Gènes Knock-down et Knock-out

Gène Knock-down
Cette technique permet de réduire l’expression d’un ou plusieurs d’un organisme. Cela peut se produire par modification génétique ou par traitement avec un agent aréolaire tel qu’un oligonucléotide court d’ADN ou d’ARN qui a une séquence complémentaire à un gène ou à un transcrit d’ARNm.
Si le changement d’expression génique est causé par un oligonucléotide lié à un ARNm ou se liant temporairement à un gène, cela entraîne un changement temporaire de l’expression génique qui ne modifie pas l’ADN chromosomique, et le résultat est appelé « knockdown transitoire ».
Lors d’un knockdown transitoire, la liaison de cet oligonucléotide à l’activégène ou à ses transcrits entraîne une diminution de l’expression. La liaison peut se produire par le blocage de la transcription, la dégradation du transcription de l’ARNm (par ex. ARNsi ou antisens dépendant de la RNase-H), ou par le blocage de la traduction de l’ARNm, des sites d’épissage pré-ARNm ou des sites de clivage des nucléases utilisés pour la maturation d’autres ARN fonctionnels, y compris les miARN (e.g.by morpholino oligos).
L’utilisation la plus directe des renversements transitoires est pour l’apprentissage d’un gène qui a été séquencé, mais a une fonction inconnue. Cette approche expérimentale est connue sous le nom de génétique inverse. Les renversements transitoires sont souvent utilisés en biologie du développement car des oligos peuvent être injectés dans des zygotes unicellulaires et seront présents dans les cellules filles de la cellule injectée.

L’interférence par ARN (ARNi) est un moyen de réduire les gènes au silence par voie de dégradation de l’ARNm. Le knockdownpar cette méthode est obtenue en introduisant de petits ARN interférents double brin (ARNSI) dans le cytoplasme. Une fois introduits dans la cellule, les exogenoussiRNAs sont traités par RISC. Le siRNA est complémentaire de l’ARNm cible à réduire au silence, et le RISC utilise le siRNA comme modèle pour localiser l’ARNm cible. Une fois le RISC localisé sur l’ARNm cible, l’ARN est clivé par une ribonucléase.
L’ARNi est utilisé pour l’analyse fonctionnelle génétique. L’utilisation de l’ARNi peut être utile pour identifier des cibles thérapeutiques potentielles, le développement de médicaments ou d’autres applications.

Knock-out des gènes
Geneknockout (KO) est une technique génétique dans laquelle l’un des gènes d’un organisme estfait inopérant. Les organismes knockout sont utilisés pour étudier la fonction génique, généralementen étudiant l’effet de la perte de gènes. Kos hétérozygote et homozygote: dans le premier, un seul allèle est assommé, dans le second, les deux allèles sont assommés.

La création dirigée d’un KO commence dans le tube à essai avec un plasmide, un chromosome artificiel bactérien ou une autre construction d’ADN, etprocède à la culture cellulaire. Les cellules sont transfectées avec le DNAconstruct. Souvent, l’objectif est de créer un animal transgénique qui ale gène altéré.
Dans l’affirmative, les cellules souches embryonnaires sont génétiquement transformées et insérées dans des embryons précoces. Les animaux qui en résultent avec le changement génétique dans leurs cellules germinales peuvent alors souvent passer le gène knockout à de futures générations.

La construction est conçue pour se recombiner avec le gène cible, ce qui se fait en incorporant des séquences du gène lui-même dans la construction.La recombinaison se produit alors dans la région de cette séquence à l’intérieur du gène, entraînant l’insertion d’une séquence étrangère pour perturber le gène.
Un knockout conditionnel permet la délétion du gène d’une manière tissulaire ou spécifique au temps. Ceci est fait en introduisant des sites loxP autour du gène. Ces séquences seront introduites dans la lignée germinale via le même mécanisme qu’aknock-out. Cette lignée germinale peut ensuite être croisée à une autre lignée germinale contenant une Cre-recombinase qui est une enzyme virale capable de reconnaître ces séquences, de les recombiner et de supprimer le gène flanqué de ces sites.
Comme la recombinaison de l’ADN est un événement rare, la séquence étrangère choisie pour l’insertion comprend généralement un rapporteur. Cela permet une sélection facile des cellules ou des individus dans lesquels le knockout a réussi. Parfois, le DNAconstruit s’insère dans un chromosome sans la combinaison homologue souhaitée avec le gène cible.

