Analyse comparative du Sérum KnockOut™ avec du Sérum Bovin Fœtal pour la culture In Vitro à long terme de Cellules Épithéliales Limbales humaines

Résumé

Les cellules épithéliales limbales peuvent être maintenues sur une couche d’alimentation 3T3 avec un milieu de culture supplémenté en sérum bovin fœtal, et ces cellules ont été utilisées pour traiter avec succès le déficit en cellules souches limbales. Cependant, le sérum fœtal bovin contient des composants inconnus et présente des variations quantitatives et qualitatives de lot à lot. Pour améliorer la condition de culture, le remplacement défini du sérum KnockOut a été étudié pour remplacer le sérum fœtal bovin pour la culture de cellules épithéliales limbales humaines. Les cellules épithéliales limbales primaires humaines ont été cultivées dans du sérum KnockOut et du sérum bovin foetal complétés, respectivement. Le taux de croissance cellulaire, l’expression génique et le maintien des cellules souches épithéliales limbales ont été étudiés et comparés entre ces deux groupes. Des cellules épithéliales limbales primaires humaines ont été isolées et cultivées en série avec succès dans ce nouveau milieu complété par du sérum KnockOut; la prolifération cellulaire et le maintien des cellules souches étaient similaires à ceux des cellules cultivées dans un milieu supplémenté en sérum fœtal bovin. Ces données suggèrent que ce milieu à supplément de sérum KnockOut est un remplacement efficace du milieu à supplément de sérum bovin fœtal traditionnel pour la culture de cellules épithéliales limbales, et ce milieu a un grand potentiel pour le maintien à long terme des cellules épithéliales limbales, la transplantation de cellules souches épithéliales limbales et la régénération tissulaire.

1. Introduction

Les cellules souches épithéliales cornéennes sont situées dans la couche basale du limbe, une structure ondulée et pigmentée appelée palissades de Vogt. Ces cellules souches soutiennent le renouvellement continu de l’épithélium cornéen au cours de la vie et remplacent les cellules épithéliales cornéennes blessées ou perdues. Le déficit en cellules souches limbales (LSCD) et les maladies de la surface oculaire associées peuvent être traités avec succès en utilisant une autogreffe épithéliale limbale en culture. Le succès de ces traitements chirurgicaux dépend de l’expansion efficace des cellules souches épithéliales limbales qui impliquaient la couche d’alimentation 3T3 et le sérum fœtal bovin (FBS) dans la plupart des cas. Le système de culture de la couche d’alimentation 3T3 a été mis en place par Rheinwald et Green et a été utilisé avec succès pour étendre les cellules épithéliales de la peau humaine, du follicule pileux, du limbe, de la conjonctive et du tissu de la muqueuse buccale. Cependant, le FBS n’est pas bien défini et il affiche toujours des variations quantitatives et qualitatives de lot à lot. Le FBS contient également des composants xénogéniques potentiellement nocifs, qui peuvent stimuler des réactions immunologiques et transmettre des maladies animales et des agents pathogènes. Avec toutes ces préoccupations, il est de plus en plus nécessaire de développer un milieu de culture bien défini pour remplacer le milieu traditionnel complété par du FBS.

Il existe actuellement certains milieux alternatifs sans sérum pour la croissance des cellules épithéliales, tels que le Milieu sans Sérum Kératinocytaire défini (KSFM™, Invitrogen, USA), le milieu de croissance des kératinocytes (KGM™, Clontech, USA), Epilife™ (Invitrogen, USA) et le milieu ciblé par cellules progénitrices (PCT) (CellnTEC™, Suisse). Il a été démontré que ces produits favorisent l’expansion des cellules épithéliales cornéennes. Cependant, ils ont toujours besoin de suppléments de produits non définis, tels que l’extrait hypophysaire bovin (BPE) ou l’albumine sérique humaine (HAS). Et la plupart de ces milieux nécessitent une densité d’ensemencement cellulaire élevée, ce qui peut ne pas être pratique pour l’expansion des cellules épithéliales cornéennes humaines. De plus, les cellules souches épithéliales cornéennes, qui sont détectées sous forme d’holoclones dans le système de culture 3T3, n’ont pas pu être maintenues à long terme dans ce milieu de culture sans sérum. À ce jour, il n’existe pas de milieu défini sans sérum qui pourrait soutenir l’expansion des cellules souches épithéliales cornéennes à long terme.

