Évaluation du Profil fonctionnel de Lactobacillus fermentum TCUESC01: Une Nouvelle Souche Probiotique Potentielle Isolée lors de la Fermentation du cacao

Résumé

L’utilisation de bactéries probiotiques intestinales est très courante dans l’industrie alimentaire et a fait l’objet de la majorité des recherches dans ce domaine. Pourtant, ces dernières années, la recherche sur les microorganismes extra-intestinaux a considérablement augmenté en raison de leur potentiel bien connu en tant que probiotiques. Ainsi, nous avons étudié une souche de Lactobacillus fermentum (TCUESC01) extraite de la fermentation du cacao. Tout d’abord, nous avons examiné l’impact du pH sur la croissance de cette souche et étudié sa survie dans des conditions similaires à celles du tractus gastro-intestinal humain. L. fermentum TCUESC01 a démontré une résistance aux conditions imitant l’estomac et les intestins humains et a bien grandi entre pH 5 et pH 7. Ensuite, nous avons soumis L. fermentum TCUESC01 au stockage à 4°C dans une solution laitière et avons constaté qu’il a bien survécu pendant 28 jours. Enfin, nous avons mesuré la susceptibilité de cette souche à de nombreux antibiotiques et sa tendance à s’autoagréger. L. fermentum TCUESC01 a montré une autoagrégation significative, ainsi qu’une sensibilité à la majorité des antibiotiques testés. Dans l’ensemble, nos résultats soutiennent l’utilisation potentielle de cette bactérie extra-intestinale comme probiotique alimentaire.

1. Introduction

La recherche de nouveaux probiotiques est motivée par la connaissance que chaque souche de micro-organismes possède des propriétés différentes et pourrait avoir des effets uniques sur la santé humaine. Historiquement, on croyait que les bactéries lactiques des produits probiotiques devaient provenir de l’homme en raison de la spécificité de l’hôte. Cependant, les microorganismes extra-intestinaux isolés d’aliments fermentés contenant du lactose ou de légumes fermentés présentent également des effets probiotiques prometteurs. Des preuves préliminaires de notre laboratoire indiquent que les souches de Lactobacilles dérivées de la fermentation de cacao de haute qualité présentent des propriétés probiotiques: elles réduisent les dommages histologiques, réduisent la concentration systémique de cytokines inflammatoires et augmentent les taux sériques d’IgA dans un modèle expérimental in vivo de colite. Cependant, l’utilisation possible de ces souches dans des produits commerciaux dépend d’une série de tests recommandés par les organisations internationales. Selon l’Organisation des Nations Unies pour l’alimentation et l’agriculture (FAO) et l’Organisation mondiale de la Santé (OMS), les souches probiotiques potentielles devraient être évaluées pour leurs caractéristiques fonctionnelles et technologiques, y compris leur résistance pendant le transit gastro-intestinal et leur stabilité pendant le stockage. Par conséquent, nous avons évalué les propriétés fonctionnelles et la sécurité de la souche Lactobacillus fermentum TCUESC01 qui a été isolée lors de la fermentation de cacao de haute qualité.

2. Matériaux et méthodes

2.1. Microorganismes et conditions de croissance

La souche Lactobacillus fermentum TCUESC01 (numéro d’accession KU244478, GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/KU244478)) a été cultivée dans un bouillon MRS de lactobacilles (1% de peptone, 0,8% d’extrait de viande, 0,4% d’extrait de levure, 2% de glycose, 0,5% d’acétate de sodium, 0,2% d’hydrogénophosphate dipotassique, 0,02% de sulfate de magnésium heptahydraté, 0.sulfate de manganèse tétrahydraté à 005% et sel de triammonium à 0,02% d’acide citrique) (HIMEDIA®, Inde) pendant 18 h à 37 °C et conservé à -80 °C dans une solution laitière à 10% (Molico®, Brésil) contenant 30% de glycérol.