(Ivana Venezia)

KNOCKDOWN
C’est une technique par laquelle l’expression d’un gène est réduite. Cette réduction peut résulter d’une modification de l’ADN ou d’un oligonucléotide se liant soit à l’ARNm, soit au gène. Dans ce cas, le changement d’expression est temporaire, alors nousparlez de knockdown transitoire.
Une des techniques permettant le knockdown transitoire d’un gène consiste à utiliser des oligomères Morpholino. Ils sont devenus un outil de knockdown standard dans les systèmes embryonnaires animaux, de sorte que les Morpholinooligos sont souvent utilisés pour étudier le rôle d’un transcrit d’ARNm spécifique dans un embryon. Sa structure moléculaire a des bases d’ADN attachées à un squelette de cycles méthylènémorpholine liés par des groupes phosphorodiamidate. Les morpholinos bloquent l’accès d’autres molécules à de petites séquences spécifiques (~25 bases) des surfaces d’appariement de bases de l’acide ribonucléique (ARN). En raison de leurs dorsales complètement non naturelles, les Morpholinos ne sont pas reconnus par les protéines cellulaires. Les nucléases ne dégradent pas les Morpholinos, ni ne sont dégradées dans le sérum ou dans les cellules. Il n’y a pas de rapports publiés de Morpholinos activant des récepteurs de type toll ou des réponses immunitaires innées telles que l’induction d’interféron ou la réponse inflammatoire médiée par NF-kB.Les morpholinos ne sont pas connus pour modifier la méthylation de l’ADN.
Les morpholinos ne déclenchent pas la dégradation de leurs molécules d’ARN cibles, contrairement à de nombreux types structuraux antisens (par exemple, les phosphorothioates, les ARNSI). Au lieu de cela, Morpholinosact par « blocage stérique », se liant à une séquence cible dans un ARN, inhibant les molécules qui pourraient autrement interagir avec l’ARN.
Les Morpholinos peuvent également modifier l’épissage du pré-ARNm ou inhiber la thématuration et l’activité du miARN.
Blocage de la traduction
Liés à la région 5′-non traduite de l’ARN messager (ARNm), les Morpholinos peuvent interférer avec la progression du complexe d’initiation ribosomique de la coiffe 5′ vers le codon de départ. Ceci empêche la traduction de la région de codage de la transcription ciblée (appelée « knocking down » geneexpression). Ceci est utile expérimentalement lorsqu’un investigateur souhaite connaître la fonction d’une protéine particulière; Les morpholinos fournissent un moyen pratique d’abattre l’expression de la protéine et d’apprendre comment ce renversement modifie les cellules ou l’organisme.
Modification de l’épissage de pré-ARNm
Les Morpholinoscan peuvent interférer avec les étapes de traitement de pré-ARNm soit en empêchant les petits complexes de ribonucléoprotéines nucléaires (snRNP) de se lier à leurs cibles aux frontières des introns sur un brin de pré-ARNm, soit en bloquant la base d’adénine nucléophile et en l’empêchant de former la structure de lariat d’épissure, soit en interférant avec la liaison de protéines régulatrices d’épissure telles que les silencieux d’épissure et l’épissure renforceurs. La prévention de la liaison du snRNP U1 (au site donneur) ou U2 / U5 (au site accepteur et à la partie polypyrimidine) peut provoquer un épissage modifié, excluant généralement les exons de l’ARNm naturel. Le ciblage de certaines cibles d’épissure entraîne des inclusions d’introns, tandis que l’activation de sites d’épissure cryptiques peut entraîner des inclusions partielles ou des exclusions.Les cibles des SNRNP U11/U12 peuvent également être bloquées. La modification de l’épissure peut être systématiquement dosée par réaction en chaîne par polymérase à transcriptase inverse (RT-PCR) et est considérée comme un changement de bande après électrophorèse sur gel des produits RT-PCR.
KNOCKOUT
Une variante du knockout génétique traditionnel est le knockout génétique conditionnel.
L’élimination conditionnelle du gène est une technique utilisée pour éliminer le gène aspécifique dans un certain tissu, tel que le foie. Cette technique est utileétudier le rôle des gènes individuels dans les organismes vivants. Il diffère de l’élimination génétique traditionnelle car il cible des gènes spécifiques à des moments spécifiques plutôt que d’être supprimé dès le début de la vie. L’utilisation de la technique de blocage de gènes conditionnel élimine de nombreux effets secondaires de l’élimination traditionnelle des gènes. Dans le knockout génétique traditionnel, la mort embryonnaire d’une mutation génétique peut survenir, ce qui empêche les scientifiques d’étudier le gène dansles adultes. Certains tissus ne peuvent pas être étudiés correctement isolément, le gène doit donc être inactif dans un certain tissu tout en restant actif dans d’autres. Avec cette technologie, les scientifiques sont capables d’éliminer les gènes à un stade spécifique du développement et d’étudier comment l’élimination d’un gène dans un tissu affecte le même gène dans d’autres tissus.
La technique la plus couramment utilisée est le système de recombinaison Cre-lox. L’enzyme de recombinase Cre reconnaît spécifiquement les sites deuxolox (loci de recombinaison) dans l’ADN et provoque une recombinaison entre eux. Cette recombinaison provoquera une délétion ou une inversion des gènes entre les deux sites lox, en fonction de leur orientation. Le gène Anentire peut être retiré ou inactivé. Tout ce système est inductible, de sorte qu’un produit chimique peut être ajouté pour éliminer les gènes à un moment précis. Deux des produits chimiques les plus couramment utilisés sont la tétracycline, qui active la transcription du gène de la recombinase et le tamoxifène, qui active le transport de la protéine crérécombinase vers le noyau. Seuls quelques types de cellules expriment la crérécombinase et aucune cellule de mammifère ne l’exprime, il n’y a donc aucun risque d’activation accidentelle des sites lox lors de l’utilisation du knockout génétique conditionnel chez les mammifères.
Une souris contenant le gène Cre et une souris contenant les séquences loxP sont élevées pour générer un knockout conditionnel pour un gène particulier d’intérêt. Les souris n’expriment pas naturellement de Cre recombinase ou de loxsites, mais elles ont été conçues pour exprimer ces produits géniques afin de créer la progéniture souhaitable. Il faut obtenir une souris dans laquelle un exon important est floxé (cela signifie qu’il a aLox-P en amont et en aval) et une souris qui a une séquence Cre dont l’expression est régulée par un promoteur spécifique du type cellulaire ou un promoteur inductible. Ensuite, vous croisez ces souris et vous obtenez une souris chez laquelle les cellules non exprimant le Cre auront le gène ayant une fonction normale, tandis que les cellules exprimant le Cre auront une fonction génique perturbée dans la partie entre Lox-P.
(Francesca Luca)

