- Abstrakti
- 1. Johdanto
- 2. Materiaalit ja reagenssit
- 2.1. Ihmisen Limbaaliepiteelisolujen eristäminen ja viljely
- 2.2. Pesäkemuodostuksen Tehokkuusmääritys (CFE)
- 2.3. Solupopulaation Kaksinkertaistumistesti
- 2.4. RNA-uutto ja kvantitatiivinen reaaliaikainen polymeraasiketjureaktio
- 2.5. Immunofluoresenssivärjäys
- 2.6. Western Blot-analyysi
- 2.7. Tilastot
- 3. Tulokset
- 3.1. Sarveiskalvon Epiteelikantasolujen fenotyyppi SR-väliaineessa
- 3.2. CFE-määritys
- 3.3. PCR ja reaaliaikainen PCR-analyysi
- 3.4. Immunofluoresenssivärjäys
- 3.5. Western Blot
- 4. Keskustelu
- kilpailevat intressit
- kiitokset
Abstrakti
limbaaliepiteelisolut voidaan säilyttää 3T3-syöttökerroksella sikiön naudan seerumilla täydennetyllä viljelyalustalla, ja näitä soluja on käytetty menestyksekkäästi limbaalin kantasolujen puutteen hoitoon. Sikiön naudan seerumi sisältää kuitenkin tuntemattomia komponentteja, ja siinä esiintyy määrällisiä ja laadullisia eräkohtaisia vaihteluita. Viljelmätilan parantamiseksi tutkittiin määritettyä KnockOut – seerumikorvausta, jolla korvattaisiin sikiön naudan seerumi ihmisen limbaalisen epiteelisolun viljelyä varten. Ihmisen primaariset limbaaliset epiteelisolut viljeltiin KnockOut-seerumissa ja sikiäin-nautojen seerumissa täydennettynä väliaineessa. Solujen kasvunopeutta, geeniekspressiota ja limbaalisten epiteelikantasolujen ylläpitoa tutkittiin ja verrattiin näiden kahden ryhmän välillä. Ihmisen primaariset limbaaliset epiteelisolut eristettiin ja viljeltiin onnistuneesti sarjamuotoisesti tässä uudessa KnockOut-seerumilla täydennetyssä väliaineessa; solujen proliferaatio ja kantasolujen ylläpitokyky olivat samanlaisia kuin sikiöiden seerumilla täydennetyssä väliaineessa kasvaneilla soluilla. Nämä tiedot viittaavat siihen, että tämä KnockOut serum compleded medium on tehokas korvaaja perinteiselle sikiöiden naudan seerumin täydennetylle Mediumille limbaaliepiteelisoluviljelmässä, ja tällä välineellä on suuri potentiaali limbaaliepiteelisolujen pitkäaikaiseen ylläpitoon, limbaaliepiteelisolujen siirtoon ja kudosten uudistumiseen.
1. Johdanto
sarveiskalvon epiteelikantasolut sijaitsevat limbuksen tyvikerroksessa, joka on Vogtin palisadeiksi kutsuttu aaltomainen ja pigmentoitunut rakenne . Nämä kantasolut ylläpitävät sarveiskalvon epiteelin jatkuvaa uusiutumista koko eliniän ajan ja korvaavat vahingoittuneet tai Kadonneet sarveiskalvon epiteelisolut . Limbaalikantasolupuutos (LSCD) ja siihen liittyvät silmän pintasairaudet voidaan hoitaa onnistuneesti viljellyllä limbaaliepiteelillä . Näiden leikkaushoitojen onnistuminen riippuu limbaalisen epiteelikantasolun tehokkaasta laajentumisesta, johon liittyi useimmissa tapauksissa 3T3-syöttökerros ja sikiön naudan seerumi (FBS). Rheinwaldin ja Greenin perustaman 3T3-syöttökerroskasvatusjärjestelmän avulla on onnistuttu laajentamaan epiteelisoluja ihmisen ihosta, karvatupesta, limbuksesta, sidekalvosta ja suun limakalvosta . FBS ei kuitenkaan ole tarkasti määritelty, ja se näyttää aina määrällisiä ja laadullisia erävaihteluita . FBS sisältää myös mahdollisesti haitallisia ksenogeenisiä ainesosia, jotka voivat stimuloida immunologisia reaktioita ja levittää eläintauteja ja taudinaiheuttajia . Kaikkien näiden huolenaiheiden vuoksi on yhä suurempi tarve kehittää tarkoin määriteltyä viljelyalustaa perinteisen FBS: n täydennetyn viljelyalustan tilalle.