2.2. Des solutions de bouillon MRS de pH 2, pH 3, pH 4, pH 5, pH 6, pH 7, pH 8 et pH 9 ont été préparées par addition de 1 mol·L−1 d’acide chlorhydrique ou de 1 mol·L−1 d’hydroxyde de sodium. Avant l’essai, L. fermentum TCUESC01 a été cultivé pendant 18 h puis dilué dans une solution saline (0.chlorure de sodium à 85%) à une densité optique (DO) de 0,3 mesurée à 600 nm (OD600 = 0,3). Les essais ont été réalisés dans des microplaques à 96 puits (Costar®), dans lesquelles 180 µL de MRS à chaque pH ont été inoculés avec 20 µL de culture active ou de solution saline comme témoin. La microplaque a été incubée à 37°C et la DO à 600 nm a été déterminée toutes les heures pendant 10 h à l’aide d’un spectrophotomètre (Molecular Devices®, lecteur de microplaque accordable Versamax). En parallèle, des échantillons ont été prélevés toutes les heures à partir de chaque pH, plaqués sur gélose MRS et incubés en conditions anaérobies à 37°C pour tester la viabilité cellulaire.

2.3. Tolérance in Vitro aux conditions gastro-intestinales

Les bactéries ont été cultivées à 37 ° C pendant une nuit dans 40 mL de bouillon MRS, lavées dans une solution saline et inoculées dans 20 mL d’une solution laitière à 10%. La fermentation du lait a été autorisée jusqu’à ce qu’un pH de 4,5 soit atteint, point auquel les bactéries ont été comptées (CFU · mL−1) par dilution en série et placage sur gélose MRS. De plus, une dilution en série a été effectuée dans une solution saline (pH 2,5) avec de la pepsine (3 g/L), suivie d’une incubation à 37°C pendant 1,5 h. Les bactéries ont été lavées par deux cycles de centrifugation (5000 ×g/10 min) et remises en suspension dans une solution saline, avant d’être remises en suspension dans 20 mL de bile porcine à 1% à pH 8,0 (Merck®, Allemagne) et incubées à 37°C pendant 45 minutes. Les comptes bactériens (CFU*mL-1) ont été déterminés en plaquant la solution bactérienne dans de la gélose MRS en conditions anaérobies à 37°C pendant 48 h après chaque phase d’incubation.

2.4. Survie pendant l’entreposage au Froid dans du Lait acidifié

La souche TCUESC01 de L. fermentum a été cultivée dans un bouillon MRS puis récoltée par centrifugation (5000 ×g/10 min). Les bactéries ont ensuite été lavées par remise en suspension dans une solution saline et à nouveau granulées par centrifugation. Les cultures ont été inoculées dans une solution stérile de lait non gras à 10% acidifié à pH 4,5 avec de l’acide lactique (Synth®, Brésil). La solution lactique a été réfrigérée à 4°C et les unités formant colonie (CFU*mL-1) ont été comptées par dilution en série et par dépôt sur gélose MRS à 0, 7, 14, 21 et 28 jours. La viabilité de la souche a été déterminée par rapport au point de temps zéro, considéré comme ayant une survie à 100%.

2.5. Analyse de l’autoagrégation

L. fermentum TCUESC01 a été cultivé dans 20 mL de bouillon MRS pendant une nuit à 37 °C. Le culot bactérien a été recueilli et remis en suspension dans une solution saline à une DO de 0,3 à 600 nm (OD600 = 0,3). La capacité d’autoagrégation de L. fermentum TCUESC01 a été testée en incubant la suspension à 37 ° C et la DO a été surveillée toutes les heures pendant 5 h. Le pourcentage d’agrégation () a été calculé comme suit: où est la densité optique initiale au point temporel zéro et est la densité optique au moment de la mesure. Les résultats présentés étaient les moyennes plus / moins les écarts types de trois expériences.

