Base structurelle pour la reconnaissance de la chaîne Ub liée à K48 par le récepteur protéasomal Rpn13

La chaîne Ub liée à K48 fluctue dynamiquement entre plusieurs conformations

Nous avons utilisé smFRET pour évaluer la disposition spatiale des deux sous-unités Ub dans le K48 sans ligand – Dioub. Nous avons introduit des fluorophores, Alexa Fluor 488 et Cy5, à l’extrémité N de l’Ub distale et à l’extrémité C de l’Ub proximale (Fig. supplémentaire. S1a). En utilisant l’algorithme de maximisation des espérances32, le profil smFRET de K48-diUb peut être décrit au mieux comme trois espèces de FRETTES qui se chevauchent (Fig. supplémentaire. S2). Les espèces à fret élevé, moyen et faible sont centrées à des efficacités de FRET de 0,74, 0,57 et 0,23, avec des populations respectives de ~ 48, ~ 39 et ~ 13% (Fig. 1 bis). Les distances de FRET entre le centre des fluorophores sont calculées respectivement à ~43, ~50, ~64 Å. Ainsi, les espèces à fret élevé, moyen et faible peuvent être affectées à des états compacts, semi-ouverts et ouverts préexistants pour K48-diUb.

a Avec des fluorophores conjugués au site 76 C de l’Ub proximale et 0 C de l’Ub distale (cf. Fig. supplémentaire. S1a), le profil smFRET peut être adapté à trois espèces de FRETTES qui se chevauchent. Sauf indication contraire, cette paire de sites de conjugaison est utilisée pour toutes les études smFRET de K48-diUb. L’espèce à frette élevée (colorée en rouge) correspond à un état compact préexistant. b-d L’état compact peut être enrichi sélectivement par Rpn13 pleine longueur, et l’augmentation de la population peut être adaptée à une isotherme de liaison. par exemple, l’état compact peut être enrichi sélectivement par Rpn13NTD, et l’augmentation de la population peut être adaptée pour être une isotherme de liaison. h Avec les fluorophores conjugués aux sites N25C/N25C, Rpn13NTD peut enrichir sélectivement l’état compact préexistant du diUb distal du tétraUb K48 (cf. Fig. supplémentaire. S5), offrant une affinité de liaison. Les populations de l’espèce de smFRET sont moyennées sur trois mesures indépendantes, les erreurs indiquant 1 SD; les valeurs de KD sont déclarées comme des erreurs de meilleur ajustement ± ajustement

La fluctuation conformationnelle de K48-diUb a déjà été étudiée à l’aide de smFRET26. Dans cette étude, les auteurs ont résolu deux espèces de smFRET pour le K48-diUb, à savoir des espèces à fret élevé et à fret faible avec des efficacités de fret central à 0,69 et 0,41, respectivement, en plus d’une espèce sans FRET. Les auteurs ont montré que le titrage d’une OTUB1 inactivée (OTUB1i), une deubiquitinase spécifique de l’isopeptide K48 linkage33, enrichit principalement les espèces à faible FRET. Leur observation a conduit à la proposition que le K48-diUb puisse être spécifiquement reconnu par OTUB1 grâce à un mécanisme de sélection conformationnelle. Ici, nous avons répété le titrage smFRET, et constaté qu’OTUB1i enrichit les espèces à fret moyen (Fig. S3a-c). De plus, l’augmentation de la population de l’espèce à fret moyen lors du titrage d’OTUB1i peut être ajustée à une isotherme de liaison avec une valeur de KD de 7,7 ± 0.1 µM (Fig. S3d), qui est proche de la valeur KD précédemment signalée26. Ainsi, les espèces à fret moyen dans la présente étude devraient correspondre aux espèces à faible FRET dans l’étude précédente, et l’écart peut provenir de différentes efficacités de comptage de photons et de routines d’ajustement des traces temporelles smFRET.