tällä hetkellä on olemassa tiettyjä seerumista vapaita vaihtoehtoisia väliaineita epiteelisolujen kasvulle, kuten määritelty keratinosyyttien Seerumivapaa kasvualusta (KSFM™, Invitrogen, USA), keratinosyyttien kasvualusta (kgm™, Clintech, USA), Epilife™ (Invitrogen, USA) ja Progenitorisolukohtainen (PCT) media (Cellntec™, Sveitsi). Näiden tuotteiden on osoitettu tukevan sarveiskalvon epiteelisolujen laajenemista. Ne tarvitsevat kuitenkin edelleen täydentäviä tuotteita, joita ei ole määritelty, kuten naudan aivolisäkkeen uutetta (BPE) tai ihmisen seerumin albumiinia (HAS). Ja useimmat näistä väliaineista vaativat suurta solujen kylvötiheyttä, mikä ei ehkä ole käytännöllistä ihmisen sarveiskalvon epiteelisolujen laajentamisessa. Lisäksi sarveiskalvon epiteelikantasoluja, jotka havaitaan holokloneina 3T3-viljelyjärjestelmässä, ei voitu ylläpitää tässä seerumittomassa viljelyaineessa pitkään . Toistaiseksi ei ole määritelty seerumitonta väliainetta, joka voisi tukea sarveiskalvon epiteelikantasolujen laajenemista pitkällä aikavälillä.
KnockOut serum replacement (sr) on määritelty seerumivapaa formulaatio, joka on suunniteltu korvaamaan FBS suoraan alkion kantasolujen (ESCs) ja indusoitujen pluripotenttien kantasolujen (iPSCs) ylläpidossa. On osoitettu, että KnockOut SR tarjoaa yhdenmukaiset kasvuolosuhteet ES-solu-ja iPSC-viljelmille ja että KnockOut SR-täydennetyllä viljelyalustalla kasvatetut es-solut eroavat huomattavasti vähemmän toisistaan kuin FBS-täydennetyllä viljelyalustalla kasvatetut solut, eikä itulinjan siirto vaarannu vähimmässäkään määrin. Kun otetaan huomioon epiteelisolujen ja ES-solujen viljelymenetelmien samankaltaisuudet ja se, että KnockOut SR korvaa FBS: n ES-soluviljelmässä, tässä oletetaan, että KnockOut SR: ää voitaisiin käyttää korvaamaan FBS limbaalisessa epiteelisoluviljelmässä.
2. Materiaalit ja reagenssit
Soluviljelyastiat, pullot, sentrifugiputket ja serologiset pipetit ostettiin Becton Dickinsonilta (Franklin Lakes, NJ; http://www.bd.com/). Dulbeccon muunneltu Eagle ’s Medium (Dmem), Ham’ s F-12, HEPES, penisilliini ja streptomysiini, L-glutamiini, 0,05% trypsiini-0.02% EDTA solution, Superscript III kit ja RNeasy™ kit hankittiin Invitrogen-GIBCO BRL: ltä (Grand Island, NY; http://www.invitrogen.com/). Fetal bovine serum (FBS) ostettiin Hyclonelta (Logan, UT; http://www.hyclone.com/). Hiiren nih 3T3 fibroblastit (ATCC CCL 92) saatiin American Type Culture Collectionista (Rockville, MD; http://www.atcc.org/). Dispase II oli rochelta. Monoklonaalinen vasta-aine (MAB) Abcg2: ta (klooni BXP-21) ja connexin 43: a vastaan oli Milliporesta; p63 (klooni 4A4), K5 ja K19 tuli Santa Cruzista; K3 mAb (klooni AE5) oli ICN Pharmaceuticalsista (Costa Mesa, CA; http://www.mpbio.com/). Alexa Fluor 568-konjugoitu vuohen anti-hiiri toissijainen vasta-aine oli Invitrogen-GIBCO BRL (Grand Island, NY; http://www.invitrogen.com/). GeneAmp RNA-PCR ja Taqman Universal PCR Master Mix AmpErase UNG-sarjat olivat Applied Biosystemsiltä (Foster City, CA; http://www.appliedbiosystems.com/). Mitomysiini C, naudan insuliini, ihmisen transferriini, hydrokortisoni, ihmisen epidermaalinen kasvutekijä (EGF), koleratoksiini ja muut reagenssit olivat peräisin Sigma-Aldrichista (St. Louis; http://www.sigmaaldrich.com/).