2.6. Test de sensibilité aux antibiotiques

L. fermentum TCUESC01 a été cultivé pendant 18 h dans un bouillon MRS à 37 °C et dilué à 0,5 sur l’échelle de McFarland dans une solution saline. Des disques antibiotiques ont été placés sur des plaques de gélose Mueller-Hinton qui ont ensuite été inoculées avec 100 µL de la suspension de bactéries actives. Les plaques ont ensuite été incubées en conditions anaérobies pendant 24 h à 37°C. Les zones d’inhibition autour des disques ont été mesurées et les bactéries ont été classées comme résistantes (), modérément sensibles (MS) ou sensibles () sur la base des normes décrites dans le tableau 1. Les disques antibiotiques utilisés dans le test de sensibilité étaient l’amoxicilline (AMO, LABORCLIN®, Brésil, 10 µg), la ciprofloxacine (CIP, LABORCLIN, Brésil, 5 µg), l’amikacine (AMI, CECON®, Brésil, 30 µg), l’azithromycine (AZI, CECON, Brésil, 15 µg), l’amoxicilline et l’acide clavulanique (AMC, SENSIFAR®, Brésil, 30 µg), la norfloxacine (NOR, LABORCLIN , Brésil, 10 µg), sulfonamide (SUL, NEWPROV®, Brésil, 300 µg), vancomycine (VAN, SENSIFAR, Brésil, 30 µg), streptomycine (EST, LABORCLIN, Brésil, 10 µg), érythromycine (ERI, CECON, Brésil, 15 µg), tétracycline (TET, SENSIFAR, Brésil, 30 µg), imipénème (IPM, CECON, Brésil, 10 µg), céfalotine (CFL, LABORCLIN, Brésil, 30 µg), gentamicine (GEN, CECON, Brésil, 10 µg), céfotaxime (CTX, SENSIFAR, Brésil, 30 µg), cotrimoxazole (triméthoprime et sulfaméthoxazole) (SUT, SENSIFAR, Brésil, 25 µg), chloramphénicol (CAILLOTS, SENSIFAR, Brésil, 30 µg), clindamycine (CLI, CECON, Brésil, 2 µg), pénicilline G (PEN10, CECON, Brésil, 10 µg) et céfoxitine (CFO, LABORCLIN, Brésil, 30 µg).

2.7. Analyses statistiques

Les calculs de moyennes et d’écarts types, les analyses de variance, les tests de comparaison Multiple de Tukey et toutes les analyses statistiques ont été effectués à l’aide du logiciel GraphPad® Prism 5.0. Tous les graphiques ont également été produits à l’aide du programme GraphPad Prism 5.0.

3. Résultats

3.1. Effet du pH sur la croissance et la viabilité de L. fermentum TCUESC01

L. fermentum TCUESC01 a pu croître dans des milieux à pH 5, pH 6 et pH 7 (Figure 1). Cependant, aucune croissance n’a été observée en dehors de cette plage de pH (figure 1).

(a)

(b)

(c)

(d)

(dans)

(f)

(fr)

(h)

(et)

(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(h)
(i)

Figure 1

Croissance de Lactobacillus fermentum TCUESC01 au cours de la période de 0 à 10 heures de cultures à 37 ° C à différents pH: (a) croissance du MRS sans modification du pH (pH 6,52); (b) croissance du MRS à pH 2; (c) croissance du MRS à pH 3; (d) croissance du MRS à pH 4; (e) croissance du MRS à pH 5; (f) croissance du MRS à pH 6; (g) croissance du SRM à pH 7; (h) croissance du SRM à pH 8; (i) croissance du SRM à pH 9. Chaque point du graphique représente la moyenne et l’écart type de trois expériences.

3.2. Tolérance de L. fermentum TCUESC01 aux conditions gastro-intestinales In Vitro

La tolérance de L. fermentum TCUESC01 au passage gastro-intestinal a été évaluée dans des conditions conçues pour imiter le tractus gastro-intestinal humain (figure 2). Une solution bactérienne a été cultivée à une concentration de 8,7 × 108 UFC · mL-1 dans une solution de lait à 10%. Après avoir soumis les bactéries à une solution contenant de la pepsine à pH 2,5 pendant 1,5 h pour simuler le suc gastrique, nous avons observé une réduction statistiquement significative () de la concentration bactérienne à 1,23 × 108 UFC · mL−1. Après avoir été lavées avec une solution saline, les bactéries ont ensuite été soumises à une solution de bile porcine à 1% à pH 8,0 pendant 45 minutes pour simuler l’environnement intestinal. Suite à ce traitement, nous avons observé une réduction d’environ 1 log du nombre bactérien (3,6 × 107 UFC * mL-1). La réduction du nombre de bactéries pendant l’incubation dans le suc intestinal simulé n’était pas statistiquement insignifiante.

