Kinaasimääritys
valmistettu Swathi Arur
proteiinikinaasi (kantaliuokset 1 – 10 mg/ml puhtaita kinaaseja) – näissä määrityksissä käytän puhdistettua ERK2-kinaasia (NEB). Kullekin entsyymille on tärkeää määrittää optimaalinen puskuri, ionilujuus ja pH aktiivisuudelle. Jos näitä ehtoja ei ole vahvistettu, lähtökohtana voidaan käyttää jäljempänä lueteltua protokollaa.
substraatti (kantaliuos 10 mM) – substraatit sisältävät tyypillisesti yhden seriinin /treoniinin fosforylaatiokohdassa. Kontrollina käytän Sigmasta saatua myeliinin Perusproteiinia, jota NEB käytti erk2-kinaasin kalibrointiin.
lisäksi substraateilla on oltava positiivinen nettovaraus, joka helpottaa sitoutumista määrityksessä käytettäviin fosfoselluloosasuodattimiin. Fosfoselluloosapaperiin sitoutumiseksi suositellaan vähintään 2 emäksistä jäämää ja vapaata aminoterminaalia. Jos fosforylaatiokohdan motiivia ei tunneta, voidaan käyttää yleistä tyrosiinikinaasisubstraattia. Esimerkiksi” myeliini Basic Protein ” (on monille Mapkeille epäspesifinen substraatti). Ensireaktioissa tulee käyttää substraattipitoisuutta 0,7-1,5 mM. Synteettisen peptidin fosforylaation kineettisten parametrien määrittämiseksi tarvitaan peptidipitoisuuksien vaihteluväli
10x Kinaasipuskuri – sisältää 5 mg/mL BSA: ta (estämään kinaasin adsorptio määritysputkeen), 150 mM Tris-Cl (pH 7.5).
ATP/MgCl2(ostettu Upstate Biotech-Magnesium / ATP Cocktail # 20-113) – 1-5 mM kantaliuos on kätevä. Huomaa, että useimmilla Mapkeilla On Km-arvot ATP: lle alueella 10-150 uM, joten kineettisissä kokeissa on tärkeää käyttää kyllästyviä ATP-pitoisuuksia peptidien Km-ja Vmax-arvojen saavuttamiseksi.
ATP – 10 mCi / mL.
ERK2-Kinaasimääritykset
a) AUTORADIOGRAFIAMÄÄRITYS:
- standardikinaasimääritys tehdään tilavuudelle 25 ul:
- 2, 5 ul 10-kertaisella kinaasipuskurilla
- 5 ul 1, 0 mM: n MgCl2 /ATP (0, 2 mM: n loppupitoisuus)
- ATP (100-500 cpm/pmol)
- 3 ul 10 mM: n substraatilla (1.2 mM lopullinen pitoisuus)
- 1 U erk2-kinaasia
- H2O – 25 ul
1. Ennen kokeita valmistetaan cocktail, joka sisältää tarpeeksi puskuria, ATP: tä ja ATP: tä määritysten loppuun saattamiseksi. Testeissä, joissa substraattipitoisuus on erilainen, substraatti on laimennettava ja lisättävä erikseen kuhunkin putkeen. Kun olet Annostellut cocktailin 1,5 ml: n mikrosentrifugiputkiin, laita putket vesihauteeseen 30 asteeseen 30 minuutiksi. Reaktiot aloitetaan lisäämällä kinaasia ja niiden annetaan edetä 30 asteessa C.
2. Halutun ajan kuluttua, lopettaa reaktiot lisäämällä 2 X SDS näyte puskuri ja loppuu geeli.
3. Kuivaa geeli Whatman 3.0-paperille ja altista kuivageeli autoradiogrammille ja pidä kasetti-70C 2 tunnin ajan. (pidemmillä altistuksilla varmista, että kalvo on jälleen kuiva, ennen kuin laitat siihen uuden autoradiogrammin).
b)kineettinen analyysi:
1. Suorita kinaasimääritys kuten edellä, tällä kertaa Käytä substraattien eri pitoisuuksia alkaen 50 nm: stä 1 mm: iin. Keskeytä reaktio 30 minuutin kuluttua lisäämällä jokaiseen reaktioon 45 ul-jääkylmää 10-prosenttista trikloorietikkahappoa (TCA). Vortex reaktioita.