2.1. Ihmisen Limbaaliepiteelisolujen eristäminen ja viljely
sarveiskalvo-limbaalirenkaat kerättiin viideltä terveeltä luovuttajalta heti sarveiskalvon siirron jälkeen, haettiin tietoon perustuvaa suostumusta ja Jilinin yliopiston Institutional Review Board (Irb) hyväksyi näytteenottoprotokollan. Tuoreita sarveiskalvon limbaalirenkaita hoidettiin 0, 25% Disase II: lla 4°C: ssa yön yli, ja epiteelikerros hangattiin alla olevasta stroomakudoksesta ja hoidettiin 0, 05% trypsiinillä-0, 02% EDTA: lla 37°C: ssa 15 minuutin ajan. Trypsiinin aktiivisuus neutraloitiin 10% FBS: llä ja dissosioituneet limbaaliset epiteelisolut kerättiin ja sentrifugoitiin nopeudella 1 500 rpm 5 minuutin ajan. Epiteelisolujen elävyys määritettiin trypansinisellä ilman värjäytymistä ja solujen lukumäärä laskettiin hemosytometrillä.
hiiren 3T3 fibroblasteja säilytettiin Dulbeccon modifioidussa Kotkan väliaineessa (dmem, korkea glukoosi) täydennettynä 10% FBS: llä, l-glutamiinilla (2 mM) ja penisilliini-streptomysiinillä (50 IU/mL) ja viljeltiin 5% CO2: lla ja kostutetulla ilmakehällä. 3T3-soluja viljeltiin alikulttuurilla 6 päivän välein, kun ne saavuttivat 80-90% yhtymäkohtaa. 3T3-soluja ylläpidettiin sarjatuotantona, ja vain soluja ennen kulkua 20 käytettiin syöttökerroksen valmistukseen. Syöttökerroksen valmistamiseksi konfluentteja 3T3-soluja käsiteltiin mitomysiini C: llä (10 µg/mL) 2 tunnin ajan 37°C: ssa, pestiin PBS: llä kahdesti ja käsiteltiin 0, 05% trypsiinillä 5 minuutin ajan 37°C: ssa.3T3-fibroblasteja kerättiin ja päällystettiin tiheydellä 30 000 solua/cm2 päivää ennen epiteelisolujen kylvöä.
ihmisen limbaalisia epiteelisoluja viljeltiin 3T3-syöttökerroksella käyttäen joko FAD-alustaa tai seerumikorvausalustaa (SR). FAD-elatusaine on dmem : n ja Hamin F-12-elatusaineen (1: 1) seos, joka sisältää 10% sikiön naudan seerumia, L-glutamiinia (2 mM) ja penisilliini-streptomysiiniä (50 IU/mL), epidermaalista kasvutekijää (10 ng/mL), insuliinia (5 µg/mL), adeniinia (0, 18 mm), hydrokortisonia (0, 4 µg/mL), koleratoksiinia (0, 1 nM) ja trijodityroniinia (2 nM). SR-elatusaine on dmem : n ja Hamin F-12-elatusaineen (1: 1) seos, joka sisältää 10% KnockOut SR-seerumikorvausta, L-glutamiinia (2 mM) ja penisilliini-streptomysiiniä (50 IU/mL), epidermaalista kasvutekijää (10 ng/mL), insuliinia (5 µg/mL), adeniinia (0, 18 mM), hydrokortisonia (0.4 µg / mL), koleratoksiini (0,1 nM), trijodityroniini (2 nM), transferriini (5 µg/mL) ja seleeni (5 ng/mL). Limbaaliset epiteelisolut kylvettiin 3T3-syöttökerrokseen tiheydellä 6 000 solua / cm2 ja viljeltiin 5% CO2: lla ja kostutetulla ilmakehällä. FAD-välinettä vaihdettiin 3 päivän välein, kun taas SR-välinettä vaihdettiin 2 päivän välein.