Le remplacement sérique KnockOut (SR) est une formulation définie sans sérum, conçue pour remplacer directement les FBS pour le maintien des cellules souches embryonnaires (CES) et des cellules souches pluripotentes induites (IPSC). Il a été démontré que la SR KnockOut offre des conditions de croissance cohérentes pour les cellules ES et la culture iPSC, et les cellules ES cultivées dans un milieu supplémenté par la SR KnockOut sont nettement moins différenciées que celles cultivées dans un milieu supplémenté par le FBS, et la transmission des lignées germinales n’est pas du tout compromise. Compte tenu des similitudes dans les méthodes de culture des cellules épithéliales et des cellules ES, et à la lumière du fait que le SR KnockOut remplace le FBS dans la culture cellulaire ES, on émet l’hypothèse que le SR KnockOut pourrait être utilisé pour remplacer le FBS dans la culture cellulaire épithéliale limbale.

2. Des matériaux et des réactifs

Des boîtes de culture cellulaire, des flacons, des tubes à centrifuger et des pipettes sérologiques ont été achetés auprès de Becton Dickinson (Franklin Lakes, New Jersey; http://www.bd.com/). Milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM), F-12 de Ham, HEPES, pénicilline et streptomycine, L-glutamine, 0,05% de trypsine-0.La solution EDTA à 02%, le kit Exposant III et le kit RNeasy™ ont été acquis auprès d’Invitrogen-GIBCO BRL (Grand Island, NY; http://www.invitrogen.com/). Le sérum fœtal bovin (FBS) a été acheté chez Hyclone (Logan, UT; http://www.hyclone.com/). Des fibroblastes NIH 3T3 de souris (ATCC CCL 92) ont été obtenus à partir d’une collection de cultures de type Américain (Rockville, MD; http://www.atcc.org/). Le Dispase II venait de Roche. L’anticorps monoclonal (mAb) contre ABCG2 (clone BXP-21) et la connexine 43 provenaient de Millipore; p63 (clone 4A4), K5 et K19 provenaient de Santa Cruz; K3 mAb (clone AE5) provenait d’ICN Pharmaceuticals (Costa Mesa, CA; http://www.mpbio.com/). L’anticorps secondaire conjugué contre la chèvre et la souris Alexa Fluor 568 provenait d’Invitrogen-GIBCO BRL (Grand Island, NY; http://www.invitrogen.com/). Les kits d’AmpÉrase UNG de GeneAmp RNA-PCR et de Taqman Universal PCR Master Mix provenaient d’Applied Biosystems (Foster City, CA; http://www.appliedbiosystems.com/). La mitomycine C, l’insuline bovine, la transferrine humaine, l’hydrocortisone, le facteur de croissance épidermique humain (EGF), la toxine cholérique et d’autres réactifs provenaient de Sigma-Aldrich (St. Louis; http://www.sigmaaldrich.com/).

2.1. Isolement et culture des cellules épithéliales limbales humaines

Les anneaux cornée-limbaux ont été récoltés chez cinq donneurs sains juste après la transplantation cornéenne, un consentement éclairé a été demandé et le protocole de récolte des échantillons a été approuvé par le Conseil d’examen institutionnel (CISR) de l’Université de Jilin. Les anneaux cornée-limbaux frais ont été traités avec 0,25% de Dispase II à 4 ° C pendant une nuit, et la couche épithéliale a été nettoyée du tissu stroma sous-jacent et traitée avec 0,05% de trypsine-0,02% d’EDTA à 37 ° C pendant 15 minutes. L’activité de la trypsine a été neutralisée par 10% de FBS et des cellules épithéliales limbales dissociées ont été collectées et centrifugées à 1500 tr/min pendant 5 minutes. La viabilité des cellules épithéliales a été déterminée par le bleu de trypan à l’exclusion de la coloration et le nombre de cellules a été compté à l’aide d’un hémocytomètre.

Des fibroblastes de souris 3T3 ont été maintenus dans le Milieu Eagle Modifié de Dulbecco (DMEM, glucose élevé) additionné de FBS à 10%, de L-glutamine (2 mM) et de pénicilline-streptomycine (50 UI / mL) et cultivés avec 5% de CO2 et une atmosphère humidifiée. Les cellules 3T3 ont été repiquées tous les 6 jours lorsqu’elles ont atteint une confluence de 80 à 90%. Les cellules 3T3 ont été maintenues en série, et seules les cellules avant le passage 20 ont été utilisées pour la préparation de la couche d’alimentation. Pour préparer la couche nourricière, les cellules 3T3 confluentes ont été traitées avec de la mitomycine C (10 µg/ mL) pendant 2 heures à 37 ° C, lavées avec du PBS deux fois et traitées avec de la trypsine à 0,05% pendant 5 minutes à 37 ° C. Les fibroblastes 3T3 ont ensuite été collectés et plaqués à une densité de 30 000 cellules/ cm2 un jour avant l’ensemencement des cellules épithéliales.