Figure 2

Survie de Lactobacillus fermentum TCUESC01 lors du passage dans le tractus gastro-intestinal simulé. « Lait fermenté » après fermentation du lait; « jus d’estomac simulé » après passage dans une solution saline pH 2,5 + pepsine; « jus intestinal simulé » après passage dans la bile de bœuf 1%. Chaque point du graphique représente le déviant moyen et standard de trois expériences. Réduction statistiquement significative () par rapport au « lait fermenté. »

3.3. Survie de L. fermentum TCUESC01 dans des conditions de stockage commerciales

Pour évaluer leur survie pendant le stockage, les bactéries de L. fermentum ont été réfrigérées à 4 °C pendant 28 jours dans un lait non gras à 10% autrement stérile acidifié à pH 4,5 avec de l’acide lactique (figure 3). La souche bactérienne était initialement à une concentration de 3,6 × 109 UFC · mL-1, mais après 7 jours de stockage, nous avons observé une réduction statistiquement significative d’environ 1 log du nombre de bactéries. Du jour 7 au jour 21, il y a eu une croissance inattendue de 4,3 × 108 UFC · mL−1 à 9,0 × 108 UFC · mL−1. Au jour 28, la concentration bactérienne avait diminué à 2,83 × 108 UFC · mL−1.

Figure 3

Survie de Lactobacillus fermentum TCUESC01 dans le lait fermenté de 0 à 28 jours, à 4°C. Chaque point représente la moyenne et l’écart type de trois expériences. « a » : différence statistiquement significative par rapport au jour zéro (); « b »: différence statistiquement significative par rapport au jour 14; « c »: différence statistiquement significative par rapport au jour 21.

3.4. Autoagrégation de L. fermentum TCUESC01

Les bactéries se sont agrégées de plus en plus jusqu’à la cinquième heure de culture in vitro, à laquelle une agrégation maximale de 70,19 ± 1,78% a été observée (figure 4). Cependant, les augmentations horaires de l’agrégation en pourcentage n’étaient statistiquement significatives que jusqu’à la troisième heure de l’expérience ().

Figure 4

Pourcentage d’autoagrégation de Lactobacillus fermentum TCUESC01 évalué de la 1ère à la 5ème heure de culture en bouillon MRS à 37°C. « a »: différence statistiquement significative par rapport à la 1ère heure d’agrégation; « b »: différence statistiquement significative par rapport à la 2ème heure d’agrégation, . Chaque point représente la moyenne et l’écart type de 3 expériences.

3.5. Sensibilité de L. fermentum TCUESC01 aux antibiotiques

Cette souche de L. fermentum showed susceptibility to the majority of antibiotics tested (Table 2). The few exceptions were the fluoroquinolones norfloxacin and ciprofloxacin, the nucleic acid synthesis inhibitors sulfonamide and cotrimoxazole (sulfamethoxazole and trimethoprim), the cell wall synthesis inhibiting glycopeptide antibiotic vancomycin, and the cell wall synthesis inhibiting β-lactam cefoxitin. L. le fermentum TCUESC01 était sensible à l’amoxicilline, à l’amoxicilline et à l’acide clavulanique, à la pénicilline G, aux β-lactames céfotaxime et céfalotine, aux aminoglycosides amikacine et gentamycine, au lincosamide clindamycine, au carbapénème imipénème, aux macrolides azithromycine et érythromycine, au phénicol chloramphénicol et à la tétracycline. La souche était également modérément sensible à la streptomycine.