2.2. Pesäkemuodostuksen Tehokkuusmääritys (CFE)
CFE-määrityksessä fad-viljelmästä tai SR-viljelmästä saadut 200 ihmisen limbaaliepiteelisolua pinnoitettiin 100 mm: n petrimaljaan, joka sisälsi mitomysiini C-käsitellyn 3T3-syöttökerroksen ja viljeltiin edellä kuvatulla tavalla. 12 päivän viljelyn jälkeen astiat kiinnitettiin 10% formaliinilla 30 minuutin ajan huoneenlämmössä ja värjättiin 1% Rodamiini B: llä toiset 30 minuuttia. Peseytymisen jälkeen tislatulla vedellä pesäkkeiden numerot laskettiin ja analysoitiin. Siirtokuntien muodostustehokkuus ilmaistiin muodostettujen siirtokuntien lukumääränä jaettuna 200: lla.
2.3. Solupopulaation Kaksinkertaistumistesti
Limbaaliset epiteelisolut pidettiin mitomysiinillä C käsitellyllä 3T3-syöttökerroksella käyttäen FAD-tai SR-alustaa. Epiteelisolut trypsinoitiin saavuttaessaan 80-90% yhtymäkohtaa ja ohitettiin tiheydellä 6 000 solua/cm2. Kulttuurit säilyivät sarjamuotoisina 10 kappaleen ajan. Jokaisen läpimenon yhteydessä kerättiin limbaalisia epiteelisoluja ja laskettiin solumäärät. Asukasluvun tuplaantuminen (PD) kullekin kulkuväylälle laskettiin seuraavan kaavan mukaan: , jossa on kunkin käytävän kohdalla saatujen solujen kokonaismäärä ja alussa olevien pinnoituskennojen lukumäärä.
2.4. RNA-uutto ja kvantitatiivinen reaaliaikainen polymeraasiketjureaktio
limbaalisten epiteelisolujen geeniekspressiotason, PCR: n ja reaaliaikaisen PCR: n arvioimiseksi suoritettiin. RNA: n kokonaismäärä erotettiin sarveiskalvon epiteelisoluista rneasy kit: n avulla valmistajan ohjeiden mukaisesti. RNA kvantifioitiin sen imeytymisnopeudella 260 nm ja varastoitui -80°C: n lämpötilaan. Cdnas: n syntetisoimiseen käytettiin 1 µg kokonais-RNA: ta Superscript III-Käänteiskopiopakkauksen kanssa. PCR suoritettiin Platinum PCR master mixillä (Life Technology), ja reaaliaikainen PCR suoritettiin SYBR Green PCR Master Mixillä (Roche) edellä kuvatuilla alukkeilla . Reaaliaikaiset PCR-reaktiot suoritettiin kolmena kappaleena ensimmäisen aktivaatiovaiheen ollessa 95°C: ssa 3 minuutin ajan, minkä jälkeen 45 sykliä: 95°C 30 sekunnin ajan, 60°C 30 sekunnin ajan ja 72°C 40 sekunnin ajan. Suhteellinen geeniekspressio laskettiin normalisoimalla syklin kynnysarvon (delta Ct), geenien arvojen ero glyseraldehydi-3-fosfaattidehydrogenaasin (GAPDH) Delta Ct-arvoon.
2.5. Immunofluoresenssivärjäys
ihmisen limbaaliepiteelisolut kylvettiin viljelmäviljelmiin, joissa oli 3T3-syöttökerros FAD-elatusaineessa tai SR-elatusaineessa. Kolme päivää kylvön jälkeen viljelmät kiinnitettiin 4% paraformaldehydiin tai kylmään asetoniin 4°C: ssa 10 minuutin ajan. Kun solut oli pesty PBS: llä kahdesti, solut tukittiin 5% vuohiseerumilla PBS: ssä 30 minuutin ajan. Hiiren primaariset vasta-aineet P63 : a (1 : 200, 4A4, Santa Cruz), ABCG2 : Ta (1 : 30, BXP-21, Millipore), K3: a (1: 400, Millipore) ja connexin 43: A (1: 1000, Millipore) vastaan levitettiin ja niitä inkuboitiin yön yli 4°C: ssa.Alexa Fluor 568-konjugoitua sekundaarista vasta-ainetta levitettiin 1 tunnin ajan PBS: llä kahdesti pesemisen jälkeen. Tämän jälkeen solujen tumia torjuttiin Hoechst 33342: lla (1 µg/mL PBS: ssä) 20 minuutin ajan. Kun soluviljelmä oli pesty PBS: llä 3 kertaa, se asennettiin kiinnitysaineella (Vector Laboratories, Burlingame, CA) ja tutkittiin fluoresoivalla mikroskoopilla (BX50; Olympus, Tokio, Japani).