Pour confirmer que le K48-diUb fluctue entre trois états conformationnels préexistants, nous avons introduit des fluorophores à des paires supplémentaires de sites de conjugaison des fluorophores (Fig. supplémentaire. S1b-d). Pour les sites alternatifs, bien que les efficacités centrales des espèces de FRETTES diffèrent, les profils smFRET peuvent encore être décrits comme trois espèces de FRETTES chevauchantes avec des populations similaires (Fig. supplémentaire. S4). Par exemple, pour les sites de conjugaison 25 C/25 C, les espèces à fret élevé, moyen et faible sont centrées à des efficacités de FRET de 0,68, 0,54 et 0,21, avec des populations respectives de ~48%, ~43% et ~ 9% (Figure supplémentaire. S4d). Ainsi, la conjugaison des fluorophores est peu susceptible de perturber la structure protéique, et les mesures de smFRET ont révélé la dynamique conformationnelle inhérente de K48-diUb quel que soit le site de conjugaison, c’est-à-dire que le K48-diUb alterne entre trois états distincts en l’absence d’une protéine partenaire.

Pour évaluer plus en détail si les sous-unités Ub dans une chaîne Ub liée à K48 plus longue fluctue également entre plusieurs états conformationnels, nous avons analysé le profil smFRET de la tétra-ubiquitine liée à K48 (tétraUb K48). Nous avons conjugué les fluorophores à deux sites N25C dans le diUb distal (avec le diUb proximal respecté) du tétraUb K48. Le profil smFRET peut également être adapté en trois espèces de FRETTES superposées (Fig. S5a). Bien que les populations relatives des trois espèces soient différentes de celles d’un diUb K48 isolé avec des fluorophores conjugués aux mêmes sites (Fig. S4d), les rendements des FRETTES centrales des espèces de FRETTES sont presque identiques. Ainsi, les états conformationnels de l’unité diUb sont probablement préservés dans une chaîne Ub liée à K48 plus longue, tandis que la différence dans les populations relatives peut être le résultat de l’effet modulateur du diUb proximal.

L’espèce à fret élevé est enrichie sélectivement par Rpn13

Pour évaluer la relation entre la dynamique conformationnelle de la chaîne Ub liée à K48 et la reconnaissance de Rpn13, nous avons titré 150 PM K48-diUb marqué au fluorophore avec la protéine Rpn13 humaine pleine longueur. Il est intéressant de noter que lors de l’ajout de Rpn13 à 100 nM, l’espèce préexistante à frettes élevées de K48-diUb est enrichie de ~48% à ~ 57% (Fig. 1a, b), tandis que la population d’espèces à fret moyen et faible diminue. La population d’espèces à frettes élevées continue d’augmenter avec l’ajout de Rpn13 (Fig. 1c), et l’isotherme de liaison peut être ajusté à une valeur KD de 119 ± 24 nM (Fig. 1d).

Il a été précédemment démontré que Rpn13NTD est principalement responsable du couplage Ub6,7. Ainsi, nous avons effectué un titrage smFRET pour le K48-diUb marqué au fluorophore 150 pM en utilisant uniquement du Rpn13NTD comprenant uniquement les 150 premiers résidus. Rpn13NTD enrichit également sélectivement les espèces à frettes élevées de K48-diUb (Fig. 1e, f). L’augmentation de la population des espèces à frettes élevées peut être ajustée pour obtenir une valeur KD de 33,1 ± 6,9 nM (Fig. 1g), ce qui représente une augmentation d’environ 4 fois l’affinité par rapport à la Rpn13 pleine longueur. Si les fluorophores sont fixés à des sites de conjugaison alternatifs (Fig. S1b et S4b), le titrage de Rpn13NTD entraîne également l’enrichissement d’espèces de FRETTES équivalentes suivant une tendance similaire, donnant une valeur de KD presque identique (Fig. supplémentaire. S6). Ainsi, l’apparition de résidus supplémentaires peut avoir un faible effet inhibiteur sur l’interaction entre Rpn13NTD et K48-diUb.