Des cellules épithéliales limbales humaines ont été cultivées sur une couche d’alimentation 3T3 en utilisant soit un milieu FAD, soit un milieu de remplacement sérique (SR). Le milieu FAD est un mélange de DMEM et de milieu F-12 de Ham (1: 1) contenant 10% de sérum fœtal bovin, de la L-glutamine (2 mM) et de la pénicilline-streptomycine (50 UI / mL), du facteur de croissance épidermique (10 ng/mL), de l’insuline (5 µg/mL), de l’adénine (0,18 mM), de l’hydrocortisone (0,4 µg/mL), de la toxine cholérique (0,1 nM) et de la triiodothyronine (2 nM). Le milieu SR est un mélange de DMEM et de milieu F-12 de Ham (1: 1) contenant 10% de remplacement sérique de SR KnockOut, de la L-glutamine (2 mM) et de la pénicilline-streptomycine (50 UI / mL), du facteur de croissance épidermique (10 ng / mL), de l’insuline (5 µg / mL), de l’adénine (0,18 mM), de l’hydrocortisone (0.4 µg / mL), la toxine cholérique (0,1 nM), la triiodothyronine (2 nM), la transferrine (5 µg/mL) et le sélénium (5 ng/mL). Des cellules épithéliales limbales ont été ensemencées sur une couche nourricière de 3T3 à une densité de 6 000 cellules/cm2 et cultivées avec 5% de CO2 et une atmosphère humidifiée. Le milieu FAD a été changé tous les 3 jours tandis que le milieu SR a été changé tous les 2 jours.

2.2. Essai d’efficacité de formation de colonies (EFC)

Pour l’essai d’EFC, 200 cellules épithéliales limbales humaines issues d’une culture FAD ou d’une culture SR ont été plaquées sur une boîte de pétri de 100 mm contenant une couche d’alimentation 3T3 traitée à la mitomycine C et cultivées comme décrit ci-dessus. Après 12 jours de culture, les plats ont été fixés avec du formol à 10% pendant 30 minutes à température ambiante et colorés avec de la rhodamine B à 1% pendant encore 30 minutes. Après lavage à l’eau distillée, les nombres de colonies ont été comptés et analysés. L’efficacité de la formation des colonies a été exprimée par le nombre de colonies formées divisé par 200.

2.3. Essai de doublement de la population cellulaire

Des cellules épithéliales limbales ont été maintenues sur une couche d’alimentation 3T3 traitée à la mitomycine C en utilisant un milieu FAD ou un milieu SR. Les cellules épithéliales ont été trypsinisées lorsqu’elles ont atteint une confluence de 80 à 90% et sont passées à une densité de 6 000 cellules/ cm2. Les cultures ont été maintenues en série pendant 10 passages. À chaque passage, des cellules épithéliales limbales ont été récoltées et le nombre de cellules a été compté. Le nombre de doublements de population (PD) pour chaque passage a été calculé selon la formule suivante: , où représente le nombre total de cellules obtenues à chaque passage et représente le nombre de cellules de placage au début.

2.4. Extraction d’ARN et Réaction quantitative en chaîne par polymérase en Temps Réel

Pour évaluer le niveau d’expression génique des cellules épithéliales limbales, la PCR et la PCR en temps réel ont été effectuées. L’ARN total a été extrait des cellules épithéliales cornéennes à l’aide du kit RNeasy en suivant les instructions du fabricant. L’ARN a été quantifié par son absorption à 260 nm et stocké à -80°C. Pour synthétiser les ADNC, 1 µg d’ARN total a été utilisé avec le kit de transcription inverse Exposant III. La PCR a été réalisée à l’aide du mélange maître PCR Platinum (technologie Life); et la PCR en temps réel a été réalisée à l’aide du mélange maître PCR Vert SYBR (Roche) avec les amorces décrites précédemment. Des réactions de PCR en temps réel ont été effectuées en trois exemplaires avec une étape d’activation initiale à 95 °C pendant 3 minutes, suivie de 45 cycles: 95 °C pendant 30 secondes, 60 °C pendant 30 secondes et 72 °C pendant 40 secondes. L’expression génique relative a été calculée en normalisant la différence entre la valeur seuil du cycle (delta Ct), les valeurs des gènes et la valeur delta Ct de la glycéraldéhydes-3-phosphate déshydrogénase (GAPDH).

