Enzyme PCR Haute Fidélité & Enzyme PCR Efficace: ADN polymérase de KOD
L’archée hyperthermophile Thermococcus kodakaraensis KOD1 (précédemment Pyrococcus kodakaraensis KOD1) (Fig. 1) a été isolé d’une source chaude solfatarique (Fig. 2) sur l’île de Kodakara (Fig. 3) au Japon, et a été identifié et caractérisé.
Une ADN polymérase de la famille B (ADN polymérase KOD) a été trouvée dans cette souche KOD1 et présente diverses propriétés uniques (1).
-
Fig. 1. Thermococcus kodakaraensis KOD1
-
Fig. 2. Solfatara (île de Kodakara, Japon)
-
Fig. 3. Île de Kodakara (préfecture de Kagoshima, Japon)
L’ADN polymérase de KOD présente une forte activité d’exonucléase 3’→5′ (activité de relecture), une activité qui manque à l’ADN polymérase de Taq.
De plus, cette enzyme présente une excellente processivité et une capacité d’élongation, montrant un taux d’extension cinq fois plus élevé (100-130 nucléotides /seconde) et une processivité 10-15 fois plus élevée (> 300 bases) que celle de Pyrococcus furiosus (Pfu ADN polymérase). Le taux d’élongation de cette enzyme est environ 2 fois supérieur à celui de l’ADN polymérase Taq (Tableau 1) (Fig. 4) (1).
Tableau 1. Propriétés des ADN polymérases thermostables
| Proterty | Valeur pour l’ADN polymérase indiquée | ||
|---|---|---|---|
| ADN polymérase de KOD | ADN polymérase de Pfu | ADN polymérase de Taq | |
| Origine | Archées | Archées | Bactéries |
| Masse moléculaire déduite (kDa) | 90.0 | 90.1 | 93.9 |
| Température optimale (ºC) | 75 | 75 | 75 |
| Ph optimal à 75ºC | 6.5 | 6.5 | 8.0-8.5 |
| Thermostabilité (demi-vie) | 95ºC, 12 h; 100oC, 3,0 h | 95ºC, 6 h; 100ºC, 2,9 h | 95ºC, 1.6h |
| 5’→3′ exonuclease activity | – | – | – |
| 3’→5′ exonuclease activity | + | + | – |
| Terminal transferase activity | – | – | – |
| Processivity (bases) | >300 | <20 | ND |
| Elongation rate (bases/s) | 106-138 | 25 | 61 |
Fig. 4. Comparaison des taux d’élongation de la Pfu KOD et de l’ADN polymérase Taq.
La vitesse d’élongation a été mesurée en fonction de la longueur de l’ADN synthétisé, en utilisant l’ADNSS M13 comme matrice à 75ºC.
Parallèlement à l’étude des activités de l’ADN polymérase KOD, des anticorps de neutralisation de la polymérase et des activités de relecture ont été développés (2). Ces anticorps peuvent être appliqués à la « technologie PCR à démarrage à chaud » en utilisant l’ADN polymérase de KOD.
La structure 3-D de l’ADN polymérase a été caractérisée en 2003 (Fig. 5) (3).
Fig. 5. Structure 3-D de l’ADN polymérase KOD
J. Mol. Biol., 306: 469-477 (2001)
KOD-Plus Prise des Paris
Tableau 2. Comparaison de la fréquence de mutation de chaque enzyme PCR.
| Bases totales Séquencées | Nombre de bases mutées | Fréquence de mutation (x10-5) | |
|---|---|---|---|
| KOD-Plus- | 145,753 | 5 | 3.4 |
| KOD FX | 144,535 | 19 | 13.1 |
| ADN polymérase Pfu | 113,080 | 12 | 10.6 |
| Enzyme longue PCR à base de Taq | 167,343 | 218 | 130.3 |
| Taq ADN polymérase | 102,708 | 145 | 141.2 |
La fidélité a été mesurée comme la fréquence de mutation par séquençage du produit PCR. Après clonage du produit PCR (2,4 kb de la région bêta-globine humaine), environ 96 clones ont été sélectionnés et séquencés.
KOD FX (Code No. KFX-101) a été développé sur la base de l’ADN polymérase de KOD et montre un taux de réussite PCR beaucoup plus élevé (basé sur l’efficacité et les capacités d’allongement) que KOD-Plus- (Code No. KOD-201) ou d’autres enzymes PCR à base de Taq. KOD FX est également efficace pour l’amplification à partir d’échantillons bruts (par exemple, lysat de queue de souris, cellules cultivées).
Fig. 6. Amplification directe à partir d’un lysat brut de queue de souris
1,2: KOD FX
3 ~ 6: Enzymes d’autres sociétés
M: Marqueurs