3. Pyöräytä 2 minuuttia mikrosentrifugilla (10K rpm).
4. Spot 35 ul supernatants päälle 2.1 cm halkaisija Whatman P81 selluloosafosfaatti suodatin piireissä.
6. Pese P81-suodatinpiirit kolme kertaa 500 ml: lla kylmää 0,5% fosforihappoa (5-10 minuuttia per pesu). Pesuvaiheiden etenemistä voidaan seurata poistamalla P81-suodatinympyrä tyhjän reaktion varalta ja tarkistamalla se Geigermittarilla.
7. Pese kerran 200 ml: lla asetonia huoneenlämmössä 5 minuutin ajan.
8. Anna suodatinpiirien kuivua huoneenlämmössä.
9. Laita suodatinpiirit tuikepulloihin ja mittaa 32P sisällyttäminen laskemalla tyynyt kuiviksi tuikelaskurissa. ATP: n spesifinen aktiivisuus kinaasireaktiossa (esim.CPM/pmol) voidaan määrittää tiputtamalla pieni näyte (2-5 ul) reaktiosta P81-suodatinympyrään ja laskemalla suoraan (ei pesua). Kinaasireaktiossa saadut minuuttimäärät (miinus nolla) jaetaan tämän jälkeen ominaisaktiivisuudella reaktiossa siirretyn fosfaatin moolien määrittämiseksi.
substraatin fosforylaation kinetiikka
MAPK: n suorittaman substraatin fosforylaation kineettiset parametrit voidaan määrittää käyttämällä yllä olevan protokollan muutosta.
1. Suorita reaktio suurella substraattipitoisuudella, jotta valkuainen on substraatti.
2. Vaihtele entsyymipitoisuutta määrityksessä. Substraatin fosforylaationopeuden on oltava verrannollinen entsyymipitoisuuteen määritysolosuhteissa. Tätä koetta käytetään myös kineettisissä tutkimuksissa tarvittavan entsyymimäärän määrittämiseen.
nopeuksien määrittämiseksi on suoritettava substraatin fosforylaation aikajakso. Tällöin valmistetaan suurempi entsyymireaktio (käytämme 150 ul). Halutuissa aikapisteissä, vedä 25 ul aliquotia ja siirrä ne mikrokentrifugiputkiin, jotka sisältävät 45 ul jääkylmää 10% TCA: ta, ja analysoi reaktiot edellä kuvatulla tavalla. Substraatin fosforylaation tulee olla lineaarista ajan kanssa, ja kineettisten vakioiden mittaamiseen tulee käyttää reaktion alkunopeutta (5%).
3. Vaihtele substraattipitoisuutta määrityksessä. Käytä nopeus vs. peptidipitoisuus käyrää, jotta saadaan alustava arvio Km: n arvosta. Tässä alkumittauksessa on käytettävä monenlaisia substraattipitoisuuksia (esim.20 uM-2 mM).
4. Jos haluat määrittää Km: n (substraatti) ja Vmax: n , muuta substraattipitoisuutta ja mittaa fosfaatin siirtonopeus. Hyvä valikoima substraattipitoisuuksia ovat seuraavat kerrannaiset Km: 0,125 X Km, 0,25 X Km, 0,5 x Km, 1,0 x Km, 2,0 x Km, 4,0 x Km, 8,0 x Km. Reaktiot on suoritettava kolmena kappaleena parhaiden tulosten saavuttamiseksi.
5. Kineettiset vakiot määritetään painotettujen epälineaaristen pienimpien neliöiden avulla, jotka sopivat hyperboliseen nopeuteen vs. tontteja käyttäen iteratiivisia ohjelmia, kuten NFIT (Island Products, Galveston, TX).
RAR:
RAR: Relative Acceptor Ratio = Vmax / Km määritettynä proteiinin substraattina toimimiskyvyn kokonaismittarina.
normalisoin tietyn substraatin RAR: n myeliinin Perusproteiinin kanssa, eli lasken kullekin substraatille RAR: n arvon ja jaan sen sitten myeliinin Perusproteiinin RAR: n arvolla (jolloin MBP: ksi asetetaan 1,0).