De plus, nous avons effectué un titrage smFRET pour 150 PM K48-tétraUb avec des fluorophores conjugués au niveau du diUb distal (Fig. supplémentaire. S5a). Le titrage de Rpn13NTD enrichit sélectivement les espèces préexistantes à frettes élevées du diUb distal marqué au fluorophore (Fig. supplémentaire. S5b-d), et l’isotherme de liaison peut être ajusté à une valeur KD de 214 ± 70 nM (Fig. 1h). La réduction de 7 fois de l’affinité de liaison par rapport à l’interaction Rpn13NTD: K48-diUb peut être attribuée à l’auto-association entre diUb distal et DIUB proximal34, rendant la surface de liaison moins disponible pour la liaison Rpn13. Fait important, pour tous les titrages smFRET de K48-diUb ou de K48-tétraUb, l’efficacité centrale des espèces à frettes élevées change peu en l’absence ou en présence de Rpn13 ou de Rpn13NTD. Cela signifie que Rpn13 se lie à une conformation préexistante de K48-diUb par un mécanisme de sélection conformationnelle, que K48-diUb soit seul ou fasse partie d’une chaîne Ub plus longue. Cela signifie également que l’espèce à fret élevé, c’est-à-dire l’état compact préexistant du K48-diUb, n’est pas complètement fermée et est prête à interagir avec d’autres protéines. Fait important, l’enrichissement sélectif des espèces à fret élevé indique également que Rpn13 devrait interagir avec les deux sous-unités Ub en même temps.

Le Rpn13 se lie préférentiellement au diUb lié à K48

Pour évaluer la spécificité de liaison au Rpn13 pour la liaison au K48, nous avons évalué les affinités de liaison entre le Rpn13 et d’autres types de protéines Ub. Avec le titrage de 200 nM Rpn13NTD dans 150 Pm K48-diUb marqué au fluorophore, la population des espèces à fret élevé augmente de 15%, passant de ~ 48% à ~ 63% (Fig. 1f). A cette concentration, la liaison K48-diUb n’est pas encore saturée en Rpn13NTD (Fig. 1g) et, par conséquent, la population de l’espèce à frettes élevées est sensible à un faible changement de la concentration de Rpn13NTD disponible. Le K48-diUb non marqué peut rivaliser pour la liaison au Rpn13NTD avec le K48-diUb marqué au fluorophore. Avec l’ajout de 150 PM de K48-diUb non marqué, la population des espèces à fret élevé diminue de 7,5%, ce qui correspond à une inhibition de 50% du K48-diUb marqué par un fluorophore lié au Rpn13NTD (Fig. 2 bis). Avec l’ajout de 300 PM K48-diUb non étiquetés, la population d’espèces à frettes élevées diminue de 11%, ce qui représente un total d’inhibition de 73% (Fig. 2b). En tant que tel, le K48-diUb marqué au fluorophore et non marqué est en compétition pour la même interface de liaison sur Rpn13 avec une affinité de liaison similaire. Cela signifie également que la conjugaison des fluorophores en K48-diUb perturbe peu l’interaction entre Rpn13NTD et K48-diUb.

l’addition a, b de 200 nM Rpn13NTD enrichit d’abord les espèces à fret élevé de K48-diUb marqué au fluorophore (cf. Figure 1f), et l’ajout supplémentaire de 150 pM et 300 pM K48-diUb non étiquetés diminuent la population des espèces à frettes élevées. l’ajout de monomère Ub non marqué de 150 pM et de 300 pM a un effet négligeable sur la population des espèces à frettes élevées. e, f L’ajout de 150 pM K48-diUb et de 150 pM M1-diUb provoque une très faible diminution de la population de l’espèce à frettes élevées

De plus, au mélange de 200 nM Rpn13NTD et de 150 pM K48-diUb marqué par un fluorophore, nous avons ajouté un monomère Ub non marqué, la diubiquitine liée à la K63 ou la diubiquitine liée à la M1, pour évaluer si d’autres types d’Ub peuvent déplacer la K48-diUb. La population des espèces à frettes élevées change peu avec l’ajout de monomère Ub de 150 pM ou 300 pM (Fig. 2c, d). Avec l’ajout de 150 pM K63-diUb et 150 pM M1-diUb, la population des espèces à fret élevé est également inchangée dans la plage d’erreur (Fig. 2e, f). D’autre part, le titrage direct de 1 µM Rpn13NTD en K63-diUb et M1-diUb conjugués aux fluorophores ne modifie guère leurs profils smFRET préexistants (Fig. supplémentaire. S7). Ensemble, Rpn13NTD interagit sélectivement avec K48-diUb.