2.6. Western Blot-analyysi
Viljellyt limbaaliset epiteelisolut lysättiin RIPA-puskurilla (10 mM Tris pH 7, 5, 150 mM NaCl, 1% natriumdeoksikolaatti, 1% Triton X-100, 1 mM EDTA ja proteaasi-inhibiittoricocktail; Roche Diagnostics) jäällä 30 minuutin ajan. Proteiinipitoisuus määritettiin bikinikoniinihapon (BCA) proteiinimäärityksellä (Pierce, Rockford, IL). Kokonaissolulysaatit (40 µg) elektroforisoitiin 12-prosenttisessa gradienttigeelissä, siirrettiin nitroselluloosakalvoon (Bio-Rad), estettiin 5-prosenttisella rasvattomalla maidolla Tris-puskuroidussa suolaliuoksessa (TBS) 1 tunnin ajan ja testattiin hiiren vasta-aineilla jakautuvaa solun tuma-antigeenia (PCNA, Santa Cruz, CA), ABCG2 : ta (BXP-21, Millipore) tai p63: a (4A4, Santa Cruz, CA) vastaan yön yli 4°C: ssa. kertaa TBS: llä, inkuboituna Goat Anti-Mouse IgG: llä (1: 5000, HRP-konjugoitu, Santa Cruz, CA) tai kani anti-Goat IgG: llä (1 : 5000, HRP-konjugoitu, Santa Cruz, CA) 1 tunnin ajan huoneenlämmössä ja kehitetty parannetuilla kemiluminesenssialustoilla (Pierce Biotechnology, Rockford, IL). Abcg2: n, PCNA: n ja p63: n lauseketasot mitattiin semikvantitatiivisella intensiteettimittauksella ja normalisoitiin gapdh-tasolle, joka toimi sisäisenä kontrollina.
2.7. Tilastot
Yhteenveto CFE: n tiedoista ja reaaliaikaisen PCR: n suhteellisesta kertaisuudesta raportoitiin keskiarvona ± SD ja niitä verrattiin käyttäen opiskelijan unpaired-testiä Microsoft Excelin kanssa (2003/XP-versio). Testitulokset raportoitiin kaksihäntäisinä arvoina, joita pidettiin tilastollisesti merkitsevinä.
3. Tulokset
3.1. Sarveiskalvon Epiteelikantasolujen fenotyyppi SR-väliaineessa
yhteensä 5 sarveiskalvon ja limbaalin rengaskudosta saatiin luovuttajilta, joiden ikä oli 32-65 vuotta. Nämä kudokset säilöttiin ja käsiteltiin 24 tunnin kuluessa sadonkorjuusta. Ihmisen primaarinen sarveiskalvon epiteelisoluviljelmä onnistuttiin perustamaan myös FAD-elatusaineeseen(Kuvat 1 a ja 1 b)) ja SR-elatusaineeseen(Kuvat 1 c ja 1 d)). Sarveiskalvon epiteelisolut, jotka säilyivät SR medium + 3T3-syöttökerroksessa, osoittivat morfologiaa, jossa oli pieni koko ja korkea Tuma/sytoplasma-suhde, mikä oli tyypillinen erilaistumattomien epiteelisolujen morfologia, ja suuria differentioituvia litteitä levyepiteelisoluja havaittiin harvoin (Kuva 1(c)). SR-väliaineessa säilytetyt epiteelisolut alkoivat muodostaa pesäkkeitä 3 päivän kuluttua kylvöstä(Kuva 1 (c)). Näiden pesäkkeiden koot olivat samanlaisia kuin FAD: n medium + 3T3-syöttökerroksessa (Kuva 1(A)) muodostuneet pesäkkeet, mutta nämä pesäkkeet olivat vähemmän tiiviitä kuin FAD + 3T3-syöttökerroksessa. 7 päivän kuluessa epiteelisolut saavuttivat yhtymäkohdan SR-väliaineessa, jolla oli yhtenäinen pieni koko(kuva 1 (d)), mikä havaittiin myös FAD-viljelmässä(Kuva 1 (b)). Tässä tutkimuksessa ihmisen sarveiskalvon epiteelisolut voitiin johtaa ja säilyttää SR-medium + 3T3-syöttökerroksessa kaikille viidelle luovuttajalle. Pitkäjänteistä viljelyä varten ihmisen sarveiskalvon epiteelisolut kasvatettiin sarjamaisesti SR medium + 3T3-syöttökerroksessa yli 10 kohdan ajan (). Jokaisen läpikulun aikana solut trypsinoitiin ja kerättiin, kun solut saavuttivat 80-90%: n yhtymäkohdan; solujen määrä laskettiin populaation kaksinkertaistamiskoetta varten. Tulos osoittaa, että epiteelisolujen tuotto SR-väliaineesta on lähellä FAD-väliaineessa viljeltyjen solujen tuottoa, kuten kuvassa 2(a) esitetään, ja nämä tiedot ovat samanlaisia kuin aiemmat raportit . Yhteenvetona voidaan todeta, että tässä esitetyt tiedot osoittavat, että SR-viljelyaine + C-mitomysiinillä käsitelty 3T3-syöttökerros tukee ihmisen sarveiskalvon epiteelisolujen kloonista kasvua ja proliferaatiota.