Mécanisme d’interférence d’ARN

L’interférence d’ARN (ARNi), une réponse antivirale cellulaire ancienne, est un mécanisme naturel pour réduire au silence l’expression génétique. Il peut être exploité pour permettre une inhibition spécifique de la fonction de tout gène cible. L’ARNi s’avère être un outil de recherche inestimable, il aide à l’identification de nouveaux gènes impliqués dans les processus pathologiques.

L’ARNi n’est pas le seul mécanisme d’expression génique du silençage (tableau 1).

Tableau 1: Comparaison entre différentes méthodes de silençage génique.

L’interférence d’ARN (ARNi) se produit en réponse à l’introduction d’ARN double brin (ARND) dans une cellule. L’introduction de l’ARND déclenche l’activation de la protéine kinase-R dépendante de l’ARND (PKR). La PKR activée phosphoryle le facteur d’initiation de la translation EIF2: cet effet, associé à l’activationde la Rnase-L et à l’induction de la production d’interféron, arrête la synthèse des protéines et favorise l’apoptose. Dans l’ensemble, on pense que cela représente un mécanisme antiviral de défense. Les ARNI sont un mécanisme hautement conservé dans toutes les espèces taxonomiques. En plus d’avoir une activité antivirale, on pense également que l’ARNi supprime l’expression de segments potentiellement nocifs du génome, tels que les transposons, qui pourraient déstabiliser le génome en agissant comme mutagènes insertionnels.

Bien que ses mécanismes ne soient pas complètement élucidés, l’ARNi représente le résultat d’un processus en plusieurs étapes (Figure 1). En entrant dans la cellule, les ARND longs sontpremier traité par l’enzyme RNase III Dicer. Ce dimère fonctionnel contient les domaines helicase, liaison dsRNA et PAZ (leurs rôles ne sont pas complètement élucidés). Dicer produit des fragments d’ARND de 21 à 23 nucléotides avec deux porte-à-faux d’extrémité 3′ du nucléotide, c’est-à-dire des ARNSI. L’ARNi est médié par le complexe de silençage induit par l’ARN (RISC) qui, guidé par l’ARNsi, reconnaît l’ARNm contenant une séquence homologue à l’ARNsi et clive l’ARNm sur un site situé environ au milieu de la région homologue. Ainsi, l’expression génique estpécifiquement inactivée au niveau post-transcriptionnel.