4. Discussion

Les lignes directrices établies par la FAO et l’OMS affirment la nécessité d’analyser les propriétés fonctionnelles et la sécurité des bactéries avant de proposer son utilisation dans une matrice alimentaire. Nous avons d’abord évalué la capacité de cette espèce de Lactobacilles à croître et à survivre à des pH différents, et bien qu’elle n’ait connu une croissance que dans la plage de pH 5 à pH 7, elle est restée viable pendant les incubations de 10 h à tous les niveaux de pH évalués, à l’exception du pH 2. Des études ont démontré une grande variabilité du pH gastrique lorsque l’estomac est vide, avec des valeurs moyennes inférieures à pH 4. L’environnement intestinal est plus stable et varie entre pH 6 et pH 8, selon la région intestinale évaluée. Par conséquent, même si cette bactérie lactique n’a pas montré la capacité de se multiplier ou de survivre en dessous de pH 2,5, elle reste viable dans la plage de pH intestinal et peut donc fonctionner dans cet environnement. Conformément à nos données, Lactobacillus plantarum (ST194BZ, ST414BZ et ST664BZ), Lactobacillus rhamnosus (ST461BZ, ST462BZ) et Lactobacillus paracasei (ST242BZ, ST284BZ) isolés d’une boisson fermentée couramment consommée (Boza) de la péninsule balkanique ont montré de bons taux de croissance pendant 10 h d’incubation entre pH 5 et pH 7. L plantarum 423 isolé de la boisson au sorgho, L. plantarum 241 isolé d’iléon de porc, L. curvatus DF38 isolé de salami et Lactococcus lactis ssp. le lactis HV219 isolé à partir de sécrétions vaginales humaines a également montré une croissance entre pH 5 et pH 6,5 dans des expériences similaires. Dans l’ensemble, nos résultats démontrent que L. fermentum TCUESC01 a une résistance à la croissance et au pH similaire à d’autres bactéries probiotiques extra-intestinales potentielles. De plus, la sensibilité de la souche à des niveaux de pH inférieurs à 2,5 peut être surmontée par l’utilisation de méthodes de protection des bactéries, telles que la microencapsulation. Nos résultats confirment l’application potentielle de cette souche en tant qu’additif probiotique dans des aliments aux caractéristiques nettement acides, par exemple les fromages, les jus de fruits et le lait fermenté.

L’environnement gastro-intestinal peut être hostile pour de nombreuses bactéries; une variété de facteurs de stress tels que l’acidité, les enzymes digestives et les sels biliaires peuvent influencer négativement leur survie pendant le transit vers l’intestin. Le lactobacille de cette étude a montré une réduction quantitative discrète mais est resté viable dans des conditions gastriques et intestinales et a résisté à une concentration de bile trois fois supérieure à celle trouvée dans l’intestin humain (0,3%). Similaire à nos données, Kaushik et al. observé que Lactobacillus plantarum Lp9 a diminué d’environ 0,5 log par rapport à sa concentration initiale lorsqu’il était exposé à des conditions imitant l’estomac (pH 2) et 1 log lorsqu’il était exposé à des conditions imitant l’intestin. Dans une autre étude, L. rhamnosus VT1/1 isolé du fromage a montré une réduction d’environ 2 log de concentration dans des conditions de pH bas (pH 3) et une réduction de 1 log de concentration lorsqu’il est incubé à pH 7 en présence de sels biliaires à 2%. Nos résultats suggèrent que L. fermentum pourrait se déplacer dans le système gastro−intestinal et survivre à des concentrations supérieures à 107 UFC · g−1 (ou UFC · mL-1), ce qui, selon des études antérieures, serait suffisant pour interagir et / ou interférer avec l’environnement hôte.

La matrice alimentaire est également un facteur d’influence sur la viabilité des microorganismes pendant leur stockage. En testant la survie à long terme de L. fermentum TCUESC01 dans du lait acidifié, nous avons observé une réduction initiale du nombre de bactéries suivie d’une légère augmentation du jour 7 au jour 21. Cette croissance peut s’expliquer par la poursuite du métabolisme bactérien dans la solution lactique, bien qu’à un taux réduit en raison de la basse température. Donkor et coll. on a également observé une variation quantitative chez les bactéries probiotiques pendant le stockage à 4 °C, en particulier Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus Lb1466 qui a présenté une croissance de 1 log du jour 7 au jour 14 de l’entreposage au froid. Dans une autre étude, L. plantarum stocké dans du lait fermenté a considérablement réduit sa concentration cellulaire de 1 log pendant environ 28 jours de stockage à 4 ° C. Bien que L. fermentum ait présenté une diminution de 1 log par rapport à sa concentration initiale au dernier jour de stockage, sa concentration était supérieure à la moyenne à la date de péremption de la solution lactique. De même, sur la base des recommandations de l’Agence Nationale de Surveillance Sanitaire (ANVISA), L. fermentum TCUESC01 pourrait être introduit dans des matrices alimentaires similaires au lait fermenté et survivre à des concentrations adéquates jusqu’à la date de péremption du produit.