(a)
(b)
(c)
(d)
(a)
(b)
(c)
(d)
(a)
(b)
(c)
(d)
(a)
(b)
(c)
(d)
3.2. CFE-määritys
seuraavaksi tutkimme ja vertailimme fad-ja SR-medioissa viljeltyjen sarveiskalvon epiteelisolujen CFE-arvoa. CFE: n analysoimiseksi SR-ja FAD-elatusaineilla viljellyt sarveiskalvon epiteelisolut kerättiin ja kylvettiin siten, että niiden tiheys oli 200 solua 100 mm: n petrimaljaa kohti, joka esikäsiteltiin mitomysiini C: llä käsitellyllä 3T3-syöttökerroksella, ja tämän viljelmän annettiin kasvaa 12 päivän ajan. Sarveiskalvon epiteelisolut alkoivat muodostaa pesäkkeitä 5-7 päivää viljelyn aloittamisen jälkeen. Kuten kuvassa 2 (b) esitetään, 12 päivän viljelyn jälkeen SR-elatusaineessa säilytetyillä sarveiskalvon epiteelisoluilla oli samanlainen CFE-ja pesäke-koko kuin FAD-elatusaineessa säilytetyillä soluilla. SR-ja FAD-elatusaineiden epiteelisolujen CFE-arvo oli ja vastaavasti (kuva 2 (c)). Tilastollinen analyysi osoitti, että pesäkkeiden muodostustehokkuudessa () ja pesäkkeiden keskimääräisessä pinta-alassa () ei ollut merkittäviä eroja SR-ja FAD-väliaineiden välillä (Kuva 2 c). Määritimme siirtokuntatyyppien prosenttiosuuden siirtokuntien pinta-alan perusteella. Tulokset osoittivat, että ABORTOIVIEN pesäkkeiden (pesäkkeiden pinta-ala <1 mm2) osuus SR-alustassa oli sama kuin FAD-välineessä (). Samoin suurten pesäkkeiden (pesäkkeiden pinta-ala >4 mm2) osuus SR-väliaineessa oli lähellä FAD-välinettä () (kuva 2(d)). Nämä tulokset osoittavat, että SR-elatusaineessa viljellyillä sarveiskalvon epiteelisoluilla on yhtä suuri proliferatiivinen potentiaali kuin FAD-elatusaineessa kasvatetuilla soluilla.
3.3. PCR ja reaaliaikainen PCR-analyysi
geenin ekspression tutkimiseksi, PCR ja reaaliaikainen PCR tehtiin sekä FAD-että SR-medioissa viljellyille epiteelisoluille. Sisäisenä kontrollina käytettiin kodinhoitogeeni GAPDH: ta. PCR-tiedot osoittavat, että sekä FAD-välineellä että SR-välineellä viljellyissä soluissa on proliferatiivisen merkkiaineen PCNA: n korkea transkriptio. Molempien väliaineiden soluissa näkyy positiivinen ilmentymä sytokeratiini 3: sta ja sytokeratiini 12: sta, mikä vastaa niiden limbus-alkuperää. Molemmissa viljelmissä havaittiin myös tyvikerroksen epiteelisolumarkkerin, sytokeratiini 15: n positiivinen ilmentymä. ABCG2 – ja ΔNp63α-ilmentymiä havaittiin molemmissa kulttuureissa, joskin ABCG2-ilmentymä väheni hieman primaariviljelyn jälkeen SR-väliaineessa. Connexin 43: n ilmentymisen vähäisyys havaittiin molemmissa viljelmissä ja viittasi epiteelisolujen vähäiseen erilaistumiseen molemmissa väliaineissa. Reaaliaikaisen PCR: n osalta mRNA-tason kvantitatiivinen analyysi osoitti, ettei FAD: ssä kasvatettujen epiteelisolujen ja SR-väliaineessa kasvatettujen P63: n ja ABCG2: n välillä ollut merkittävää ilmentymiseroa () (Kuva 4 a). Lisäksi tehtiin reaaliaikainen analyysi sarveiskalvon epiteelin differentiaatiomarkkerista sytokeratiini 3 ja sytokeratiini 12. Molemmat näistä kahdesta merkkiaineesta olivat hädin tuskin havaittavissa sekä FAD-että SR-soluviljelmissä, ja yllättäen näiden kahden viljelmän välillä ei ole merkittävää eroa () ilmentymistasossa.