En C. elegans, Dicer a été montrépour interagir avec les protéines rde. Les protéines rde se lient au dsRNA long et arebelieved pour présenter le dsRNA long au Dicer pour le traitement. Il a été rapporté que des mutants présentant un degré élevé de résistance à l’ARNi possédaient des loci de mutations atrde-1 et rde-4.

Figure 1: Mécanisme de RNAinterference

L’apparition d’ARN à double bande (ds) au sein d’une cellule (par ex. à la suite d’une infection virale) déclenche une réponse complexe, qui comprend entre autres phénomènes (par ex.la production d’interféron et ses conséquences) une cascade d’événements moléculaires connuscomme ARNi. Au cours de l’ARNi, le Dicère de l’enzyme cellulaire se lie au dsRNA et se divise en morceaux courts d’environ 20 paires de nucléotides de longueur connus sous le nom d’ARN interférent de petite taille (ARNSI). Ces paires d’ARN se lient à l’enzyme cellulaire appelée complexe de silençage induit par l’ARN (RISC) qui utilise un brin de l’ARNSI pour lier des molécules d’ARN simple brin (c’est-à-dire ARNm) de séquence complémentaire. L’activité nucléasique du RISC dégrade alors l’ARNm, réduisant ainsi au silence l’expression du gène viral. De même, on pense que la machinerie génétique des cellules permet de tiliser l’ARNi pour contrôler l’expression de l’ARNm endogène, ajoutant ainsi une nouvelle couche de régulation post-transciptionnelle. L’ARNi peut être exploité dans des contextes expérimentaux pour abattre des gènes cibles d’intérêt avec une technologie hautement spécifique et relativement facile (voir le texte pour plus de détails).

Outre le génésilençage, l’ARNi pourrait être impliqué dans d’autres phénomènes de régulation des gènes.. Il semble que l’ARNi peut également fonctionner en méthylant les cytosines ainsi que les séquences CPG plus classiquement associées à la méthylation. Si la séquence cible partage l’homologie avec un promoteur, un silençage transcriptionnel peut se produire par viaméthylation. De plus, l’ARN semble interagir avec les domaines de la chromatine, ce qui peut finalement diriger la méthylation de l’ADN. Des études sur C. elegans ont montré que les ARN peuvent se propager parmi les cellules par des mécanismes qui peuvent ne pas dépendre de l’ARNSI.Le locus systémique déficient en interférence d’ARN (sid), sid-1, code une protéine conservée avec une séquence peptidique signal et 11 domaines transmembranaires putatifs, ce qui suggère que la protéine sid-1 peut agir comme un canal pour un ARND long, un ARNsi ou un signal lié à l’ARNi actuellement non découvert. Les mutants Sid-1 retiennent l’ARNi autonome de la cellule mais ne parviennent pas à montrer la propagation de l’ARNi. Il n’est pas clair si cet ARNi systémique se produit chez les mammifères, bien qu’une forte similitude soit rapportée entre sid-1 et les protéines prédites de l’homme et de la souris.

(Justine Floret)

Source : https://translational-medicine.biomedcentral.com/articles/10.1186/1479-5876-2-39#Sec3

lang = »en-gb » xml:lang = » en-fr »>

ZFN, TALEN, CRIPR/CAS9

Ces trois technologies moléculaires permettent d’éditer le génome de manière spécifique au site, chaque technique ayant un mécanisme différent. Les nucléases à doigts de zinc (ZFNs) et les nucléases effectrices de type activateur de transcription (TALENs) sont des nucléases chimériques composées de modules programmables de liaison à l’ADN spécifiques à une séquence liés à un domaine de clivage de l’ADN non spécifique. Les ZFN et les TALENs permettent un large éventail de modifications génétiques en induisant des ruptures à double brin d’ADN qui stimulent une jonction d’extrémité non homologue sujette aux erreurs ou une réparation dirigée par homologie à des emplacements génomiques spécifiques.

Image tirée de http://gentaur-italy.com/prodotti/talen-un-sistema-semplice-e-veloce-per-gene-knockout/

La polyvalence des ZFN et des TALENs provient de la capacité de personnaliser le domaine de liaison à l’ADN pour reconnaître pratiquement n’importe quelle séquence. Ces modules de liaison à l’ADN peuvent être combinés à de nombreux domaines effecteurs pour influer sur la structure et la fonction génomiques, notamment les nucléases, les activateurs et répresseurs transcriptionnels, les recombinases, les transposases, les histones méthyltransférases de l’ADN et les histones acétyltransférases. Ainsi, la capacité d’exécuter avec succès des altérations génétiques dépend en grande partie de la spécificité et de l’affinité de liaison à l’ADN des protéines de zinc-doigt et de TALE conçues.