Structure de la solution de Rpn13NTD:Le complexe K48-diUb

Bien que nous ayons maintenant montré que Rpn13NTD interagit sélectivement avec le K48-diUb, seule la structure complexe entre Rpn13NTD et le monomère Ub a été déterminée6,8. Pour comprendre comment les deux sous-unités de K48-diUb peuvent interagir simultanément avec Rpn13NTD, nous avons entrepris de déterminer la structure en solution du complexe Rpn13NTD: K48-diUb en utilisant la résonance magnétique nucléaire (RMN). Lors de la formation du complexe protéique, les résidus interfaciaux subiraient un environnement local différent et afficheraient donc des signaux RMN. Nous avons constaté que le titrage du K48-diUb non marqué en Rpn13 marqué au 15N provoque de grandes perturbations du déplacement chimique (CSP), qui impliquent principalement les résidus 73-83 et 93-106 (Fig. 3 bis). Ces résidus forment une surface contiguë sur Rpn13, couvrant une surface plus grande que prévu de la structure complexe précédemment déterminée entre Rpn13NTD et le monomère Ub6,7. D’autre part, en titrant Rpn13NTD non marqué en K48-dUb, avec Ub 15N marqué proximal ou distal et l’autre sous-unité non marquée, les CSP sont principalement observés pour les résidus dans la région de la feuille β des deux sous-unités Ub. Une partie des résidus interfaciaux a également disparu lors de la formation du complexe (Fig. 3b, c).

a-c CSP a obtenu une moyenne sur les dimensions 1H et 15N des protons amides du squelette lors de la formation du complexe avec des protéines marquées par isotope et non marquées de 0,2 mM. Encarts: la sous-unité marquée 15N est illustrée avec une représentation de surface, et les résidus de couleur rouge ont des CSP au-dessus de la ligne pointillée. d, e Avec une sonde paramagnétique conjuguée au site E24C de l’Ub distal, les rapports d’intensité entre les spectres paramagnétique et diamagnétique et les valeurs PRÉ Γ2 ont été évalués pour les protons amides du squelette de Rpn13NTD marqué au 15N. Les boîtes grises indiquaient des résidus avec de très grandes PREs intermoléculaires. f Avec la sonde paramagnétique conjuguée au site N25C de l’Ub proximale, des valeurs de Γ2 ont été mesurées pour les protons amides de l’Ub distale marquée au 15N dans le K48-diUb. Les barres d’erreur indiquent 1 S.D., et les résidus complètement élargis dans le complexe sont désignés par des étoiles

L’effet de surhausse nucléaire (NOE) indique la relation de distance (< 6 Å) entre les noyaux. De plus, une expérience RMN à demi filtrée au 13C peut fournir une NOE entre le proton lié au 12C et le proton lié au 13C, c’est-à-dire une relation de distance intermoléculaire. Nous avons obtenu des NOEs intermoléculaires entre Rpn13NTD et l’Ub proximale, entre Rpn13NTD et l’Ub distale, et entre Ub proximale et Ub distale (Figure supplémentaire. S8). De plus, nous avons conjugué une sonde paramagnétique maléimide-EDTA-Mn2+ au site E24C de l’Ub distal, et nous avons collecté une amélioration de relaxation paramagnétique (PRE) pour les protons amides du squelette de Rpn13NTD, en suivant le protocole établi22,35. Comme évalué soit par le rapport d’intensité maximale des spectres paramagnétiques par rapport aux spectres diamagnétiques, soit par le taux Γ2 d’amélioration de la relaxation transversale, les résidus Rpn13 30-42 et 101-106 présentent des PRES importants avec un élargissement sévère de la ligne (Fig. 3d, e). Nous avons également conjugué la sonde paramagnétique au site N25C de l’Ub proximale, et évalué le taux d’amélioration de la relaxation transversale Γ2 pour l’Ub distale (Fig. 3f). Des valeurs PRE importantes sont observées entre les deux sous-unités Ub du K48-diUb sans ligand, et l’addition de Rpn13NTD augmente les PREs inter-Ub mais avec un profil PRE similaire. Les expériences PRÉ RMN confirment ainsi que Rpn13NTD enrichit l’état compact préexistant du K48-diUb.

