitty K48-diUb ~60% (Kuva. 1c). Lisäksi lisäämällä 150 pM unlabeled Rpn2CTD-Ub fusion proteiini vähentää populaation high-tuskailla lajien ~4.5 ~55.5% (Kuva. 5 F). Huomaa, että UB: n liittäminen rpn2ctd: hen ei juuri vaikuta rpn2ctd: n ja Rpn13NTD: n väliseen vuorovaikutukseen (täydentävä Kuva. S13). Siten, meidän tiedot osoittavat, että Rpn2 ja K48-diUb sitova rajapinnat rpn13ntd ovat lähellä toisiaan. Vielä tärkeämpää on, että Rpn2-ankkuroitu Ub voi fyysisesti estää distaalisen diubin pääsyn Rpn13: een ja heikentää K48-diubin ja Rpn13: n vuorovaikutusta.