3.4. Immunofluoresenssivärjäys
sen varmistamiseksi, että SR-väliaineessa kasvatetut epiteelisolut säilyttivät varren ja erilaistumattoman tilan, tehtiin useita proliferaatio -, erilaistumis-ja putatiivisia epiteelikantasolumarkkereita sisältävä immunofluoresenssivärjäys. Kuten kuvasta 4 ilmenee, SR-väliaineessa useimmilla epiteelisoluilla oli pieni ja yhtenäinen morfologia, ja useimmat solut värjäytyivät voimakkaasti P63: lla, oletetulla epiteelikantasolumarkkerilla. Abcg2-positiivisia värjäytyneitä soluja havaittiin myös hajanaisessa jakautumisessa limbaalisen epiteelisolupesäkkeiden sisällä. SR-väliaineessa säilytetyt solut värjäytyivät heikosti connexin 43: lle ja sytokeratiini 3: lle. Näiden kahden erilaistumisen merkkiaineen Vähäinen ilmentyminen viittaa siihen, että epiteelisolujen erilaistuminen soluviljelmässä on vähäistä. Samanlainen värjäystapa havaittiin myös FAD-välineellä ylläpidetyissä soluissa(Kuva 4 b). Nämä tiedot viittaavat siihen, että ihmisen LIMBAALISISSA epiteelisoluissa, joita viljeltiin SR-väliaineessa, esiintyi hyvin pitkälle oletettuja epiteelikantasolumarkkereita, samalla kun ne ilmentivät vähäistä erilaistumismarkkerien tasoa.
3.5. Western Blot
kvantitatiivisen geeniekspression ja immunofluoresenssivärjäystuloksen kaksinkertaistamiseksi arvioitiin mahdollisten epiteelikantasolujen markkereiden (p63 ja ABCG2) ja proliferaatiomarkkerien (PCNA) ilmentymistä käyttäen western blotia. Käyttämällä monoklonaalista p63-vasta-ainetta (klooni 4A4, Santa Cruz), p63-proteiinia (70 KD, ΔNα isoformi) havaittiin suurella ekspressiotasolla SR-elatusaineessa. Abcg2: n (70 KD) ilmentyminen havaittiin jokaisessa soluviljelmässä SR-väliaineessa. PCNA: ta, proliferaatiomarkkeria, havaittiin myös soluviljelmissä SR-alustalla (kuva 3(c)). Ja P63: n, ABCG2: n ja PCNA: n lauseketasot olivat samanlaiset 10 kohdassa semikvantitatiivisella intensiteettimittauksella (kuva 3(d)) käyttäen gapdh: ta sisäisenä kontrollina.
(a)
(b)
(c)
(d)
(a)
(b)
(c)
(d)
(a)
(b)
(a)
(b)
4. Keskustelu
3T3-syöttökerroksella viljellyt epiteelisolut on onnistuneesti johdettu ja niitä on käytetty erilaisten kliinisten tilanteiden, kuten vaikeiden palovammojen, diabeettisten jalkahaavojen, ihovaurioiden ja suun limakalvovaurioiden hoitoon . Ensimmäisen limbaalisen epiteelikantasolusiirron kuvasi vuonna 1997 Pellegrini et al. . Viime vuosikymmenten aikana on kehitetty useita erilaisia viljelymenetelmiä, kuten limbaalisten epiteelisolujen viljely ihmisen lapsivesikalvolla (HAM) 3T3-syöttökerroksella tai ilman sitä , epiteelisolujen viljely lämpötilaan reagoivilla levyillä ja epiteelisolujen viljely kaupallisella seerumittomalla viljelyaineella. Koska tuore raportti osoittaa, että sarveiskalvon/limbuksen epiteelisolujen siirron kliininen tulos riippuu siitä, säilyvätkö limbaaliset kantasolut soluviljelmässä, huomautettiin, että holokloneja säilyi vain FAD + 3T3-viljelyjärjestelmässä . Koska tässä viljelyprotokollassa käytetään FBS: ää, on kasvava turvallisuusongelma, että FBS on huonosti määritelty eläinperäinen tuote ja sillä on mahdollisuus siirtää eläimistä peräisin olevia tauteja potilaille . Tämän vuoksi on yhä enemmän tarvetta kehittää eläinperäisiä tuotteita sisältämätöntä ja FBS: ää sisältämätöntä viljelyalustaa perinteisen FAD-viljelyalustan tilalle .