Pour affiner le Rpn13NTD:Structure complexe K48-diUb contre des contraintes expérimentales, nous avons réalisé un amarrage de corps rigide avec une liberté d’angle de torsion donnée aux résidus de liaison diUb et aux chaînes latérales des résidus interfaciaux. Pour les 20 conformères de plus basse énergie, l’écart quadratique moyen (RMS) pour les atomes lourds du squelette de tous les résidus rigides est de 0,86 ± 0,54 Å (Fig. supplémentaire. S9 et tableau S1). Les deux sous-unités Ub de K48-diUb restent associées dans la surface accessible du solvant d’enfouissement complexe (SASA) de ~1130 Å2. D’autre part, Rpn13NTD se coince en enterrant ~940 Å2 de SASA avec l’Ub proximal et ~1300 Å2 de SASA avec l’Ub distal (Fig. 4 bis). La structure complexe entre Rpn13NTD et Ub proximal du K48-diUb dans la présente étude est similaire à la structure complexe connue entre Rpn13NTD et le monomère Ub6,7, avec une différence efficace pour les atomes lourds du squelette de 2,17 ± 0,31 Å (Fig. supplémentaire. S10a). Fait intéressant, bien que les résidus hydrophobes L8, I44 et V70 de l’Ub proximale soient impliqués dans l’interaction avec Rpn13, les trois mêmes résidus de l’Ub distale sont enterrés dans l’interface Ub-Ub.

une structure du complexe Rpn13NTD: K48-diUb. La formation du complexe enterre des interfaces étendues entre les sous-unités. b Surfaces de potentiel électrostatique de Rpn13NTD et Ub distal de K48-diUb, tracées à l’échelle ± 3 kBT. Les résidus R104 dans Rpn13NTD et D39 dans Ub distal sont représentés sous forme de boules et de bâtons. la mutation d’inversion de charge c R104E dans Rpn13NTD provoque une diminution de 300 fois de l’affinité de liaison pour le K48-diUb, telle qu’évaluée par smFRET (cf. Fig. supplémentaire. S11). La valeur KD est signalée comme erreurs de meilleur ajustement ± ajustement. d Les analyses de Western blot montrent que la transfection du mutant Rpn13 R104E (avec un drapeau N-terminal) augmente la quantité globale de protéines polyUb liées à K48 dans la cellule. les viabilités cellulaires lors du choc thermique (par rapport aux cellules sans choc thermique) montrent que la transfection du mutant Rpn13 R104E, mais pas du type sauvage Rpn13, confère une thermotolérance. *P < 0,05, *** P < 0.001, pour contrôler les cellules du même groupe, test t non apparié; # #P < 0,01, # # #P < 0,001, pour les cellules non traitées avec choc thermique, ANOVA unidirectionnelle; & &P < 0.01, &&& P < 0,001, à cellules transfectées Rpn13 de type sauvage avec choc thermique, ANOVA unidirectionnelle

La structure du complexe Rpn13NTD: K48-diUb peut également être corroborée par des données de FRET à molécule unique. Sur la base de la structure complexe, nous avons modélisé les fluorophores à leurs sites de conjugaison en K48-diUb. La distance moyenne est de 43,2 ± 5.8 Å entre les centres géométriques des cycles aromatiques fluorophores, ce qui correspond à une efficacité théorique de FRET de 0,73 ± 0,13 (Fig. supplémentaire. S10b). Cette valeur est presque la même que l’efficacité du centre observée pour les espèces à frettes élevées (Fig. 1 bis).

Perturbation de Rpn13NTD: l’interaction Ub distale provoque une accumulation de protéines ubiquitinées dans la cellule