Les microorganismes ayant la capacité de s’autoagréger restent plus longtemps dans les intestins et ont ainsi de meilleures interactions avec les cellules épithéliales et le système immunitaire de l’hôte. La souche L. fermentum TCUESC01 a démontré une capacité élevée d’autoagrégation dans notre essai de 5 h. Ce résultat est supérieur à celui rapporté par Beganović et al. , qui a démontré que L. fermentum A8 avait 60,9 ± 3.91% d’autoagrégation après 5 h d’incubation, ou celle rapportée par Bao et al. , qui a démontré une autoagrégation de moins de 28% pour 10 souches de L. fermentum après une incubation de 20 h. D’après nos résultats, L. fermentum s’agrège bien et, s’il est ingéré, il pourrait probablement persister dans l’environnement intestinal humain pendant de longues périodes.

Enfin, nous avons évalué la sensibilité de TCUESC01 à une variété d’antibiotiques. La connaissance de la sensibilité aux antibiotiques est extrêmement importante lorsque nous considérons trois facteurs importants: la possibilité rare d’infection par les lactobacilles, le risque de transfert horizontal de gènes de résistance aux microbes natifs et l’association entre les bactéries probiotiques et le traitement antibiotique. L. fermentum TCUESC01 présentait une sensibilité à la majorité des antibiotiques, à l’exception des inhibiteurs de la synthèse des acides nucléiques (norfloxacine, ciprofloxacine, sulfonamide et cotrimoxazole) et de deux inhibiteurs de la synthèse de la paroi cellulaire (vancomycine et céfoxine). Ces résultats corroborent les données publiées par Kirtzalidou et al. sur 74 souches de Lactobacillus ssp. isolé des excréments humains, dont 94.5% des souches étaient résistantes à l’amikacine, toutes étaient résistantes à la kanamycine et à la ciprofloxacine, 84,7% des souches étaient résistantes à la vancomycine, 1,6% à la céfalotine et 8,5% à la bacitracine. En général, les lactobacilles présentent une résistance intrinsèque aux quinolones, au triméthoprime, aux sulfamides, à la vancomycine et à la majorité des inhibiteurs de l’acide nucléique, tout en montrant une susceptibilité aux inhibiteurs de la synthèse protéique à l’exception des aminoglycosides. Il convient de noter que la résistance aux antibiotiques observée ici est intrinsèque au genre comme le montrent les études publiées, et le transfert horizontal de gènes est donc rare. En résumé, le profil de résistance de L. fermentum TCUESC01 soutient la possibilité d’utilisation avec des antibiotiques qui agissent en inhibant la synthèse des acides nucléiques.

5. Conclusions

Bien qu’il s’agisse d’une souche extra-intestinale isolée lors de la fermentation du cacao, L. fermentum TCUESC01 présente un fort potentiel en tant que probiotique pour une application dans les produits alimentaires. Il reste viable sur un large spectre de pH et convient donc à l’inclusion dans différents types d’aliments. Lorsqu’il est stocké dans un produit laitier réfrigéré, il maintient sa viabilité au-dessus des niveaux recommandés par les organisations nationales et internationales reconnues jusqu’à la date de péremption du produit. Dans des conditions imitant le transit gastro-intestinal, il survit également en quantités suffisantes pour le maintien du potentiel probiotique. En ce qui concerne ses comportements prédits dans les intestins, L. fermentum TCUESC01 montre une forte tendance à s’autoagréger. Enfin, cette souche présente des profils de sensibilité aux antibiotiques et de résistance qui permettront son utilisation aux côtés de thérapies médicamenteuses. Pris ensemble, ces caractéristiques suggèrent que L. fermentum TCUESC01 a un grand potentiel en tant qu’additif alimentaire probiotique sûr.

Conflits d’intérêts

Les auteurs déclarent n’avoir aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

Cette recherche a été soutenue par une subvention de la Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado da Bahia (FAPESB). Le Conselho de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) et le Coordinação de Aperfeiçoamento de personnels de niveau Supérieur (CAPES) ont fourni des bourses de productivité et d’études supérieures à certains auteurs.