2.5. Coloration immunofluorescente

Des cellules épithéliales limbales humaines ont été ensemencées dans des lames de culture avec une couche d’alimentation 3T3 en milieu FAD ou en milieu SR. Trois jours après l’ensemencement, les cultures ont été fixées avec du paraformaldéhyde à 4% ou de l’acétone froide à 4 ° C pendant 10 minutes. Après lavage avec du PBS deux fois, les cellules ont été bloquées avec du sérum de chèvre à 5% dans du PBS pendant 30 minutes. Les anticorps primaires de souris contre p63 (1:200, 4A4, Santa Cruz), ABCG2 (1:30, BXP-21, Millipore), K3 (1:400, Millipore) et connexin 43 (1:1000, Millipore) ont été appliqués et incubés pendant une nuit à 4 ° C. L’anticorps secondaire conjugué Alexa Fluor 568 a été appliqué pendant 1 heure après lavage avec du PBS deux fois. Les noyaux cellulaires ont ensuite été contre-colorés avec du Hoechst 33342 (1 µg/mL dans le PBS) pendant 20 minutes. Après lavage au PBS pendant 3 fois, la culture cellulaire a été montée avec un milieu de montage (Vector Laboratories, Burlingame, CA) et examinée au microscope fluorescent (BX50; Olympus, Tokyo, Japon).

2.6. Analyse par Western Blot

Des cellules épithéliales limbales cultivées ont été lysées avec du tampon RIPA (10 mm de Tris pH 7,5, 150 mm de NaCl, 1% de désoxycholate de sodium, 1% de Triton X-100, 1 mM d’EDTA et cocktail d’inhibiteurs de protéase; Roche Diagnostics) sur glace pendant 30 minutes. La concentration en protéines a été quantifiée à l’aide d’un dosage protéique de l’acide bicinchoninique (ACB) (Pierce, Rockford, IL). Les lysats cellulaires totaux (40 µg) ont été électrophorés dans un gel SDS-PAGE à gradient de 12%, transférés sur une membrane de nitrocellulose (Bio-Rad), bloqués par du lait écrémé à 5% dans une solution saline tamponnée Tris (TBS) pendant 1 heure et sondés avec des anticorps de souris contre l’antigène du noyau cellulaire proliférant (PCNA, Santa Cruz, CA), ABCG2 (BXP-21, Millipore) ou p63 (4A4, Santa Cruz, CA) pendant une nuit à 4 °C. Les membranes ont ensuite été lavés trois fois avec du SCT, incubés avec des IgG anti-souris de chèvre (1:5000, conjugué HRP, Santa Cruz, CA) ou des IgG anti-chèvre de lapin (1 : 5000, HRP-conjugué, Santa Cruz, CA) pendant 1 heure à température ambiante, et développé avec des substrats chimiluminescents améliorés (Pierce Biotechnology, Rockford, IL). Les niveaux d’expression d’ABCG2, de PCNA et de p63 ont été mesurés à l’aide d’une mesure d’intensité semi-quantitative et normalisés au niveau de GAPDH qui a servi de contrôle interne.

2.7. Statistiques

Le résumé des données de CFE et du pli relatif de la PCR en temps réel a été rapporté en moyenne ± SD et comparé à l’aide du test non apparié de Student avec Microsoft Excel (version 2003 / XP). Les résultats des tests ont été présentés sous forme de valeurs à deux queues, considérées comme statistiquement significatives.

