L’ARN total a été extrait à l’aide du Réactif d’isolement Tripure (Roche).
Des échantillons d’ARN ont été traités avec du DNaseI sans RNase et purifiés à l’aide du Mini Kit RNeasy (QIAGEN). L’ARN résultant a été appauvri en ARN ribosomique en utilisant le Kit d’élimination de l’ARNr Ribo-Zéro (Humain / Souris / Rat) (Épicentre). L’ARN appauvri en ARNr a été utilisé pour synthétiser l’ADNc du premier brin à l’aide du Système de Synthèse du Premier brin SuperScript® III (Invitrogen) selon les instructions du fabricant. Par la suite, le deuxième brin a été généré en utilisant l’ADN ligase d’E. coli (Invitrogen), E. l’ADN polymérase de coli (Invitrogen) et le dUTP, le dCTP, le dATP et le dGTP se fixent (10 µmol chacun, Promega) dans le Tampon du Deuxième Brin (Invitrogen). Ensuite, les ADNc ont été cisaillés avec des Covaris à environ 300 bp. Après fragmentation, les échantillons ont été purifiés avec des colonnes de MinÉlute (Qiagen). Et les extrémités saillantes 3′ et 5′ des fragments ont été réparées à l’aide de l’ADN polymérase T4 (NEB) et de l’ADN Polynucléotide kinase T4 (NEB) dans du tampon ADN ligase T4 (NEB). Ensuite, les extrémités dA ont été générées en utilisant le fragment de Klenow (3′- > 5′ exo-, NEB), dans le tampon 2 (NEB). Les réactions de ligature des adaptateurs ont ensuite été mises en place à l’aide d’adaptateurs indexés et de Ligase rapide (NEB). Les produits ont été utilisés comme modèle pour le traitement par UNG (Fermentas) et l’amplification par PCR à l’aide de l’ADN Polymérase Haute fidélité (NEB) par Phusion. Les bibliothèques ont été visualisées sur des Gels d’Agarose à usage général E-Gel® à 2% (Invitrogen). Les bibliothèques à code-barres ont été séquencées sur une seule voie d’un HiSeq2500 (Illumina).