tässä tutkimuksessa kehitimme uuden seerumittoman viljelyaineen, jossa KnockOut SR korvasi FBS: n. Tässä uudessa seerumittomassa viljelyalustassa olevien limbaalisten epiteelikantasolujen fenotyyppejä arvioitiin immunosäilyttämällä vasta-aineita ehdotetuille kantasolumarkkereille (p63, ABCG2) ja differentiaalimarkkereille (sytokeratiini 3, connexin 43).
tuman transkriptiotekijää P63 ehdotettiin aiemmin epiteelikantasolujen markkeriksi, ja ΔNα on näissä soluissa vallitseva P63-isoentsyymien isoformi . Tuloksemme ovat yhdenmukaiset näiden aiempien raporttien kanssa; ydinvoima p63 ilmeni voimakkaasti limbaalisoluviljelmässä, mikä osoitettiin immunostisoivilla, reaaliaikaisella PCR: llä ja western blotilla. P63: n esiintyminen limbaalisoluviljelmässä viittaa niiden suureen proliferatiiviseen ja itse uusiutuvaan potentiaaliin. ABCG2: ta, joka kuuluu ATP: tä sitovaan kasettikuljetinproteiiniin (ABC), joka alun perin tunnettiin nimellä rintasyöpäresistentti proteiini 1 (BCRP1), on ehdotettu toiseksi oletetuksi kantasolumarkkeriksi aikuisten kantasoluille, mukaan lukien limbusepiteeli kantasolut . Abcg2: n korkea ilmentyminen SR-väliaineessa osoitettiin immunosäilyttävällä ja reaaliaikaisella PCR: llä.
K3 ja K12 tunnetaan hyvin sarveiskalvon spesifisinä markkereina . Immunostisoivat ja reaaliaikaiset PCR-tuloksemme osoittivat johdonmukaisesti, että solut olivat K3-ja K12-negatiivisia, mikä vahvisti niiden limbus-alkuperän. Connexin 43 kuuluu gap junction-proteiiniperheeseen; se mahdollistaa pienimolekyylisten liuosten suoran diffuusion naapurisolujen välillä. Connexin 43: n on raportoitu ilmentyvän erilaistuneilla epiteelisoluilla , ja näiden solunvälisten viestintämolekyylien puuttuminen voi olla epiteelin kantasolujen ominaisuus.
tuloksissamme suurempi osuus soluista ilmaisi P63: A ja ABCG2: ta, kun taas harvat solut ilmaisevat erilaistumismerkkejä K3/K12 ja CX43. Näin ollen ihmisen limbaaliepiteelikantasolut SR-seerumittomassa elatusaineessa osoittivat samanlaisia fenotyyppejä ja säilyttävät erilaistumattomat olosuhteet verrattuna FBS-elatusaineeseen.
lopuksi, käyttämällä KnockOut SR: ää korvaamaan FBS: n, uusi seerumiton väliaine ylläpitää ihmisen sarveiskalvon epiteelisolujen kasvua ja lisääntymistä ja säilyttää epiteelikantasolut erilaistumattomassa fenotyypissään. Tämä uusi seerumiton viljelymenetelmä on täydentävä ja suhteellisen helppo hallita. Sillä on suuri potentiaali käytettäväksi klinikan limbaaliepiteelisolujen siirrossa ja kudosten uudistamisessa.
kilpailevat intressit
tekijät ilmoittavat, ettei heillä ole kilpailevia intressejä.
kiitokset
tätä työtä on tuettu Jilinin yliopiston ja Kiinan kansallisen Luonnontieteellisen säätiön apurahalla (NSFC 30500548).