3. Résultats

3.1. Le phénotype des Cellules Souches épithéliales cornéennes dans le milieu SR

Un total de 5 tissus de l’anneau cornée-limbal ont été récoltés auprès de donneurs âgés de 32 à 65 ans. Ces tissus ont été conservés et traités dans les 24 heures suivant la récolte. La culture de cellules épithéliales cornéennes primaires humaines a été mise en place avec succès en milieu FAD (Figures 1(a) et 1(b)) et en milieu SR (Figures 1(c) et 1(d)). Les cellules épithéliales cornéennes maintenues dans la couche nourricière SR moyenne + 3T3 présentaient une morphologie de petite taille et un rapport noyaux/cytoplasme élevé, ce qui était typique de la morphologie des cellules épithéliales indifférenciées, et les grandes cellules squameuses plates différenciantes étaient rarement observées (figure 1(c)). Les cellules épithéliales maintenues en milieu SR ont commencé à former des colonies 3 jours après l’ensemencement (Figure 1(c)). Les tailles de ces colonies étaient similaires à celles formées dans la couche d’alimentation FAD + 3T3 (Figure 1(a)), mais ces colonies étaient moins compactées que celles de la couche d’alimentation FAD + 3T3. En l’espace de 7 jours, les cellules épithéliales ont atteint la confluence dans le milieu SR de petite taille uniforme (Figure 1(d)), ce qui a également été observé en culture de DCP (Figure 1(b)). Dans cette étude, des cellules épithéliales cornéennes humaines ont pu être dérivées et maintenues dans la couche d’alimentation du milieu SR + 3T3 pour les cinq donneurs. Pour la culture à long terme, les cellules épithéliales cornéennes humaines ont été subculturées en série dans la couche d’alimentation du milieu SR +3T3 pendant plus de 10 passages (). Au cours de chaque passage, les cellules ont été trypsinisées et collectées lorsque les cellules ont atteint une confluence de 80 à 90%; le nombre de cellules a été calculé pour le dosage du doublement de la population. Le résultat montre que le rendement des cellules épithéliales du milieu SR est proche de celui des cellules cultivées en milieu FAD, comme le montre la figure 2(a), et ces données sont similaires aux rapports précédents. En résumé, les données présentées ici montrent que le milieu de culture SR + la couche d’alimentation 3T3 traitée à la mitomycine C soutient la croissance et la prolifération clonales des cellules épithéliales cornéennes humaines.

(a)

(d)

(c)

(d)

(a)
(b)
(c)
(d)

Figure 1

La culture de cellules épithéliales limbales humaines en milieu SR. (a) Les cellules épithéliales cornéennes humaines ont formé des colonies étroitement compactées en milieu FAD après l’ensemencement des cellules pendant 3 jours. (b) Après 7 jours, les cellules épithéliales ont atteint la confluence dans un milieu FAD de petite taille uniforme. (c) Les cellules épithéliales cornéennes humaines ont formé des colonies dans le milieu SR, qui étaient similaires à celles formées dans le milieu FAD, mais ces colonies étaient moins compactées que celles dans le milieu FAD. (d) Après 7 jours, les cellules épithéliales ont atteint la confluence dans le milieu SR avec une taille uniforme et de petite taille similaire à celles de la culture FAD Grossissement d’origine: (a) ×10; (b) ×10 (barres d’échelle: 100 µm).

(a)

(d)

(c)

(d)

(a)
(b)
(c)
(d)

Figure 2

Comparaison du doublement de la population cellulaire (PD) et de l’efficacité de formation de colonies (CFE) de cellules épithéliales limbales humaines cultivées dans des milieux SR et FAD. (a) Les cellules épithéliales limbales humaines ont été sous-cultivées en série dans le milieu SR et le milieu FAD pendant 10 passages (); le nombre de doublements de population cellulaire (PD) et la PD accumulée ont été calculés et tracés. PD a été calculé selon la formule suivante : , où représente le nombre total de cellules obtenues à chaque passage et représente le nombre de cellules de placage au début de chaque passage. (b) Pour analyser l’EFC, des cellules épithéliales limbales ont été ensemencées à une densité de 200 cellules par boîte de pétri de 100 mm dans des milieux SR et FAD et laissées à pousser pendant 12 jours. (c) Les valeurs de CFE pour les cellules épithéliales dans les milieux SR et FAD étaient respectivement de et. Aucune différence d’ECF n’a été trouvée entre le groupe SR moyen et le groupe FAD moyen (,). d) Le pourcentage de la zone colonisée dans la DCP était proche de celui du milieu SR. Les cellules épithéliales limbales maintenues en milieu SR présentaient une taille d’ECF et de colonie similaire à celle des cellules maintenues en milieu FAD.