Protéines du doigt de zinc Cys2-His2

Le domaine du doigt de zinc Cys2-His2 est l’un des types les plus courants de motifs de liaison à l’ADN trouvés chez les eucaryotes et représente le deuxième domaine protéique le plus fréquemment codé dans le génome humain. Un doigt de zinc individuel est constitué d’environ 30 acides aminés dans une configuration ββα conservée. Plusieurs acides aminés à la surface de l’hélice α entrent généralement en contact avec trois paires de bases dans le sillon principal de l’ADN, avec différents niveaux de sélectivité. La structure modulaire des protéines à doigts de zinc en a fait un cadre attrayant pour la conception de protéines de liaison à l’ADN personnalisées. La clé de l’application des protéines à doigts de zinc pour la reconnaissance spécifique de l’ADN a été le développement de réseaux non naturels contenant plus de trois domaines à doigts de zinc. Cette avancée a été facilitée par la découverte basée sur la structure d’une séquence de lieurs hautement conservée qui a permis la construction de protéines synthétiques à doigts de zinc qui reconnaissaient des séquences d’ADN de 9 à 18 bps de longueur. Étant donné que 18 pb de séquence d’ADN peuvent conférer une spécificité à moins de 68 milliards de pb d’ADN, cette méthode a permis de cibler des séquences spécifiques dans le génome humain pour la première fois.

Les effecteurs de type activateur de transcription

TALEs sont des protéines naturelles du genre de bactéries phytopathogènes Xanthomonas et contiennent des domaines de liaison à l’ADN composés d’une série de 33 à 35 domaines de répétition d’acides aminés qui reconnaissent chacun une seule pa. La spécificité de TALE est déterminée par deux acides aminés hypervariables qui sont connus sous le nom de diresidues à variables répétées (RVD). Comme les doigts de zinc, les répétitions de CONTES modulaires sont liées entre elles pour reconnaître les séquences d’ADN contiguës. Cependant, contrairement aux protéines à doigts de zinc, il n’y avait pas de réingénierie de la liaison entre les répétitions nécessaire pour construire de longs réseaux d’histoires avec la capacité d’aborder théoriquement des sites uniques dans le génome. En plus de leur rôle dans la facilitation de la HDR (recombinaison directe homologue), les nucléases spécifiques au site permettent également la génération rapide de lignées cellulaires et d’organismes avec des phénotypes nuls; La réparation médiée par le NHEJ d’un DSB induit par la nucléase conduit à l’introduction de petites insertions ou délétions au site ciblé, entraînant l’élimination de la fonction génique via des mutations par décalage de trame.

Image tirée de http://www.anim.med.kyoto-u.ac.jp/gma/nucleases.aspx

Distincte des nucléases spécifiques au site décrites ci-dessus, le système CRISPR (Clustered Regulatory Interspaced Short Palindromic Repeats) / CRISPR-associated (Cas) est récemment apparu comme une alternative potentiellement facile et efficace aux ZFN et TALENs pour induire des altérations génétiques ciblées. Chez les bactéries, le système CRISPR offre une immunité acquise contre l’invasion d’ADN étranger via un clivage de l’ADN guidé par l’ARN. Dans le système CRISPR/Cas de type II, de courts segments d’ADN étranger, appelés « espaceurs », sont intégrés dans les locus génomiques CRISPR et transcrits et transformés en ARN CRISPR courts (ARNCR). Ces ARNCR se recoivent en ARNCR activant la transactivité (ARNCRR) et dirigent le clivage spécifique de la séquence et le silençage de l’ADN pathogène par les protéines Cas. Des travaux récents ont montré que la reconnaissance de la cible par la protéine Cas9 nécessite une séquence « graine » au sein de l’arNCR et une séquence de motifs adjacents protospacer (PAM) contenant des dinucléotides conservés en amont de la région de liaison à l’arNCR. Le système CRISPR/Cas peut ainsi être re-ciblé pour cliver pratiquement n’importe quelle séquence d’ADN en repensant l’ARNCR. De manière significative, il a été démontré que le système CRISPR/Cas est directement portable pour les cellules humaines par co-administration de plasmides exprimant l’endonucléase Cas9 et les composants nécessaires de l’ARNCR.

Image tirée de https://www.computescotland.com/crisprcas9-genome-editing-8111.php