Dans la structure complexe entre Rpn13NTD et K48-diUb, l’interaction entre Rpn13NTD et l’Ub proximale est similaire à celle entre Rpn13NTD et le monomère Ub, comme indiqué précédemment (Fig. supplémentaire. S10a). Ainsi, nous avons conçu des expériences pour évaluer l’importance fonctionnelle de l’interaction entre Rpn13NTD et l’Ub distal de K48-diUb. De nombreux résidus chargés sont situés à l’interface entre Rpn13NTD et l’Ub distal de K48-diUb, et la force électrostatique peut donc jouer un rôle important pour stabiliser le complexe (Fig. 4b). Parmi eux, le résidu D39 dans l’Ub distal est proche du résidu R104 dans Rpn13. Nous avons ainsi muté le résidu R104 de Rpn13 en un glutamate, et titré le Rpn13NTD mutant en K48-diUb marqué au fluorophore. La protéine mutante enrichit les espèces à haute FRETTE de K48-diUb (Fig. S11). Cependant, l’affinité de liaison devient beaucoup plus faible. L’isotherme de liaison peut être ajusté à une valeur KD de 10,0 ± 3,3 µM, environ 300 fois plus faible que le Rpn13NTD de type sauvage (Fig. 4c). En tant que tel, l’association avec l’Ub distal est importante pour la reconnaissance spécifique entre Rpn13 et K48-diUb.

La diminution de l’affinité de liaison du mutant R104E nous a permis d’évaluer l’importance fonctionnelle de l’interaction entre Rpn13 et la chaîne Ub liée à K48. La transfection transitoire de Rpn13 de type sauvage augmente légèrement la quantité de protéines polyUb liées à K48 (Fig. 4d). Il est possible que, lors de la transfection de Rpn13, une quantité excessive de Rpn13 libre soit en compétition pour se lier aux protéines polyUb liées à K48 avec le Rpn13 associé au protéasome, rendant ainsi le recrutement de protéines de substrat ubiquitinées au protéasome moins efficace. D’autre part, la transfection du mutant Rpn13 R104E augmente considérablement la quantité de protéines polyUb liées à K48, par rapport aux cellules transfectées avec le type sauvage Rpn13 (Fig. 4d). Comme témoin positif, nous avons incubé les cellules avec 1 µM de MG132, un puissant inhibiteur du protéasome 36. En raison du blocage de la dégradation des protéines labiles, l’addition de MG132 augmente considérablement la quantité de protéines polyUb liées à K48. Prise ensemble, la mutation R104E de Rpn13 peut conduire à l’accumulation de protéines de substrat ubiquitinées. Cela peut être attribué à une interaction plus faible entre le mutant Rpn13 associé au protéasome et le K48-diUb et le K48-poyUb.

Le choc thermique peut diminuer la viabilité cellulaire. Nous avons constaté qu’un choc thermique de 30 minutes à 43 ° C peut diminuer la viabilité des cellules HEK293 à 75%. Comme dans les rapports précédents36,37, nous avons également constaté que le traitement du MG132 a un effet protecteur sur la survie des cellules lors d’un choc thermique, la viabilité des cellules étant réduite à ~ 90% (Fig. 4e). En effet, MG132 inhibe la dégradation protéasomale, rendant les protéines de choc thermique autrement à vie courte plus disponibles (Fig. 4d). Nous avons également mesuré la viabilité de cellules choquées par la chaleur transfectées avec du Rpn13 de type sauvage, et n’avons trouvé aucune différence significative par rapport aux cellules témoins sans transfection de Rpn13. D’autre part, la viabilité cellulaire des cellules transfectées Rpn13 R104E a diminué à ~ 83% lors du choc thermique, ce qui est significativement plus élevé que celui des cellules témoins et des cellules transfectées avec du Rpn13 de type sauvage (Fig. 4e). Cela implique que le mutant Rpn13 a un effet protecteur sur la survie des cellules lors d’un choc thermique, similaire à l’effet de MG132. Pris ensemble, l’interaction entre Rpn13 et la chaîne Ub liée à K48 est essentielle pour la reconnaissance médiée par Rpn13 des protéines de substrat ubiquitinées par le protéasome, tandis qu’une mutation du point interfacial dans Rpn13 peut provoquer une accumulation de certaines protéines de substrat telles que des protéines de choc thermique et conférer une thermotolérance aux cellules transfectées.