3.2. Essai CFE

Ensuite, nous avons examiné et comparé le CFE de cellules épithéliales cornéennes cultivées dans des milieux FAD et SR. Pour analyser l’EFC, des cellules épithéliales cornéennes cultivées dans des milieux SR et FAD ont été récoltées et ensemencées à une densité de 200 cellules par boîte de pétri de 100 mm, qui ont été pré-ensemencées avec une couche d’alimentation 3T3 traitée à la mitomycine C, et cette culture a été autorisée à croître pendant 12 jours. Les cellules épithéliales cornéennes ont commencé à former des colonies 5 à 7 jours après le début de la culture. Comme le montre la figure 2(b), après une culture de 12 jours, les cellules épithéliales cornéennes maintenues en milieu SR présentaient une taille d’ECF et de colonie similaire à celle des cellules maintenues en milieu FAD. La valeur de l’EFC pour les cellules épithéliales dans les milieux SR et FAD était respectivement de et (Figure 2(c)). L’analyse statistique a démontré qu’il n’y avait pas de différences significatives dans l’efficacité de formation des colonies () et la superficie moyenne des colonies () entre les milieux SR et FAD (Figure 2(c)). Nous avons quantifié le pourcentage des types de colonies en fonction de la superficie des colonies. Les résultats ont montré que le pourcentage de colonies abortives (zone de colonie < 1 mm2) formées dans le milieu SR était similaire à celui du milieu FAD (). De même, le pourcentage de grandes colonies (superficie de colonies > 4 mm2) formées dans le milieu SR était proche de celui du milieu FAD () (Figure 2(d)). Ces résultats indiquent que les cellules épithéliales cornéennes cultivées en milieu SR possèdent un degré de potentiel prolifératif similaire à celui des cellules cultivées en milieu FAD.

3.3. PCR et Analyse PCR en Temps Réel

Pour étudier l’expression du gène, la PCR et la PCR en temps réel ont été réalisées sur des cellules épithéliales cultivées dans des milieux FAD et SR. Le gène de l’entretien ménager GAPDH a été utilisé comme contrôle interne. Les données de PCR montrent que les cellules cultivées dans le milieu FAD et le milieu SR montrent une expression de transcription de haut niveau du marqueur prolifératif PCNA. Les cellules des deux milieux montrent une expression positive de la cytokératine 3 et de la cytokératine 12, ce qui est cohérent avec leur origine limbale. L’expression positive du marqueur des cellules épithéliales de la couche basale, la cytokératine 15, a également été observée dans les deux cultures. L’expression d’ABCG2 et de ΔNp63α a été détectée dans les deux cultures, bien que l’expression d’ABCG2 ait légèrement diminué après la culture primaire en milieu SR. Le faible niveau d’expression de la connexine 43 a été observé dans les deux cultures et impliquait un faible niveau de différenciation des cellules épithéliales dans les deux milieux. Pour la PCR en temps réel, l’analyse quantitative du taux d’ARNm a montré qu’il n’y avait pas de différence significative d’expression () de p63 et d’ABCG2 entre les cellules épithéliales cultivées dans des milieux FAD et SR (Figure 4(a)). Une analyse en temps réel des marqueurs de différenciation épithéliale cornéenne cytokératine 3 et cytokératine 12 a également été réalisée. Ces deux marqueurs étaient à peine détectables dans les cultures cellulaires FAD et SR, et, étonnamment, il n’y a pas de différence significative () de niveau d’expression entre ces deux cultures.

3.4. Coloration immunofluorescente

Pour confirmer que les cellules épithéliales cultivées en milieu SR maintenaient la tige et l’état indifférencié, une coloration immunofluorescente de plusieurs marqueurs de prolifération, de différenciation et de cellules souches épithéliales putatives a été réalisée. Comme le montre la figure 4, dans le milieu SR, la plupart des cellules épithéliales présentaient une morphologie petite et uniforme, et la plupart des cellules étaient fortement colorées avec du p63, le marqueur présumé des cellules souches épithéliales. Des cellules colorées positives d’ABCG2 ont également été observées dans une distribution inégale au sein des colonies de cellules épithéliales limbales. Les cellules maintenues en milieu SR sont faiblement colorées pour la connexine 43 et la cytokératine 3. La faible expression de ces deux marqueurs de différenciation suggère un faible niveau de différenciation des cellules épithéliales dans la culture cellulaire. Le style de coloration similaire a également été observé dans des cellules maintenues avec un milieu FAD (Figure 4(b)). Ces données impliquent que les cellules épithéliales limbales humaines cultivées en milieu SR ont maintenu une expression élevée de marqueurs de cellules souches épithéliales putatives, tout en exprimant un faible niveau de marqueurs de différenciation.