Rpn13NTD : L’interaction K48-diUb peut être ciblée pour moduler la fonction Rpn13

Rpn13 est recrutée dynamiquement dans le protéasome via l’interaction entre Rpn13NTD et la queue C-terminale de Rpn27,13. La structure complexe indique ici que l’interface de liaison sur Rpn13NTD pour Rpn2 est proche mais ne se chevauche pas avec l’interface de liaison pour l’Ub distal de K48-diUb (Fig. 5 bis). Nous avons ainsi prémélangé les 16 derniers résidus de Rpn2 (Rpn2CTD) avec du Rpn13NTD ou avec du Rpn13 pleine longueur au rapport 1:1, et titré le complexe Rpn13NTD: Rpn2CTD en K48-diUb marqué au fluorophore. Le prémélange de Rpn2CTD a augmenté la valeur KD de Rpn13NTD: K48-diUb de 33,1 ± 6,9 nM (Fig. 1g) à 66,8 ± 13,9 nM (Fig. S12a-c et Fig. 5b), tout en diminuant la valeur KD de Rpn13: K48-diUb de 119 ± 24 nM (Fig. 1d) à 43,9 ± 12,8 nM (Fig. S12d-f et Fig. 5c). Ainsi, en fournissant les incertitudes de mesure, l’association de Rpn2CTD ne provoque que de faibles perturbations pour l’affinité de liaison entre Rpn13 et K48-diUb, ce qui peut également avoir à voir avec la présence de l’éditeur de liens et le domaine C-terminal de Rpn13.

a La surface de liaison de l’Ub distal de K48-diUb sur Rpn13NTD est adjacente à la surface de liaison de Rpn2CTD. Avec la structure complexe Rpn13NTD-Rpn2CTD (code PDB 5V1Y) superposée par Rpn13NTD, Rpn2CTD est représenté en dessin animé rouge. Le résidu Rpn13 K34 est proche de l’extrémité C de l’Ub distal (représenté en pointillés). des affinités de liaison b, c ont été obtenues à partir de titrages smFRET de Rpn13NTD équimolaire : Rpn2CTD ou Rpn13: Rpn2CTD à K48-diUb marqué au fluorophore. Les valeurs de KD sont signalées comme erreurs de meilleur ajustement ± ajustement. la liaison d du monomère Ub ancré au Rpn2 occupe probablement la même surface de liaison de l’Ub distal, provoquant le déplacement de ce dernier. e, f Les expériences de compétition smFRET, avec ajout supplémentaire de protéine de fusion Rpn2CTD-Ub de 150 pM, au mélange de Rpn13NTD de 200 nM ou de Rpn13 pleine longueur et de K48-diUb marqué au fluorophore de 150 pM (cf. Figure 1c et f). L’erreur indique 1 S.D. à partir de trois mesures indépendantes des populations de l’espèce smFRET

Rpn2 et Ub distal de K48-diUb occupent des surfaces voisines sur Rpn13NTD. Par conséquent, une protéine de fusion avec le monomère Ub ajouté à l’extrémité C de Rpn2CTD peut faire saillie et interférer avec l’interaction entre Rpn13NTD et l’Ub distale de K48-diUb (Fig. 5d). Comme nous l’avons montré, l’addition de Rpn13NTD à 200 nM augmente la population des espèces à frettes élevées de K48-diUb marquées au fluorophore à 150 pM à ~ 63% (Fig. 1f), alors que l’addition de monomère Ub ne peut pas concurrencer la liaison Rpn13NTD (Fig. 2c, d). Lorsque nous avons ajouté une protéine de fusion Rpn2CTD-Ub non étiquetée supplémentaire de 150 pM, la population d’espèces à fret élevé diminue de ~ 4% à ~ 59% (Fig. 5e). D’autre part, nous avons montré que l’addition de Rpn13 pleine longueur de 200 nM augmente la population des espèces à fret élevé de K48-diUb marqué au fluorophore à 150 pM à ~ 60% (Fig. 1c). L’ajout supplémentaire de la protéine de fusion Rpn2CTD-Ub non étiquetée de 150 pM diminue la population d’espèces à fret élevé de ~ 4,5 à ~ 55,5% (Fig. 5f). Notez que l’ajout d’un Ub à Rpn2CTD n’a presque aucun effet sur l’interaction entre Rpn2CTD et Rpn13NTD (Fig. supplémentaire. S13). Ainsi, nos données indiquent que les interfaces de liaison Rpn2 et K48-diUb sur Rpn13NTD sont proches l’une de l’autre. Plus important encore, l’Ub ancré au Rpn2 peut bloquer physiquement l’accès du diUb distal au Rpn13 et affaiblir l’interaction entre le K48-diUb et le Rpn13.