3.5. Western Blot

Pour confirmer deux fois l’expression quantitative des gènes et les résultats de coloration immunofluorescente, l’expression des marqueurs potentiels des cellules souches épithéliales (p63 et ABCG2) et du marqueur de prolifération (PCNA) a été évaluée à l’aide de western blot. En utilisant l’anticorps monoclonal p63 (clone 4A4, Santa Cruz), la protéine p63 (70 KD, isoforme ΔNα) a été détectée à haut niveau d’expression dans le milieu SR. L’expression d’ABCG2 (70 KD) a été détectée dans chaque passage de cellules cultivées en milieu SR. Le PCNA, marqueur de prolifération, a également été détecté dans des cellules cultivées en milieu SR (Figure 3(c)). Et les niveaux d’expression de p63, ABCG2 et PCNA étaient similaires dans 10 passages avec mesure d’intensité semi-quantitative (Figure 3 (d)) en utilisant GAPDH comme contrôle interne.

(a)

(d)

(c)

(d)

(a)
(b)
(c)
(d)

Figure 3

Expression génique et expression protéique dans les cellules épithéliales limbales humaines. (a) Analyse de l’expression génique des cellules épithéliales limbales humaines. Les données de PCR montrent que les cellules cultivées en milieu FAD et en milieu SR présentent une expression de haut niveau du transcription de la prolifération PCNA en P1, P4, P7 et P10. Les cellules des deux milieux montrent une expression positive de la cytokératine 3 et de la cytokératine 12, ce qui implique leur origine limbale. L’expression positive du marqueur des cellules épithéliales de la couche basale, la cytokératine 15, a également été observée dans les deux cultures. L’expression d’ABCG2 et de ΔNp63α a été détectée dans les deux cultures; leur expression a été légèrement diminuée après le passage 7 (P7) dans les deux milieux de culture. Le faible niveau d’expression de la connexine 43 (Cx43) a été observé dans les deux cultures et impliquait un faible niveau de différenciation des cellules épithéliales dans les deux milieux. b) Analyse quantitative par PCR en temps réel de cellules épithéliales limbales humaines cultivées dans des milieux SR et FAD. La PCR en temps réel a été réalisée sur des cellules épithéliales cultivées à la fois en milieu FAD et en milieu SR. Le gène de l’entretien ménager GAPDH a été utilisé comme contrôle interne. L’analyse des marqueurs de cellules souches épithéliales limbales p63 et de l’ARNm ABCG2 a révélé qu’il n’y avait pas de différence significative (,) dans l’expression entre les cellules épithéliales cultivées dans les milieux FAD et SR. Une analyse en temps réel du marqueur de différenciation épithéliale cornéenne cytokératine 3 et connexine 43 a été réalisée. Tous ces marqueurs étaient à peine détectables dans les cultures cellulaires FAD et SR, et, étonnamment, il n’y a pas de différence significative (,) de niveau d’expression entre ces deux cultures. Toutes les expériences de PCR en temps réel ont été réalisées en trois exemplaires. (c) Test Western blot de cellules épithéliales limbales humaines cultivées dans des milieux FAD et SR. L’expression du marqueur de prolifération (PCNA) et des marqueurs potentiels de cellules souches épithéliales (p63 et ABCG2) a été évaluée à l’aide de western blot. En utilisant le clone d’anticorps monoclonal 4A4, la protéine p63 (70 KD) a été détectée à haut niveau d’expression dans le milieu SR. L’expression d’ABCG2 a été détectée dans chaque passage de cellules cultivées en milieu SR. Le PCNA, l’antigène du noyau cellulaire, un marqueur de prolifération cellulaire, a également été détecté dans des cellules épithéliales cultivées en milieu SR. (d) L’expression d’ABCG2, de p63 et de PCNA a été quantifiée et tracée à l’aide d’une mesure d’intensité semi-quantitative. La densité de blot d’ABCG2, de p63 et de PCNA a été mesurée et normalisée au niveau de GAPDH.

(a)

(d)

(a)
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Figure 4

Expression of epithelial stem cell makers and differentiation markers in human limbal epithelial cells. Les cellules épithéliales limbales humaines ont été fortement colorées avec ABCG2 et p63 (vert) dans les milieux SR et FAD. Les cellules maintenues dans des milieux SR et FAD ont montré une faible coloration de la connexine 43 (Cx43) et de la cytokératine 3 (K3). a) Milieu SR et b) milieu FAD. Grossissement d’origine: (a) ×10; (b) ×10 (barres d’échelle: 100 µm). Les études ont été réalisées en trois exemplaires et des chiffres représentatifs sont présentés ici.

4. Discussion

Des cellules épithéliales cultivées sur une couche d’alimentation 3T3 ont été dérivées et utilisées avec succès pour le traitement de diverses situations cliniques, telles que des brûlures graves, des ulcères du pied diabétique, des défauts cutanés et des défauts de la muqueuse buccale. La première transplantation de cellules souches épithéliales limbales a été décrite en 1997 par Pellegrini et al. . Au cours des dernières décennies, plusieurs méthodes de culture différentes ont été développées, notamment la culture de cellules épithéliales limbales sur membrane amniotique humaine (HAM) avec ou sans couche d’alimentation 3T3, la culture de cellules épithéliales sur des plaques sensibles à la température et la culture de cellules épithéliales avec un milieu de culture commercial sans sérum. Comme un rapport récent indique que le résultat clinique de la transplantation de cellules épithéliales de la cornée / du limbe dépend de la préservation ou non des cellules souches limbales dans la culture cellulaire, il a été souligné que les holoclones n’étaient conservés que dans le système de culture FAD + 3T3. Étant donné que ce protocole de culture implique l’utilisation de FBS, il existe des préoccupations croissantes en matière de sécurité selon lesquelles le FBS est un produit animal mal défini et a un potentiel de transmission de maladies d’origine animale aux patients. Par conséquent, il est de plus en plus nécessaire de développer un milieu de culture sans produits animaux et sans FBS pour remplacer le milieu de DCP traditionnel.

Dans cette étude, nous avons développé un nouveau milieu de culture sans sérum, dans lequel KnockOut SR a remplacé le FBS. Les phénotypes de cellules souches épithéliales limbales dans ce nouveau milieu de culture sans sérum ont été évalués par immunocoloration avec des anticorps pour les marqueurs de cellules souches proposés (p63, ABCG2) et les marqueurs de différenciation (cytokératine 3, connexine 43).

Le facteur de transcription nucléaire p63 a été précédemment proposé comme marqueur des cellules souches épithéliales, et ΔNα est l’isoforme prédominante des isoformes p63 dans ces cellules. Nos résultats sont cohérents avec ces rapports précédents; la p63 nucléaire a été fortement exprimée dans la culture de cellules limbales, ce qui a été démontré par immunocoloration, PCR en temps réel et western blot. La présence de p63 dans la culture de cellules limbales indique leur potentiel de prolifération et d’auto-renouvellement élevé. ABCG2, un membre des transporteurs de la cassette de liaison à l’ATP (ABC), connu à l’origine sous le nom de protéine résistante au cancer du sein 1 (BCRP1), a été proposé comme un autre marqueur de cellules souches putatif pour les cellules souches adultes, y compris les cellules souches épithéliales du limbe. L’expression élevée d’ABCG2 dans le milieu SR a été mise en évidence par immunocoloration et PCR en temps réel.

K3 et K12 sont bien connus comme marqueurs spécifiques de la cornée. De manière constante, nos résultats d’immunocoloration et de PCR en temps réel ont montré que les cellules étaient K3 et K12 négatives, confirmant leur origine limbale. La connexine 43 est un membre de la famille des protéines de jonction gap; elle permet la diffusion directe de solutés de faible poids moléculaire entre les cellules voisines. Il a été rapporté que la connexine 43 était exprimée par des cellules épithéliales différenciées, et l’absence de ces molécules de communication intercellulaire pourrait être une caractéristique des cellules souches épithéliales.

Dans nos résultats, un pourcentage plus élevé de cellules ont exprimé p63 et ABCG2, tandis que peu de cellules expriment des marqueurs de différenciation K3 / K12 et CX43. Ainsi, les cellules souches épithéliales limbales humaines dans un milieu sans sérum SR présentaient des phénotypes similaires et maintenaient des conditions indifférenciées, par rapport au milieu FBS.

En conclusion, en utilisant le SR KnockOut remplaçant le FBS, notre nouveau milieu sans sérum maintient la croissance et la prolifération des cellules épithéliales cornéennes humaines et retient les cellules souches épithéliales dans leur phénotype indifférencié. Cette nouvelle méthode de culture sans sérum est définie par un supplément et relativement facile à contrôler. Il a un grand potentiel pour être utilisé dans la transplantation de cellules épithéliales limbales en clinique et la régénération tissulaire.

Intérêts concurrents

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts concurrents.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par une subvention de l’Université de Jilin et de la Fondation Nationale des Sciences naturelles de Chine (NSFC 30500548).